iş Biyolojik Araştırma Mükemmellik [hibe sayısı 1P20GM109005], Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi [hibe sayısı NNX15AK32A] aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu Sağlığı Merkezi Ulusal Enstitüsü ve İş Güvenliği Ulusal Enstitüsü tarafından, kısmen, desteklenen Sağlık (NIOSH) [hibe sayısı 2T420H008436]. Yazarlar redaksiyon ve bu taslağın düzenlenmesi için Christopher Fettes teşekkür etmek istiyorum.

1. Parçacık Toplama ve Hazırlama <ol><li> Yüksek hacimli toplam asılı parçacıklar örnekleyici kalibrasyonu <ol><li> Kütle akış kontrol cihazından örnekleyici motoru kesin ve kararlı bir AC güç kaynağına (Şekil 1) motoru bağlayın. NOT: Bir filtre, bu işlem sırasında kullanılmaz. </li><li> örnekleyici kalibratör deliğini ve üstten yüklemeli adaptör plakasını monte edin. Hiçbir hava kaçağı mevcut olduğundan emin olmak için güvenli üstten yüklemeli adaptörü tutma somunlarını sıkın. örnekleyici motoru normal çalışma sıcaklığına (yaklaşık 10-15 dakika) kadar ısınmasını bekleyin. </li><li> elleriyle ağzına ağız ve basınç musluğu üstündeki delikleri kapatarak bir sızıntı testi yapıyoruz. havayı kaçan tarafından yapılan bir tiz squealing sesi dinleyin. Bu ses duyulur bir kaçak söz konusu olduğu gibi, üstten yüklemeli adaptör tutma somunları yeniden sıkın. Ses düşükse, kaçak sys diğer contalar birine yakın olduğutem. </li><li> Bir lastik vakum tüpü ile deliğin tarafındaki basınç musluğa su manometre bir tarafını bağlayın. atmosfere açık manometre karşı tarafını bırakın. doğru okuma sağlamak için dikey bir manometre tutun. sürekli akış kaydedici ters dokunulduğunda kalem ortalamak ve doğru okumalarını sağlamak için yardımcı olacaktır. </li><li> Adımı tekrarlayın / dk (yaklaşık olarak her 5-6 ft 3 / dak) 30 ila 60 ft faaliyet akış hızlarının temsil eden beş akış oranları kullanılarak 1.1.2. Beş farklı pozisyonlarda değişken ağzına düğmeyi ayarlayın ve beş farklı okumalara alır. </li><li> sertifikalı son tarih, tarih, site konumu ve kalibrasyon kağıda operatör baş harfleri ile ortam hava sıcaklığı, ortam barometrik basınç, örnekleyici seri numarası, delik seri numarası, delik eğimi ve kesişme kaydedin. </li></ol></li><li> Toplam askıda partiküller numune toplama ve gravimetrik analiz <ol><li> Wrap birAlüminyum folyo iki kat 8 &quot;x 10&quot; kuvars elyaf filtre. fırında sarılmış filtreyi yerleştirin ve 550 ° C&#39;de sıcaklığını ayarlamak. en az 4 saat süreyle filtreyi pişirin. fırın soğuması ve filtreyi almak. CaCO 3 desikatörde filtre yerleştirin. </li><li> 10 ug hassasiyetle bir mikro filtreyi tartılır. Bir gün boyunca ölçüm üç kez tekrarlayın. Bireysel ölçümler 25 mikrogram içinde olmalıdır. Bu elde değilse, desikatöre sarılmış filtreyi dönmek ve işlemini ertesi gün tekrarlayın. </li><li> Barınak kapağı (Şekil 2) açın. Dört kanat fındık gevşeterek pirinç civatalar ve contalar dışına aşağı salıncak izin vererek filtre tutucu çerçeveyi çıkarın. destekleyen ekranda, kaba yüzü yukarı, alüminyum folyo filtreyi açılmak ve dikkatle ortalamak için temizlenmiş forseps kullanabilir. Düzgün ekranda filtreyi hizalayın. </li><li> Ekranda çerçevesini yerleştirin ve sabitleyinyeterli basınç uygularken pirinç civatalar ve contalar kenarlarında hava sızıntısını önlemek için. temiz bir bezle filtre tutucu etrafında herhangi bir toz birikmesini silin. Yakın barınak kapağı dikkatli ve emniyete alın. </li><li> emin olun tüm kabloları bunların uygun priz yuvalarına takılı ve fan motoru basınç musluğu ve sürekli akış kaydedici arasında boru bağlanır. </li><li> Akış kaydedici hazırlayın. kalem noktasını yükseltmek ve yeni bir grafik eklemek için kalem kol kaldırıcı basınız. kaydedici sürücü göbeğine grafiğin sekmeyi hizalayın ve göbek üzerine grafik merkezini düşürmek için başparmak ile bastırın. grafikte doğru zaman zaman indeksi işaretçisi ile aynı hizaya gelene kadar sürücü hub saat yönünde çevirerek saati ayarlayın. </li><li> El ile örnekleyici açmak ve toplama başlar. doğru mürekkep ve geçen süre göstergesi düzgün çalıştığından emin olmak için emin olmak için