Name: analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto, in parte, dal National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [concessione numero 1P20GM109005], il Consorzio Arkansas spazio di Grant attraverso National Aeronautics and Space Administration [codice di autorizzazione NNX15AK32A], e l&#39;Istituto nazionale per la sicurezza e la Salute (NIOSH) [codice di autorizzazione 2T420H008436]. Gli autori desiderano ringraziare Christopher Fettes per la correzione e la modifica di questo manoscritto.

1. Raccolta e preparazione delle particelle <ol><li> La calibrazione delle particelle campionatore ad alto volume totale sospeso <ol><li> Scollegare il motore campionatore dal controllore di flusso di massa e collegare il motore ad una sorgente di alimentazione CA stabile (figura 1). Nota: Un filtro non viene utilizzato durante questa procedura. </li><li> Montare l&#39;orifizio calibratore e piastra di adattamento di carico superiore al campionatore. Serrare l&#39;adattatore di carico dadi superiori hold-down in modo sicuro per evitare perdite d&#39;aria sono presenti. Lasciare che il motore campionatore di riscaldarsi fino alla sua normale temperatura di esercizio (circa 10-15 minuti). </li><li> Eseguire un test di tenuta coprendo i fori sulla parte superiore del rubinetto dell&#39;orifizio e la pressione sul foro con le mani. Ascoltate per un suono acuto stridio fatta da fuoriuscita dell&#39;aria. Se si sente questo suono, serra nuovamente le adattatori di carico dadi superiori hold-down come è presente una perdita. Se il suono è bassa, la perdita è vicino ad una delle altre guarnizioni in sysTEM. </li><li> Collegate un lato di un manometro ad acqua al rubinetto pressione sul lato del foro con un tubo a vuoto di gomma. Lasciare il lato opposto del manometro aperto all&#39;atmosfera. Tenere un manometro in verticale per garantire letture precise. Toccando retro del registratore flusso continuo contribuirà a centrare la penna e fornire letture precise. </li><li> Ripetere il passaggio 1.1.2 utilizzando cinque portate che rappresentano le portate che operano da 30 a 60 ft / min (circa ogni 5-6 ft 3 / min). Regolare la manopola sul orifizio variabile a cinque diverse posizioni e prendere cinque letture diverse. </li><li> Registrare la temperatura ambientale dell&#39;aria, pressione barometrica ambiente, numero di serie campionatore, numero di serie orifizio, pendenza orifizio e intercetta con ultima data di certificazione, la data, il luogo del sito, e le iniziali dell&#39;operatore sul foglio di calibrazione. </li></ol></li><li> Totale raccolta particelle del campione in sospensione e analisi gravimetrica <ol><li> avvolgere un8 filtri in fibra di quarzo &quot;x 10&quot; in due strati di fogli di alluminio. Posizionare il filtro avvolta nel forno e impostare la temperatura a 550 ° C. Cuocere il filtro per almeno 4 ore. Lasciare raffreddare il forno e recuperare il filtro. Posizionare il filtro in un essiccatore con CaCO3. </li><li> Pesare il filtro in una microbilancia con precisione di 10 mg. Ripetere la misurazione per tre volte nel corso di una giornata. misurazioni individuali devono essere all&#39;interno di 25 mcg. Se questo non è raggiunto, restituire il filtro avvolto in un essiccatore e ripetere il processo il giorno seguente. </li><li> Aprire il coperchio riparo (Figura 2). Rimuovere il filtro telaio titolare allentando i quattro dadi ad alette, consentendo i bulloni in ottone e rondelle ad oscillare verso il basso fuori strada. Aprire il filtro dal foglio di alluminio, e utilizzare pinze puliti per centrare attentamente, parte più ruvida up, sullo schermo di supporto. Allineare correttamente il filtro sullo schermo. </li><li> Posizionare la cornice dello schermo e fissarlo coni bulloni ottone e rondelle applicando pressione sufficiente a evitare perdite d&#39;aria ai bordi. Pulire ogni accumulo di polvere provenienti da tutto il supporto del filtro con un panno pulito. Chiudere il coperchio riparo con cura e fissarlo. </li><li> Assicurarsi che tutti i cavi siano collegati a loro appropriate prese recipiente e il tubo tra la presa di pressione motore del ventilatore