Name: analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

仕事はバイオ研究エクセレンス[助成金番号1P20GM109005]、国立航空宇宙局（NASA）[助成金番号NNX15AK32A]を通じてアーカンソースペースグラントコンソーシアムの保健センターの国立研究所、および労働安全のための国立研究所によって部分的にサポートされていました健康（NIOSH）[助成金番号2T420H008436]。著者は、この原稿を校正し、編集するためのクリストファーフェテスに感謝したいと思います。

1.粒子の収集と準備<ol><li> 高容量全浮遊粒子サンプラのキャリブレーション <ol><li>マスフローコントローラからサンプラーモータを取り外し、安定したAC電源（ 図1）にモーターを接続します。 注：フィルタは、この手順の間に使用されていません。 </li><li>サンプラーにキャリブレータオリフィスとトップローディングアダプタプレートをマウントします。空気の漏れが存在しないことを保証するために確実にトップローディングアダプタ押さえナットを締めます。サンプラーモータが通常の動作温度（約10〜15分）まで昇温することを可能にします。 </li><li>手で口にオリフィスと圧力タップの上に穴を覆うことにより、リークテストを実施します。空気をエスケープすることにより作られた甲高いスキール音を聞きます。この音が聞こえる場合はリークが存在しているとして、トップローディングアダプタ押さえナットを締め直してください。音が低い場合、漏出は、SYSの他のガスケットの一つの近くにありますテム。 </li><li>ゴム製の真空管とオリフィスの側の圧力タップに水の圧力計の一方の側を接続します。大気開放圧力計の反対側にしておきます。正確な測定値を確保するために、垂直方向に圧力計を保持します。連続流レコーダーの裏側をタップすると、ペンを中心に、正確な測定値を提供するのに役立ちます。 </li><li> 30〜60フィート/分（約ごとに5〜6フィート3 /分）から操作する流量を表す5の流量を使用して手順を繰り返し1.1.2。 5の異なる位置に可変オリフィス上のノブを調整し、5別の読み取りを行います。 </li><li>認定最後の日付、日付、サイトの場所、およびキャリブレーションシート上のオペレータのイニシャルと周囲の空気の温度、周囲気圧、サンプラーシリアル番号、オリフィスシリアル番号、オリフィススロープとインターセプトを記録します。 </li></ol></li><li> 総浮遊粒子サンプル収集および重量分析 <ol><li>ラップアルミホイルの二つの層8 &quot;×10&quot;の石英繊維フィルター。炉内に包まれたフィルタを置き、550℃に温度を設定。少なくとも4時間、フィルターを焼きます。炉クールにしようとフィルターを取得します。 CaCO 3でデシケーター中にフィルタを配置します。 </li><li> 10μgの精度の天秤でフィルタを計量。日中の測定3回繰り返します。個々の測定値は25μgの範囲内でなければなりません。これが達成されていない場合は、デシケーターに包まれたフィルタを返し、次の日の処理を繰り返します。 </li><li>避難所のふた（ 図2）を開きます。真鍮ボルトとワッシャーが邪魔にならないようにダウンスイングすることができ、4ウィングナットを緩めて、フィルターホルダーフレームを削除します。支援画面上に、粗いサイドアップ、アルミ箔からフィルタを展開し、慎重にそれを中心に清掃鉗子を使用しています。正しく画面にフィルタを合わせます。 </li><li>画面上にフレームを配置し、それを確保縁部での空気漏れを回避するために十分な圧力をかけながら真鍮ボルトとワッシャ。清潔な布でフィルターホルダーの周りの汚れの蓄積を拭いてください。慎重に避難所の蓋を閉じて固定します。 </li><li>すべてのコードが適切なコンセントのソケットに差し込まれており、送風機モータ圧力タップと連続流レコーダー間のチューブが接続されていることを確認します。 </li><li>流れレコーダーを準備します。ペン先を高め、新しいチャートを挿入するためにペンアームリフターを押し下げます。レコーダーのドライブハブにチャートのタブの位置を合わせ、ハブ上にグラフの中心を下げるために親指で押してください。チャート上の正しい時刻が時間インデックスポインタと位置合わせされるまで、ドライブハブを時計回りに回転させることで時間を設定します。 </li><li>手動サンプラーに切り替えて、収集を開始。それが正しくインキングされ、経過時間インジケータは、それが正常に動作していることを確認するために確認するためにレコーダーを監視します。 </li><li>サンプリング期間の終了時に、サンプラー、レコードをオフに時間が経過し、グラフを取得します。フィルタを公開するフレームを削除してください。ピンセットで端で静かに保持することによって支援画面から露出し、フィルタを削除します。サンプルは二回サンプルに触れるように縦にフィルタを折り、元のアルミホイルでそれをラップします。 </li><li>計量前に少なくとも24時間のCaCO 3とデシケーターにフィルタを保管してください。サンプリング後のフィルタの重量を測定するための手順を繰り返し1.2.2。ジップビニール袋にフィルタを配置し、分析まで-80℃に保管してください。 </li></ol></li><li> 収集した全浮遊粒子試料の分析 <ol><li>保存されているフィルタを取得し、アルミ箔を展開し、清潔なテフロン表面にフィルタを転送します。ピンセットやメスを使用して、フィルタの外側（白い）部分を切断して処分します。 <ol><li>次に、100ミリリットルのフラスコに0.5 &quot;×0.5&quot;の作品と場所片でフィルタをカット。超純水の50ミリリットルを追加します。超音波でフラスコを置きますバス、33±3 kHzで60分間超音波処理。 </li></ol></li><li>フィルターを100mlの丸底フラスコに0.45μmのポリプロピレンシリンジフィルターを介して抽出します。約5mlの抽出物をフラスコ中に残るまで50℃で圧力下で回転蒸発器装置を用いて水を蒸発させます。 <ol><li>既知重量の15ミリリットルの梨型フラスコに残った水を蒸発させます。乾燥抽出物の入ったフラスコを計量し、乾燥抽出物の質量を記録します。 </li></ol></li><li> 15分間超音波処理することによって、D 2 Oの400μlの乾燥サンプルを溶解し、5ミリメートルの標準的なNMR管に移します。未溶解物質を除去するために、室温で12,000×gで5分間遠心します。 </li><li> D 2 Oの300μlで繰り返しNMR管にNaN 3を10μlの1.4％（最終濃度：w / vの0.02％）を追加します。 NMRチューブ中のD 2 O（最終濃度0.258ミリモル）に総浮遊粒子（TSP）-d4（3.2 mg / mlで）を10μl（32μgの）を追加します。 </li><li>600.17 MHzで動作するNMR分光計を用いて、1 H NMRスペクトルを取得します。 <ol><li>三重共鳴凍結プローブにNMR管を挿入します。次の順序で機器を較正：ロック、曲、シム、90°パルス長較正及び受信ゲイン調整。 </li><li>デジタルクワッド検出モードで180の水選択パルス、8192スキャン、4ダミースキャン、8012.57ヘルツの掃引幅を使用して、1次元励起彫刻配列と25℃でのスペクトルを測定し、周波数は4.70 ppmに設定された水の信号抑制、1.70のオフセット秒の取得時間、32,768時間領域のデータポイント（TD）、1ミリ秒の持続時間の勾配（P16）、勾配後100μ秒回復遅延（D16）。 </li></ol></li><li> 1ヘルツ及び2（65,536データポイント）倍ゼロフィリングの線幅拡大を適用することによって、プロセス1 H NMRスペクトルを示します。手動相とベースラインを修正して、統合します。 0.0 ppmのTSP-d4のピークを設定します。 </li></ol></li></ol> 2.粒子暴露<ol><li> 文化を設定します <ol><li> （37℃）、10％ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン溶液（100 U / ml）を、0.25％トリプシン溶液とカルシウムマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水浴中（PBS）を含む暖かい完全増殖培地用培養開始前に少なくとも30分。 </li><li>培養されたRAW264.7細胞を含む、5％CO 2インキュベーターからT75フラスコを取り出し、予め温めておいた2mlのPBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>掻き取り、続いて予熱したトリプシン溶液1mlを使用して、組織培養容器の底から付着RAW264.7細胞を取り除きます。 </li><li>組織培養容器から細胞を収集し、繰り返しピペッティングにより単一細胞懸濁液を作ります。予め温めた完全培地での100mm組織培養皿中で8,000 / cm 2で（合計500,000個の細胞）の密度で、トリパンブルー及びプレートを有する細胞の数を数えます。 50,000個の細胞の最終濃度のために10ミリリットルにメディア音量を調整1mlあたり。 注：DNAメチル化解析も行われている場合、プレートの数を倍増。 </li><li> 37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で新たにメッキRAW264.7細胞を置き、24時間アタッチすることができます。 </li><li>また、安全キャビネット内で、フィルタリングの粒子を再懸濁します。例えば、5μg/ mlの治療用量のための滅菌PBS中の0.5mg / mlの濃度で粒子を希釈および5mg /50μg/ mlの治療用量についてmlで。希釈は、予め月まで調製し、-80℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 粒子状物質による治療 <ol><li> 5％CO 2インキュベーターから細胞を取り出し、細胞増殖、細胞形態、培養条件、および汚染の倒立顕微鏡を用いて10倍の倍率で確認してください。一つは、この段階では、少なくとも30％コンフルエントの細胞を持っていることを期待するべきです。 </li><li>無菌的には、滅菌ピペットを用いて培地を吸引し、2mlの37℃のPBSで培養容器を洗浄します2回完全にメディアおよび浮動または死んだ細胞を除去します。 </li><li>培養容器中の新鮮な培地と粒子状物質の予め決定された投与量を追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で、所望の時間インキュベートします。本研究では、同時遺伝毒性およびepigenotoxic分析のために使用される露光と平行して72時間のPMでRAW264.7細胞を扱います。 注：細胞毒性は、負に細胞遺伝学的解析の品質に影響を与える可能性があります。したがって、そのような細胞毒性、DNAメチル化、ウエスタンブロッティング、または遺伝子発現分析のような付加的なアッセイは、典型的に処理された細胞上で実行されます。記載されているように細胞を露出させ、所望の特定のアッセイを進めます。経験の浅いユーザーはまた、CAを検出する能力をテストするために、メチルメタンなどのポジティブコントロールを含めることができます。 </li></ol></li></ol> 3.細胞遺伝学的アッセイ<ol><li> 中期で細胞を停止させる治療 <ol><li>そうコルセミドを温めますリューション30分間37℃の水浴中で（10 / mlの）。