kaydedici izleyin. </li><li> Örnekleme döneminin sonunda, örnekleyici, kayıt kapatmakgeçen süre ve grafik almak. Filtreyi ortaya çıkarmak için çerçeveyi çıkarın. forseps ile uçlarında hafifçe tutarak destek ekrandan maruz filtreyi kaldırmak. Bu örnek iki örnek dokunur, böylece uzunlamasına filtreyi katlayın ve orijinal alüminyum folyoya sarın. </li><li> Tartılmadan önce en az 24 saat boyunca CaCO 3 bir kurutucuda filtre saklayın. Adımı tekrarlayın 1.2.2 örnekleme sonra filtrelerin ağırlığını ölçmek için. zip plastik bir torba içinde filtreyi yerleştirin ve analize kadar -80 ° C saklayın. </li></ol></li><li> Toplanan toplam askıda partiküller numunenin analizi <ol><li> Saklanan filtre Al alüminyum folyo açılmak ve temiz bir teflon yüzeyi üzerinde filtre aktarın. forseps ve neşter kullanılarak, filtrenin dış (beyaz) bir bölümünü kesmek ve atınız. <ol><li> Daha sonra, 100 ml&#39;lik bir şişe içinde 0.5 &quot;x 0.5&quot; parçaları ve yeri parçaları filtre kesin. ultra saf su 50 ml ekleyin. Bir ultrason şişeyi koyunbanyo ve 33 ± 3 kHz 60 dakika sonikasyon. </li></ol></li><li> 100 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı şişe için 0.45 um polipropilen şırınga filtre ile filtre özü. ekstresi, yaklaşık 5 ml kadar 50 ° C&#39;de basınç altında rotavap aleti kullanarak suyu buharlaştırmak şişede kalmaktadır. <ol><li> ağırlığı bilinen bir 15 ml armut şekilli bir şişeyi, kalan su buharlaşır. Kuru ekstre ile balon tartılır ve kuru özüt kütlesini kaydedin. </li></ol></li><li> 15 dakika boyunca sonike ile D 2 O 400 ul kuru örnek çözülür ve 5 mm standart NMR tüpü içine aktarın. çözünmemiş maddeleri uzaklaştırmak üzere oda sıcaklığında 12.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> O. NaN 3% 1.4 10 ul (son kons .:% 0.02 w / v) NMR tüpü içinde ekleme D2 300 ul ile tekrarlayın. NMR tüpü içinde D 2 O (nihai konsantrasyon 0.258 mM) toplam asılı parçacıklar (TSP)-d4 (3.2 mg / ml) 10 ul (32 ug) ekleyin. </li><li>600,17 MHz&#39;de çalışan bir NMR spektrometresi kullanılarak 1H NMR spektrumları elde edin. <ol><li> üçlü rezonans kriyoprob içine NMR tüpü yerleştirin. aşağıdaki sırayla enstrüman kalibre: kilidi, melodi, dolgu, 90 ° darbe uzunluğu kalibrasyon ve alıcı kazanç ayarı. </li><li> Dijital Dört algılama modunda 180 suda seçici pulsları, 8.192 taramaları 4 yapay taramaları, 8012,57 Hz tarama genişliği ile bir 1 D uyarım şekillendirici sekansı ile 25 ° C &#39;de spektrumunu ölçmek, frekans 4.70 ppm&#39;de ayarlanmıştır su sinyal bastırılması, 1.70 için ofset sn kazanım süresi, 32.768 time domain veri noktaları (TD), 1 msn süre gradyan (p16), gradyan (D16) sonra 100 mikro-sn kurtarma gecikme. </li></ol></li><li> Proses 1 2 (65,536 veri noktaları) içindeki bir faktör ile, 1 Hz ve sıfır dolgulu bir hat genişletmesi uygulanarak NMR spektrumları. elle faz ve taban çizgisini düzeltin ve entegre. 0.0 ppm TSP-d4 zirve ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2. Parçacık Pozlama<ol><li> Kültür kurmak <ol><li> (37 ° C&#39;de),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin çözeltisi (100 U / ml),% 0.25 tripsin solüsyonu ve kalsiyum, magnezyum içermeyen fosfat tamponu tuz, bir su banyosu içinde (PBS) ihtiva eden sıcak bir tam büyüme ortamı için kültür başlamadan önce en az 30 dakika. </li><li> Kültürlenmiş RAW264.7 hücreleri ihtiva eden bir% 5 CO2 inkübatör T75 şişesi çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez 2 ml hücreleri yıkayın. </li><li> kazınarak ardından önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi 1 ml kullanılarak doku kültürü kabının altından yapışkan RAW264.7 hücreleri çıkarmak. </li><li> Doku kültürü kabı hücreleri toplamak ve tekrar pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile 100 mm doku kültürü çanağı içinde 8.000 N / cm2 (toplam 500.000 hücre) bir yoğunlukta tripan mavi ve plaka hücre sayısı. 