e il registratore flusso continuo è collegato. </li><li> Preparare il registratore di flusso. Premere penna braccio sollevatore per sollevare punto di penna e inserire un nuovo grafico. Allineare la scheda del grafico per il mozzo del registratore e premere con il pollice per abbassare il centro grafico sul mozzo. Imposta ora facendo ruotare il mozzo in senso orario fino al momento corretto sul grafico è allineato con il puntatore indice temporale. </li><li> passare manualmente sul campionatore e iniziare la raccolta. Monitorare il registratore per assicurarsi che sia correttamente inchiostrazione e l&#39;indicatore del tempo trascorso per essere sicuri che funzioni correttamente. </li><li> Alla fine del periodo di campionamento, spegnere il campionatore, registrareil tempo trascorso e recuperare il grafico. Rimuovere il telaio per esporre il filtro. Rimuovere il filtro esposto dalla schermata di supporto tenendolo dolcemente alle estremità con la pinza. Piegare il filtro longitudinalmente in modo che tocchi campione campione due volte e avvolgerla in un foglio di alluminio originale. </li><li> Conservare il filtro in un essiccatore con CaCO 3 per almeno 24 ore prima della pesata. Ripetere il passo 1.2.2 per misurare il peso dei filtri dopo il prelievo. Posizionare il filtro in un sacchetto di plastica con cerniera e conservarla in -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol></li><li> Analisi di raccolta del campione sospesi totali di particelle <ol><li> Recupero del filtro memorizzato, aprire il foglio di alluminio e trasferire il filtro su una superficie pulita Teflon. Utilizzando pinze e bisturi, tagliare (bianco) esterno parte del filtro e smaltire. <ol><li> Quindi, tagliare il filtro in 0,5 &quot;x 0,5&quot; pezzi e pezzi in un pallone da 100 ml. Aggiungere 50 ml di acqua ultrapura. Porre il pallone in un ultrasuonobagno e ultrasuoni per 60 minuti a 33 ± 3 kHz. </li></ol></li><li> Estratto del filtro attraverso un 0,45 micron filtro in polipropilene siringa per 100 ml pallone da fondo. Evaporare l&#39;acqua usando uno strumento evaporatore rotante sotto pressione a 50 ° C fino a circa 5 ml di estratto rimane nel pallone. <ol><li> Evaporare l&#39;acqua residua in 15 ml pallone a pera di peso noto. Pesare il pallone con l&#39;estratto secco e registrare la massa dell&#39;estratto secco. </li></ol></li><li> Sciogliere il campione secco con 400 ml di D 2 O da sonicating per 15 minuti e trasferire in un tubo NMR standard di 5 mm. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 xg a temperatura ambiente per rimuovere qualsiasi questione non disciolto. </li><li> Ripetere con 300 ml di D 2 O. Aggiungere 10 ml di NaN 3 1,4% (conc finale .: 0,02% w / v) nel tubo NMR. Aggiungere 10 microlitri (32 ug) di polveri totali sospese (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) di D 2 O (concentrazione finale 0,258 mM) nel tubo NMR. </li><li>Acquisire 1 spettri H NMR utilizzando uno spettrometro NMR operante a 600,17 MHz. <ol><li> Inserire il tubo NMR nella cryoprobe tripla risonanza. Calibrare lo strumento nel seguente ordine: serratura, sintonia, lo spessore, la calibrazione lunghezza impulso a 90 ° e la regolazione guadagno del ricevitore. </li><li> Misurare spettri a 25 ° C con un 1 D sequenza di eccitazione scultura con 180 impulsi selettivi-acqua in modalità di rilevamento Quad digitale, 8.192 scansioni, 4 scansioni fittizi, larghezza spazzata di 8012,57 Hz, frequenza di offset per la soppressione del segnale dell&#39;acqua fissato a 4,70 ppm, 1,70 sec tempo di acquisizione, 32.768 punti di dati in tempo dominio (TD), 1 msec durata gradiente (P16), 100 msec ritardare il recupero dopo il gradiente (d16). </li></ol></li><li> Processo 1 H NMR spectra applicando un allargamento linea di 1 Hz e riempimento di zero per un fattore 2 (65.536 punti dati). Correggere la fase e linea di base manuale e integrare. Set TSP-d4 picco a 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> Esposizione 2. particelle<ol><li> Cultura istituito <ol><li> mezzi di crescita completo caldo contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina (100 U / ml), soluzione di tripsina 