汚染の危険性を最小限に抑えるために安全キャビネットの下に70％アルコールで蓋を拭きます</li><li>完全に無菌的にメディアを取り出し、2ミリリットル予め温めておいたPBSで2回培養容器を洗います。 </li><li>予め温めておいた新鮮な培地を加える（2ミリリットルメディア/ 10 6細胞）を培養容器中のコルセミド溶液（5μL/ ml）を含む、2時間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 細胞収穫 <ol><li> 30分間37℃に維持した水浴中に温かいトリプシン溶液とPBS。以降、このステップから、無菌状態を維持する必要はありません。 </li><li>完全にメディアを取り出し、2回2ミリリットル37°C PBSで培養容器を洗浄し、100ミリメートル皿またはT75フラスコのために予め温めておいたトリプシン溶液（通常は60ミリメートル培養皿またはT25フラスコのための2ミリリットルと4ミリリットルの必要なボリュームを追加）、および1分間37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で培養容器を配置します。 </li><li>ターク電子アウト培養容器を、スクレーパーを用いて細胞を剥離し、トリプシンの作用を停止するためにPBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>上下ピペット少なくとも10回15ミリリットルコニカル遠心管に単一細胞懸濁液と転送細胞を作るために。 </li><li>室温でのアウトスイング遠心機で5分間、400×gで遠心分離細胞懸濁液。 </li><li>上清を取り除き、穏やかなタッピングによって細胞ペレットを破る、PBSの10ミリリットルを追加し、再び5分間遠心します。 </li></ol></li><li> 低張処理および固定 <ol><li>少なくとも30分間、37℃の水浴中でプレ暖かい0.075 M塩化カリウム溶液。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、PBSの約0.5ミリリットルを残します。 </li><li>静かに細胞ペレットを破壊し、P200のピペットを用いて、単一細胞懸濁液を作ります。 </li><li>穏やかに振盪しながら降下により予熱した塩化カリウム溶液ドロップの4ミリリットルを追加します。 </li><li>低張Pで細胞をインキュベート20分間37℃の水浴中otassium塩化物溶液。 </li><li> 1パート氷酢酸で3部品のメタノールを加えて、新鮮なacetomethanol液を作ります。室温で、この新たに調製した固定液を保管してください。 </li><li>低張処理した後、チューブに固定液の等量の（4 ml）を加え、穏やかにチューブを反転させて溶液を混合。 </li><li>室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。この段階の細胞ペレットのサイズが大きくなる時に、白っぽいより見えるようになります。 </li><li>上清を除去し、4ミリリットルに新鮮な固定液を追加し、室温で30分間保ちます。 </li><li> 5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去し、4ミリリットルの固定液でさらに2回の洗浄を与えます。 </li></ol></li><li> クリーニングと中期スプレッドの準備をスライドさせ <ol><li> 30分間、10％の液体洗剤中に完全にスライドガラスを浸漬します。 </li><li> 30分間冷たいランニング水道水で十分にスライドを洗浄します。 </li><li>凛SEは完全に、界面活性剤を除去蒸留水に浸し、そして将来の使用のために冷蔵庫に保存するために蒸留水で3回スライドさせます。 注：使用が広がると中期の品質を増大させるの均一性を容易にする前に、スライドを清掃。 </li><li>チルド濡れたスライド上の10μlの細胞懸濁液をドロップし、それを室温で一晩乾燥を放送することを可能にします。 </li></ol></li><li> 染色および取り付け <ol><li> PBSの一部でギムザ染色液の一部を混合して50ミリリットルギムザ染色液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。 </li><li> 20分間染色液でスライドを浸し。 </li><li>過剰な汚れを除去し、すぐにヘアドライヤーを使用してスライドを乾燥させるために、蒸留水でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で一晩スライドを残します。 </li><li>媒体はゆっくりとスライド上に拡散することを可能にする、そっとマウンティング培地にカバースリップを置き、スライド上の封入剤の一滴を適用し、削除ペーパータオルで余分な培地。マウントされたスライドが前に移動、またはカバースリップの動きを回避するために、顕微鏡下での表示に少なくとも1時間乾燥することができます。 注意：このステップの間に気泡を形成することなく、慎重にカバースリップを配置することが重要です。気泡を除去するために過剰な熱の使用は推奨されません。 </li></ol></li><li> 顕微鏡観察および収差の種類 <ol><li>中期は良質の明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で広がるの構造のCAを調べます。 </li><li>少なくとも50〜100中期はCAの多数を誘導治療のために、各治療群スプレッドスコア。小さい効果サイズの場合、最大300の中期スプレッドの分析をお勧めします。 </li></ol></li></ol>