50,000 hücrelik nihai konsantrasyonda 10 ml&#39;lik Ortam ses seviyesini ayarlamaml başına. NOT: DNA metilasyonu analizi de yapılır eğer plakaların sayısını ikiye katlayın. </li><li> 37 ° C de geri CO2 inkübatör% 5 yeni kaplama RAW264.7 hücreleri yerleştirin ve 24 saat boyunca eklemesini sağlar. </li><li> Ayrıca biyogüvenlik kabini, süzülmüş parçacıkların tekrar süspansiyon. Örneğin, bir 5 ug / ml bir tedavi dozu için steril PBS içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda parçacıkları seyreltilmesi ve 5 mg / 50 ug / ml bir tedavi dozu için ml&#39;de. Dilüsyonlar önceden aya kadar hazırlanır ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Parçacık madde ile muamele <ol><li> % 5 CO 2 inkübatör hücreleri almak ve hücre büyümesi, hücre morfolojisi, kültür durumuna ve kirlenme ters bir mikroskop kullanılarak 10x büyütme altında kontrol edin. Bir bu aşamada en az% 30 konfluent hücrelere sahip beklemesin. </li><li> Aseptik, sterilize pipet kullanarak medya aspire ve 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarı yıkayınİki kez tamamen medya ve yüzen veya ölü hücreleri çıkarmak için. </li><li> Kültür damarlarda taze ortam parçacıklı maddenin önceden belirlenmiş doz ekleyin ve CO2 inkübatör% 5 37 ° C&#39;de, istenen bir süre için inkübe edilir. Bu çalışmada, eş zamanlı genotoksik ve epigenotoxic analiz için kullanılan pozlama paralel 72 saat PM ile RAW264.7 hücreleri tedavi. NOT: Sitotoksisite olumsuz sitogenetik analiz kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, sitotoksisite, DNA metilasyonu, Western blotting ya da gen ekspresyon analizi gibi ek deneyler tipik haliyle muamele edilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. tarif edildiği gibi hücreler ortaya çıkarmak ve istenen spesifik deney devam edin. Deneyimsiz kullanıcılar, aynı zamanda CA&#39;larını tespit yeteneklerini test etmek için metil metansülfonat gibi bir pozitif kontrol eklemek isteyebilirsiniz. </li></ol></li></ol> 3. Sitogenetik Testi <ol><li> Tedavi metafaz hücrelerin tutuklamak için <ol><li> böylece colcemid ısıtındökülmesinden 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde (10 ug / ml). kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyogüvenlik kabini altında% 70 alkol ile silin kapağı </li><li> Tamamen aseptik ortamı çıkarın ve 2 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez kültür damarları yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış taze ortam (2 mi ortam / 10 6 hücre), kültür kabı içinde colcemid çözeltisi (5 ul / ml) ihtiva eden ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol></li><li> hücre hasat <ol><li> bir su banyosunda ılık bir tripsin çözeltisi ve PBS, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tutuldu. Bundan böyle aşağıda aşama aseptik durumunu korumak için herhangi bir gerek yoktur. </li><li> Tamamen iki kez 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarları, yıkama ortamı çıkarın önceden ısıtılmış tripsin çözeltisinin gerekli hacim eklemek (genellikle 60 mm kültür çanağı veya T25 şişesi 2 ml ve 100 mm tabak veya T75 şişesinin 4 mi ) ve 1 dakika için 37 ° C &#39;de geri CO2 inkübatör% 5 kültür kabını yerleştirin. </li><li> Take dışarı kültür damarı, bir kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak ve tripsin eylemi durdurmak için PBS 10 ml ekleyin. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı, en az on kez 15 ml konik alt santrifüj tüpü içinde tek bir hücre süspansiyonu ve transfer hücreleri yapmak. </li><li> Oda sıcaklığında katlanırlar santrifüj içinde 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> Süpernatantı nazik dokunarak hücre pelet kırmak, PBS 10 ml ekleyin ve tekrar beş dakika süreyle santrifüj. </li></ol></li><li> Hipotonik tedavi ve sabitleme <ol><li> en az 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak 0.075 M potasyum klorür çözeltisi. </li><li> Hücre pelet bozmadan Süpernatantı ve PBS yaklaşık 0,5 ml bırakın. </li><li> Yavaşça hücre pelet kırmak ve bir P200 pipet kullanarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> hafifçe çalkalanarak damla önceden ısıtılmış potasyum klorür solüsyonu damla 4 ml. </li><li> hipotonik p hücreleri inkübe20 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde otassium klorür