0,25% e magnesio calcio libero tampone fosfato salino (PBS) in un bagno d&#39;acqua (a 37 ° C) per almeno 30 minuti prima dell&#39;inizio della cultura. </li><li> Estrarre un pallone T75 dal 5% di CO 2 incubatore contenente cellule in coltura RAW264.7 e lavare le cellule con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte. </li><li> Staccare le cellule aderenti RAW264.7 dal fondo del recipiente di coltura tissutale con 1 ml di soluzione di pre-riscaldato tripsina seguite da raschiare. </li><li> Raccogliere le cellule dal recipiente di coltura tissutale e fare una sospensione singola cella pipettando ripetutamente. Contare il numero di cellule con trypan blu e la piastra ad una densità di 8.000 / cm 2 (500.000 cellule totali) in un tessuto coltura piatto 100 mm con supporti completa pre-riscaldato. Regolare volume di supporto a 10 ml per una concentrazione finale di 50.000 celluleper ml. NOTA: il doppio del numero di piastre se viene eseguita anche l&#39;analisi della metilazione del DNA. </li><li> Mettere le cellule RAW264.7 recente placcato indietro nel 5% di CO 2 incubatore a 37 ° C e permettono di collegare per 24 ore. </li><li> Anche in un armadio biosicurezza, risospendere le particelle filtrate. Ad esempio, diluire particelle ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in PBS sterile per una dose di trattamento 5 ug / ml e 5 mg / ml per una dose di trattamento 50 ug / ml. Le diluizioni possono essere preparate fino a mese in anticipo e conservati a -80 ° C. </li></ol></li><li> Il trattamento con particolato <ol><li> Estrarre le cellule dal 5% di CO 2 incubatore e visualizzate a 10 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito per la crescita cellulare, la morfologia delle cellule, la condizione della cultura, e la contaminazione. Si dovrebbe aspettare di avere almeno il 30% di cellule confluenti in questa fase. </li><li> Asetticamente, aspirare i media con una pipetta sterile e lavare il recipiente di coltura con 2 ml 37 ° C PBSdue volte per rimuovere completamente i mezzi di comunicazione e le cellule galleggianti o morti. </li><li> Aggiungere dosaggio predeterminato di particolato con mezzi freschi nei recipienti di coltura e incubare per tempo desiderato a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. In questo studio, il trattamento di cellule RAW264.7 con PM per 72 ore in parallelo all&#39;esposizione utilizzato per l&#39;analisi genotossico e epigenotoxic concorrente. NOTA: La citotossicità può influire negativamente sulla qualità delle analisi citogenetica. Pertanto, saggi aggiuntivi come citotossicità, metilazione del DNA, Western blotting, o analisi di espressione genica sono tipicamente eseguite su cellule trattate. Esporre le cellule come descritto e procedere con il test specifico desiderato. Gli utenti inesperti possono anche voler includere un controllo positivo, come metansulfonato metile per testare la loro capacità di rilevare CA. </li></ol></li></ol> 3. test citogenetico <ol><li> Il trattamento di arrestare le cellule in metafase <ol><li> Scaldare il Colcemid cosìluzione (10 ug / ml) in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. Pulire il coperchio con il 70% di alcool sotto un armadio biosicurezza per minimizzare il rischio di contaminazione </li><li> Rimuovere completamente i mezzi di comunicazione in modo asettico e lavare i recipienti di coltura con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte. </li><li> Aggiungere mezzi freschi pre-riscaldato (2 ml supporti / 10 6 celle) contenenti soluzione Colcemid (5 ml / ml) nel recipiente di coltura e incubare per 2 ore. </li></ol></li><li> la raccolta delle cellule <ol><li> soluzione tripsina caldo e PBS in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 37 ° C per 30 min. Da questo punto in poi, non vi è alcuna necessità di mantenere condizioni asettiche. </li><li> Rimuovere completamente i media, lavare i recipienti di coltura con 2 ml 37 ° C PBS per due volte, aggiungere il volume richiesto di soluzione pre-riscaldato tripsina (di solito 2 ml per 60 millimetri piatto cultura o pallone T25 e 4 ml per piatto 100 mm o pallone T75 ), e posizionare il recipiente