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細胞遺伝学的研究や数字や、主に中期スプレッド中の染色体の構造の顕微鏡分析は、様々な疾患の予後、リスク評価、および治療のための重要な情報を提供しています。現在では、細胞遺伝学的異常は、癌を含むいくつかの疾患の進行と開発にリンクされていることを十分に確立されています。現在までに、CAは、すべての主要な腫瘍タイプで発見されています。細胞遺伝学的改変16?...

主に、心肺疾患および肺癌1から、粒子状物質（PM）への曝露は、毎年300万人を超える過剰な死亡を引き起こすと推定されています。 PMへの曝露のレベルの増加に伴う肺癌リスクの増加が2が示されているように、実際に、PMは、国際がん研究機関（グループ1）によってヒトに発癌性として認識されました。興味深いことに、ほとんどすべての癌細胞は、数値および/または構造的染色体異常を保有します。粒状有機炭素は、その組成およびサイズ分布の排出量だけでなく、物理的、化学的変換に依存するバリアント、複雑で、不均一な混合物、です。これは、35-55（サイズのPM 2.5ミクロンと小さい）都市PM 2.5質量％と農村部と大陸背景PM 2.5質量3、4の60％以上から占めます。水溶性画分は、有機エアロゾル30〜90％を占めます。有機化合物の多数脂肪族炭化水素、多環芳香族炭化水素、ならびにそれらの酸素化及びニトロ化誘導体、脂肪族アルデヒドおよびアルコール、遊離脂肪酸およびその塩、ジ - カルボン酸、多官能性化合物、タンパク質、及びフミン状高分子（HULIS）の使用を含む、同定されています質量分析技術5-8と結合されたクロマトグラフィー法。これらの化合物は、このように有機炭素の大部分は9未知である、粒子状有機炭素未満の10〜20％を表します。 実験的証拠は、細胞毒性、酸化ストレス、および炎症はPM-関連する病理学的状態の発症に関与していることを示唆しています。それが最近示されたが、PMへの暴露はまた、 インビトロ系および 10-12ヒト被験体の両方の実験において、反復エレメントのDNAメチル化の変化を含む、エピジェネティックな変化の数になります。特に興味深いの効果がありますメジャーとマイナーの衛星 - - の染色体のセントロメアの周りのヘテロクロマチン領域に見出されているサテライトDNA上のPM。それは暴露12の後、少なくとも72時間を検出することができるようにこれらの効果は、本質的に永続的であり得ることが示されました。特にセントロメアの周りのDNAメチル化の変化は、衛星DNAのmRNA転写物の蓄積をもたらす細胞分裂の際に染色体の完全性を損なうことと、その後、病理学的状態13の様々な開発につながることがあります。 PMによって引き起こされるエピジェネティックな変化の終点としてCAの分析のための細胞遺伝学的アプローチの適用は、このように、非常に重要です。ここでは、マウスマクロファージRAW264.7モデルシステムを使用して、CAのインビトロでの曝露と分析で 、周囲のPM収集と準備のためのアプローチを報告しています。マクロファージは、吸入異物に対する防御の最初の行を含み、したがって、トンその細胞株を確立し、粒子毒物11、12、14、15の中で最も頻繁に使用されるモデルとして役立ちます。