çözeltisi. </li><li> 1-kısım buzlu asetik asit ile 3 parça metanol ilave taze acetomethanol çözeltisi olun. Oda sıcaklığında, bu yeni hazırlanmış fiksatif tutun. </li><li> hipotonik tedaviden sonra, tüp içinde sabitleyici eşit hacimde (4 mi) ekleme ve tüp hafifçe ters çevirerek çözelti karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. Bu aşamada hücre pelet boyutu artar, beyazımsı ve daha görünür hale gelir. </li><li> Süpernatantı, 4 ml taze fiksatif ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 4 ml fiksatif ile iki yıkar verir. </li></ol></li><li> Slayt temizleme ve metafaz yayılması hazırlığı <ol><li> 30 dakika boyunca tamamen% 10 sıvı deterjan, cam slaytlar daldırın. </li><li> 30 dakika süre ile akan soğuk musluk suyunda iyice slaytlar durulayın. </li><li> rinSE tamamen deterjanı çıkarmak damıtılmış suya batırın ve ileride kullanılmak üzere buzdolabında depolamak için damıtılmış su ile üç kez kaymaktadır. NOT: kullanım yayılma tekdüzelik kolaylaştırır ve metafaz kalitesini artırır önce slaytlar temizlenmesi. </li><li> soğutulmuş, ıslak slayt üzerinde 10 ul hücre süspansiyonu damla ve oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya hava sağlar. </li></ol></li><li> Boyama montaj <ol><li> PBS bir kısım Giemsa boyası çözeltisinin bir bölümü karıştırılarak 50 mi Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın ve Coplin kavanoza ilave edin. </li><li> 20 dakika boyunca boyama çözeltisi slaytlar daldırın. </li><li> Bir saç kurutma makinesi kullanarak slaytları fazla leke çıkarmak ve hemen kurumaya distile su slaytlar durulayın. </li><li> gece boyunca, oda sıcaklığında slaytlar bırakın. </li><li> slaytta montaj orta tek bir damla uygulayın, nazikçe, montaj ortamında bir lamel yerleştirin orta yavaş yavaş slayt yayılmış izin ve kaldırmakBir kağıt havlu ile fazla orta. monte slayt önce hareketli veya lamel hareketini önlemek için bir mikroskop altında inceleyen en az 1 saat kurumasını bekleyin. Dikkat: Bu adımda sırasında herhangi bir baloncukları oluşturmadan dikkatle lamel yerleştirilmesi önemlidir. kabarcıklarını çıkarmak için aşırı ısı kullanımı tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> Mikroskobik gözlem ve sapmaları türleri <ol><li> metafaz iyi kalitede parlak alan mikroskobu kullanarak 100X büyütmede yayılır yapısal CA&#39;larını inceleyin. </li><li> 100 metafaz CA&#39;larının sayıda neden tedaviler için, her tedavi grubu için yayılır en az 50 puan. Daha küçük etki boyutları için, 300 metafaz yayılır analizi tavsiye edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).</li><li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+European+aerosol+phenomenology-2:+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside,+urban,+rural+and+background+sites+in+Europe.">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li><li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States.">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li><li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers.">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li><li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution.">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li><li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban,+background+marine,+and+forest+atmosphere.">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li><li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+HULIS:+How+humic-like+are+they?+A+comprehensive+and+critical+review.">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li><li>P&#246;schl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+aerosols:+composition,+transformation,+climate+and+health+effects.">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles.">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages.">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter.">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li><li>Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+in+cancer+development.">Genomic instability in cancer development.