di coltura nel 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 1 min. </li><li> Take il recipiente di coltura, staccare le cellule con un raschietto, e aggiungere 10 ml di PBS per fermare l&#39;azione tripsina. </li><li> Pipetta su e giù per almeno dieci volte per fare sospensione cellulare unico e le cellule di trasferimento in un 15 ml conica tubo fondo centrifuga. </li><li> sospensione cellulare Centrifugare a 400 xg per 5 min in un&#39;oscillazione fuori centrifuga a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con lievi colpetti, aggiungere 10 ml di PBS, e di nuovo centrifugare per cinque minuti. </li></ol></li><li> Trattamento ipotonico e la fissazione <ol><li> Pre-warm 0,075 M soluzione di cloruro di potassio in un bagnomaria a 37 ° C per almeno 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e lasciare circa 0,5 ml di PBS. </li><li> rompere delicatamente il pellet di cellule e rendere la sospensione singola cella utilizzando una pipetta P200. </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio goccia pre-riscaldato a goccia agitando delicatamente. </li><li> Incubare le cellule a ipotonica psoluzione di cloruro otassium a bagnomaria C 37 ° per 20 min. </li><li> Fai la soluzione acetomethanol fresco con l&#39;aggiunta di 3 parti metanolo con acido acetico glaciale 1-parte. Tenere questo fissativo appena preparato a temperatura ambiente. </li><li> Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 ml) di fissativo nel tubo e mescolare delicatamente la soluzione capovolgendo la provetta. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. A questo aumento delle dimensioni pellet cellulare palco, diventano biancastre e più visibile. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 4 ml di fissativo aperta e mantenerlo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante, e dare più due lavaggi con 4 ml di fissativo. </li></ol></li><li> Pulizia scivolo e preparazione diffusione metafase <ol><li> Immergere vetrini completamente in 10% di detergente liquido per 30 min. </li><li> Sciacquare i vetrini completamente in acqua fredda rubinetto aperto per 30 minuti. </li><li> Rinse vetrini tre volte con acqua distillata per rimuovere completamente il detersivo, immergere in acqua distillata, e conservare in frigorifero per uso futuro. NOTA: scivoli pulizia prima dell&#39;uso facilita uniformità di applicazione e aumenta la qualità metafase. </li><li> Goccia sospensione cellulare 10 microlitri sul vetrino bagnato freddo e lasciarlo all&#39;aria asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Colorazione e montaggio <ol><li> Preparare 50 ml di soluzione colorante Giemsa mescolando una parte della soluzione colorante Giemsa con una parte di PBS e versare in una vaschetta Coplin. </li><li> Immergere i vetrini nella soluzione colorante per 20 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata per rimuovere l&#39;eccesso macchia e immediatamente asciugare le diapositive utilizzando un asciugacapelli. </li><li> Lasciare le diapositive a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Applicare una sola goccia di mezzo di montaggio sul vetrino, inserire delicatamente un coprioggetto sul mezzo di montaggio, consentono il supporto di diffondere sul vetrino lentamente, e rimuovereil mezzo eccesso con un tovagliolo di carta. Lasciare che il vetrino montato ad asciugare per almeno 1 ora prima di spostare o la visualizzazione al microscopio per evitare movimenti del vetrino. Attenzione: è importante mettere il vetrino accuratamente senza formare eventuali bolle durante questa fase. L&#39;uso del calore eccessivo per rimuovere bolle non è raccomandato. </li></ol></li><li> Tipi osservazione al microscopio e di aberrazione <ol><li> Esaminare le CA strutturali in metafase si diffonde a ingrandimento 100X utilizzando un campo chiaro microscopio di buona qualità. </li><li> Segna almeno 50 a 100 metafase diffonde per ciascun gruppo di trattamento per i trattamenti che inducono un gran numero di CA. Per dimensioni dell&#39;effetto più piccoli, si consiglia l&#39;analisi di un massimo di 300 spread metafase. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