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

粒子状物質（PM）への曝露は、核の遺伝物質を含む様々な細胞成分を損傷する恐れがあり、主要な世界的健康問題です。核遺伝的整合性にPMの影響を評価するために、構造的染色体異常は、マウスRAW264.7マクロファージ細胞の分裂中期スプレッドで採点されます。 PMは、大量の全浮遊粒子サンプラと周囲空気から収集されます。捕集された材料は、水溶性、微細な部分を保持するように可溶化し、濾過します。粒子は、核磁気共鳴（NMR）分光法による化学組成を特徴としています。粒子懸濁液の異なる濃度は、未処理対照細胞と一緒に、72時間の総露光時間のRAW264.7マウスマクロファージのインビトロ培養物に添加されます。露光の終了時に、培養は中期で細胞を停止させるコルセミドで処理されます。次いで、細胞を採取し、acetomethanolで固定低張液、Dで処理されていますガラススライド上ropped、最後にギムザ溶液で染色しました。スライドを明視野顕微鏡を用いて1,000倍の倍率で中期スプレッド構造的染色体異常（CAS）内を評価するために調べられます。 50〜100の中期スプレッドは、各処置群について採点します。この技術は、このような染色分型改、染色分型の交換、非中心フラグメント、二動原体とリング染色体、ダブル分、核内倍加、およびPMへの曝露後のin vitroでのロバートソン転座などの構造的染色体異常（CAS）の検出のために適合されています。エピジェネティックな変化に十分に確立された細胞遺伝学的エンドポイントを関連付けるために強力な方法です。

細心の注意は、TSPサンプラーの場所だけでなく、収集が行われる年の時間を選択する際に注意すべきです。化学組成並びに粒子のサイズは、実質的に結果に影響を与え得ます。収集した材料は、白色フィルタに対して表示されるはずです。正常マウスの中期スプレッドは40無動原染色体を持つことになります。技術の目標は、対対照処理細胞における染色体異常の割?...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K ビュー.  University of Arkansas for Medical Sciences. このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。 

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

発生生物学

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

遺伝学

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

免疫・感染学

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

生物工学

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

ラムダを選択cII変異検出システム

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

生物学

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

培養細胞からの染色体の準備

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析

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線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出