</a> Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).</li><li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter.">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element.">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li><li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation.">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+(LET=+60keV/&#181;m)+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death.">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/&#181;m) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing,+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O,+12+C+and+7+Li.">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li><li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols:+a+review.">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sitogenetik çalışma veya numaraları veya öncelikle metafaz yayılır kromozom, yapılarının mikroskobik analizi, çeşitli hastalıklar için prognoz, risk değerlendirmesi ve tedavisi için önemli bilgiler sağlar. Şimdi sitogenetik anormallikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesi ve gelişimi ile bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Bugüne kadar, CA tüm ana tümör tiplerinde olduğu bulunmuştur. Sitogenetik değişikler 16 çeşitli uyarabilir önemli dış ri...

Partikül madde (PM) maruz kalma öncelikle kardiyopulmoner hastalığı ve akciğer kanseri 1 yılda 3 milyondan fazla aşırı ölümlere neden olması tahmin edilmektedir. PM maruz kalma seviyeleri arttıkça akciğer kanseri riski 2 gösterilmiştir Nitekim, PM, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (Grup 1) ile insanlarda kansere olarak tanındı. İlginç bir şekilde, hemen hemen tüm kanser hücrelerinin sayısal ve / veya yapısal kromozom anomalileri liman. Partikül organik karbon, terkibi ve boyut dağılımı emisyonları ve fiziksel ve kimyasal dönüşümler bağlı olan bir varyantı, karmaşık ve heterojen karışım vardır. Bu 35-55 (boyutunda PM 2.5 mikron ve daha küçük) kentsel PM 2.5 kütlesinin% kırsal ve kıta arka plan PM 2.5 kütle 3, 4 den fazla% 60 oluşturmaktadır. suda çözünen fraksiyon organik aerosol 30-90% oluşturmaktadır. Organik bileşiklerin büyük bir kısmıalifatik hidrokarbonlar, poliaromatik hidrokarbonlar ve bunların oksijenli nitratlı türevlerini, alifatik aldehitler ve alkoller, serbest yağ asitleri ve bunların tuzları, di-karboksilik asitler, çok fonksiyonlu bileşikler, proteinler, ve hümik benzeri makromoleküller (HULIS) kullanılması dahil olmak üzere tespit edilmiştir kütle spektrometrik teknikleri 5-8 ile birleştiğinde kromatografik yöntemler. Bu nedenle bu bileşikler, organik karbonun çoğu 9 bilinmemektedir, parçacık halinde organik karbon az% 10-20 temsil etmektedir. Deneysel kanıtlar, sitotoksisite, oksidatif stres ve enflamasyon PM ile ilişkili patolojik durumların gelişiminde rol oynadığını düşündürmektedir. Yakın zamanda, bununla birlikte, PM bu maruz kalma da in vitro sistemlerinde, insan konularında 10-12 hem de deneysel olarak, tekrar eden elemanların, DNA metilasyon değişiklikler de dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, bir dizi ile sonuçlanır gösterilmiştir. Özel ilgi konusu olan etkileri vardırMajör ve minör uydular - - kromozomların sentromer etrafında heterokromatik bölgesinde bulunan uydu DNA PM. Onlar maruz 12. sonra en az 72 saat süreyle tespit edilebilir olarak bu etkiler, doğası gereği kalıcı olabileceğini gösterilmiştir. Özellikle sentromer yaklaşık DNA metilasyonu değişiklikler, hücre bölünmesi esnasında, uydu, DNA mRNA transkript, bir uzlaşma kromozom bütünlük birikimine yol açabilir ve daha sonra, patolojik durumların 13 çeşitli oluşmasına da neden olabilir. PM bağlı epigenetik değişiklikler bir son nokta olarak bir CA analizi için sitogenetik yaklaşım adaptasyonu, bu şekilde, yüksek bir öneme sahiptir. Burada, fare makrofaj RAW264.7 modeli sistemini kullanarak CA&#39;ların in vitro maruziyet ve analiz ortam PM toplama ve hazırlama yaklaşımı, rapor. Makrofajlar t nedenle, inhale yabancı nesnelere karşı ilk savunma hattını oluşturan veCep hattı kurulmuş ve partikül toksikoloji 11, 12, 14, 15, en sık kullanılan bir model olarak hizmet vermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Total suspended particulate sampler</td>