studio citogenetica o analisi microscopica dei numeri o strutture di cromosomi, soprattutto in spread metafase, fornisce informazioni cruciali per la prognosi, la valutazione del rischio, e il trattamento per varie malattie. E &#39;ormai ben stabilito che le anomalie citogenetiche sono collegati con la progressione e lo sviluppo di diverse malattie, compreso il cancro. Fino ad oggi, le CA sono stati trovati in tutti i principali tipi di tumore. CA può sorgere spontaneamente o da entrambi gli stimoli esterni o interni, ...

E &#39;stato stimato che l&#39;esposizione al particolato (PM) fa sì che oltre 3 milioni di morti in eccesso ogni anno, soprattutto per malattie cardiopolmonari e cancro ai polmoni 1. Infatti, PM è stata riconosciuta come cancerogena per l&#39;uomo dall&#39;Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (Gruppo 1), come un aumento del rischio di cancro ai polmoni con l&#39;aumento dei livelli di esposizione al PM è stato indicato 2. È interessante notare che quasi tutte le cellule tumorali porto anomalie cromosomiche numeriche e / o strutturali. Particulate carbonio organico è una variante, complessa, e la miscela eterogenea, la cui composizione e distribuzione dimensione dipende emissioni nonché trasformazioni fisiche e chimiche. Esso rappresenta 35-55% del urbana PM 2,5 di massa (PM 2,5 micron di dimensione e più piccolo) e più del 60% del fondo rurale e continentale PM 2,5 di massa 3, 4. rappresenta la frazione solubile in acqua per 30-90% di aerosol organico. Un gran numero di composti organicisono stati identificati, compresi gli idrocarburi alifatici, idrocarburi policiclici aromatici, e loro derivati ​​ossigenati e nitrati, aldeidi alifatici e alcoli, acidi grassi liberi e loro sali, acidi di-carbossilici, composti multifunzionali, proteine ​​e macromolecole umiche-like (HULIS) utilizzando metodi cromatografici accoppiato con tecniche di spettrometria di massa 5-8. Questi composti rappresentano meno del 10-20% di carbonio organico particolato, quindi la maggior parte del carbonio organico è sconosciuto 9. Prove sperimentali suggeriscono che la citotossicità, stress ossidativo, e infiammazione sono coinvolti nello sviluppo di stati patologici PM-associati. Recentemente è stato dimostrato, tuttavia, che l&#39;esposizione a PM traduce anche in un certo numero di alterazioni epigenetiche, comprese le alterazioni nella metilazione del DNA di elementi ripetitivi, sia sperimentale sistemi in vitro ed in soggetti umani 10-12. Di particolare interesse sono gli effetti dellaPM DNA satellite - maggiori e minori satelliti - che si trovano nella regione heterochromatic attorno al centromero dei cromosomi. E &#39;stato dimostrato che questi effetti possono essere persistenti per natura, in quanto possono essere rilevati per almeno 72 ore dopo l&#39;esposizione 12. Alterazioni nella metilazione del DNA, in particolare intorno centromeri, possono portare ad accumulo di trascritti di mRNA DNA satellite, l&#39;integrità cromosomica compromesso durante la divisione cellulare e, successivamente, provocare lo sviluppo di una varietà di stati patologici 13. Adattamento di approccio per l&#39;analisi citogenetica di CA come end-point di alterazioni epigenetiche causati da PM, quindi, è di grande importanza. Qui, riportiamo l&#39;approccio per il PM di raccolta e preparazione ambiente, in esposizione in vitro e analisi delle CA utilizzando il sistema murino macrofagi modello RAW264.7. I macrofagi comprendono la prima linea di difesa contro i corpi estranei inalati e, di conseguenza, tla linea cellulare serve come stabilito e il modello più utilizzato in tossicologia particelle 11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