			<td style="width:179px;">Tisch Environmental</td>
			<td style="width:119px;">TE-5170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Bruker Avance III NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TopSpin 3.5/pl2 software</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">ACD/NMR Processor Academic Edition</td>
			<td style="width:179px;">ACD/Labs</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">High glucose DMEM GlutaMAX media</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10569010</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140163</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25200056</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010049</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:261px;">KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15212012</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10575090</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Methanol (HPLC)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A452N1-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Acetic Acid, Glacial</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1185-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-200733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

partiküler madde (PM) maruz kalma nükleer genetik materyalin dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenleri, zarar verebilir önemli bir dünya sağlık sorunu vardır. Nükleer genetik bütünlüğü üzerindeki PM etkisini değerlendirmek için, yapısal kromozom bozuklukları fare RAW264.7 makrofaj hücrelerinin metafaz mamulünün puanlanır. PM yüksek hacimli toplam askıda partiküller örnekleyici ile ortam havasından toplanır. Toplanan malzeme çözünebilir ve suda çözünür ince kısmı tutmak için filtre edilir. partiküller, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ile kimyasal bileşim açısından karakterize edilir. Parçacık süspansiyonu farklı konsantrasyonları muamele edilmemiş kontrol hücreleri ile birlikte, 72 saatlik bir toplam maruz kalma süresi için RAW264.7 fare makrofaj bir in vitro kültürü üzerine ilave edilir. Temas süresi sonunda, kültür metafaz hücreleri yakalama colcemid ile işlenir. Daha sonra hücreler toplandı, acetomethanol sabit hipotonik çözelti, D ile muamele edilirCam slaytlar üzerine ropped ve son olarak Giemsa çözeltisi ile boyandı. Slaytlar parlak alan mikroskobu kullanılarak 1,000X büyütmede metafaz yayılır yapısal kromozom sapmaları (CA) değerlendirmek için incelenir. 50 ila 100 metafaz yayılımı, her tedavi grubu için puan verilir. Bu teknik kromatid tipi tatili, chromatid tipi alışverişi, acentric parçaları, disentrik ve halka kromozomlar, çift dakika endoreduplication ve PM maruz kaldıktan sonra in vitro Robertsonian translokasyonları gibi yapısal kromozomal anomaliler (CA), tespiti için uyarlanmıştır. Epigenetik değişikliklere köklü bir sitogenetik uç noktasını ilişkilendirmek için güçlü bir yöntemdir.

Büyük bakım TSP numune yerini yanı sıra koleksiyon yapılır yılın zaman seçiminde dikkatli olunmalıdır. Kimyasal bileşim, aynı zamanda parçacıkların boyutu esas olarak sonuçlarını etkileyebilir. Toplanan malzeme beyaz filtre karşı görünür olmalıdır. Normal bir fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom vardır. tekniğin amacı kontrol grubuna göre muamele edilen hücrelerde anormal kromozom oranında bir değişim (ya da bunun olmayan) göstermektir. Bu de?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar. 

Video: Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetik

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Drosophila melanogaster dönen egzersiz miktar sistem (istekler) kullanarak ölçüm egzersiz seviyelerinde

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Sitogenetik teknikle Bemisia tabaci yumurta döllenme oranı belirleme

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...