L&#39;esposizione al particolato (PM) è una delle principali preoccupazioni di salute mondo, che può danneggiare i vari componenti cellulari, tra cui il materiale genetico nucleare. Per valutare l&#39;impatto del PM sull&#39;integrità genetica nucleare, aberrazioni cromosomiche strutturali sono segnati degli spread metafase dei macrofagi del mouse RAW264.7. PM è raccolto da aria ambiente con particelle campionatore ad alto volume totale sospeso. Il materiale raccolto viene solubilizzato e filtrato per mantenere la porzione fini idrosolubile. Le particelle si caratterizzano per la composizione chimica mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Differenti concentrazioni di sospensione di particelle vengono aggiunti a una coltura in vitro di RAW264.7 macrofagi di topo per un tempo di esposizione di 72 ore, insieme con cellule di controllo non trattate. Alla fine dell&#39;esposizione, la coltura viene trattata con Colcemid di arrestare le cellule in metafase. Le cellule vengono quindi raccolte, trattate con soluzione ipotonica, fissato acetomethanol, dropped su vetrini e infine colorate con la soluzione Giemsa. I vetrini sono esaminati per valutare le aberrazioni strutturali cromosomiche (CA) in metafase propagarsi 1,000X ingrandimento utilizzando un microscopio in campo chiaro. 50 a 100 diffusione metafase vengono assegnati per ciascun gruppo di trattamento. Questa tecnica è adatta per la rivelazione di aberrazioni strutturali cromosomiche (CA), come ad esempio le pause cromatidio-tipo, gli scambi cromatidi-tipo, frammenti acentrici, cromosomi dicentrici e ad anello, doppie minuti, endoreduplicazione, e le traslocazioni robertsoniane in vitro dopo l&#39;esposizione a PM. Si tratta di un potente metodo per associare un endpoint citogenetica consolidata ad alterazioni epigenetiche.

Grande attenzione dovrebbe essere presa nella scelta della posizione del campionatore TSP, nonché il tempo dell&#39;anno in cui viene eseguita la raccolta. La composizione chimica e le dimensioni delle particelle possono influenzare notevolmente i risultati. Il materiale raccolto deve essere visibile contro il filtro bianco. Un normale del mouse metafase diffusione avrà 40 cromosomi acentrici. L&#39;obiettivo della tecnica è quello di dimostrare un cambiamento (o assenza) nella propor...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell&#39;aria ambiente.

L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente. 

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genetica

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Immunologia e infezioni

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Bioingegneria

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biologia

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Studio del danno al DNA con Checkpoint<em&gt; Xenopus</em&gt; Uovo Estratti

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

L'analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L'utilizzo di un

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Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla