Questo lavoro è sostenuto in parte con fondi forniti da The University of North Carolina a Charlotte, Wachovia fondo di base per eccellenza della facoltà, e una borsa di studio NIGMS (R15GM101571).

1. LSE Preparazione <ol><li> Rane donna (Xenopus laevis) sono iniettati due volte per la raccolta delle uova. La prima iniezione (priming) è 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina) a rana. Le rane devono essere adescato almeno due giorni prima di uova induce posa e rane innescato sono utilizzabili per un massimo di due settimane. Per prime rane, iniettare per via sottocutanea pMsg nei sacchi linfatici dorsali utilizzando una siringa da 3 ml e 27 ago G. </li><li> Per indurre la deposizione delle uova, iniettare 500 U hCG (gonadotropina corionica umana) a rana innescato per via sottocutanea nei sacchi linfatici dorsali utilizzando un ago 27 G. Incubare rane iniettati in diversi contenitori contenenti 2 litri di soluzione 1x Marc modificato Ringer (MMR). Lasciare rane 14-20 ore per deporre le uova prima della raccolta. </li><li> Rimuovere le rane dai secchi e versare fuori la soluzione MMR fino a circa 100 ml è di sinistra. Ottenere le uova dai secchi trasferendo le uova in un becher da 250 ml. </li><li> Uova Dejelly aggiungendo 100 ml del 2% cisteina (regolarepH a 7,8 con 10 M KOH). Agitare delicatamente le uova con una pipetta Pasteur di vetro invertita (0,7 cm di diametro) circa ogni 30 sec. Decantare e sostituire con cisteina fresco due volte durante l&#39;incubazione. Il processo dejellying è completa in circa 5-15 min quando le uova formare uno strato più condensata sul fondo del bicchiere. </li><li> Eliminare la soluzione di cisteina e lavare le uova tre volte con MMR 0,25 x. Swirl le uova nella soluzione da una pipetta di vetro. &quot;Bad&quot; uova sono determinate mediante una semplice ispezione visiva e sono di colore bianco &quot;gonfio&quot; in apparenza. I &quot;cattivi&quot; uova si accumulano al centro del bicchiere dopo vorticoso. Rimuovere &quot;cattivi&quot; uova da una pipetta Pasteur. </li><li> Lavare le uova con Lysis Buffer Egg (ELB) tre volte. Rimuovere eventuali altri &quot;cattivi&quot; uova da una pipetta Pasteur. Versare le uova in una provetta 14 ml Falcon. </li><li> Gira il tubo Falcon per 55 sec a 188 xg (1.100 rpm) con il CL2 IEC clinico tavolo centrifuga con rotore oscillante per compattare le uova. Rimuovere il tampone in eccesso dalsopra lo strato di uovo. Aggiungere 0,5 ml di Aprotinina / magazzino leupeptina e 0,5 l di brodo Citocalasina B per ml di uova compattati. </li><li> Centrifugare uova a 16.500 xg (10.000 rpm) per 15 min a 4 ° C utilizzando il RC6 Sorvall più centrifuga supervelocità con HB6 rotore oscillante. Dopo centrifugazione, le uova sono frazionati in tre strati nel tubo: lipide, estratto, e tuorlo / pigmento dall&#39;alto verso il basso, rispettivamente. Forare il lato del tubo Falcon nella porzione inferiore dello strato centrale estratto con un ago 21 G. Rimuovere con attenzione l&#39;ago come l&#39;ago puntura può essere ostruito da materiale plastico. Inserire un ago da 21 G fresco attaccato ad una siringa da 1 ml nel sito di puntura per raccogliere l&#39;estratto. Lentamente aspirare l&#39;estratto in siringa per evitare bolle d&#39;aria e la contaminazione con il tuorlo e lipidi / pigmento strati. </li><li> Posizionare gli estratti in un freddo 1,5 ml microcentrifuga tubo. Per ogni millilitro di estratto di uova, aggiungere le seguenti soluzioni madre chimiche al didicata concentrazione finale (mostrato tra parentesi): (1) 10 cicloeximide microlitri (100 mcg / ml), (2) 1 microlitri Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml ciascuna), (3) 1 ml Citocalasina B (5 pg / ml ), (4) 1 microlitri di ditiotreitolo (1 mM), e (5) 0,33 Nocodazole microlitri (3 mg / ml). Capovolgere l&#39;uovo estrarre almeno 10 volte con delicatezza. Questa è la LSE, che deve essere fatta fresca e utilizzato entro 4 ore. La qualità della LSE è compromessa dopo 4 ore o di congelamento-scongelamento. </li></ol> 2. Trattamento della cromatina sperma con Approcci danneggiare il DNA <ol><li> Preparare cromatina spermatozoi normali secondo il metodo descritto in precedenza 13. </li><li> Preparare MMS trattato con cromatina spermatica <ol><li> Risospendere cromatina spermatozoi normali in 0,5 ml di tampone di X. </li><li> Aggiungi ~ 5,5 ml di MMS (9,1 M in magazzino) a 500 microlitri risospeso cromatina ad una concentrazione finale di 100 mM. </li><li> Incubare cromatina spermatozoi in provetta a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione. </li><li> Gira la mtubo icrocentrifuge a 686 xg (2.100 rpm) per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando la centrifuga IEC CL2 clinica con rotore oscillante e adattatori per provette. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di tampone di X più BSA (3%), DTT (0,1 mM) e Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml). </li><li> Ripetere i punti (4) e (5) due volte per lavare la cromatina spermatica. </li><li> Determinare la concentrazione di spermatozoi con cromatina un emocitometro e diluire a 100.000 spermatozoi / pl. Salva aliquote di 5 pl in congelatore -80 ° C per un ulteriore uso. </li></ol></li><li> Preparare UV trattato con cromatina spermatica <ol><li> Aggiungere la quantità desiderata (es. 10 pl) della cromatina spermatica normale sulla superficie di un pezzo di Parafilm. </li><li> Posizionare il Parafilm in un reticolante UV. Impostare il parametro energia desiderata, a seconda del tuo esperimento, e iniziare a danneggiare la cromatina degli spermatozoi attraverso la luce UV. Ad esempio, ci vogliono circa 21 secondi per raggiungere 1000 J / m 2. </li><li> Dopo UV irradiazione, UV trattato con cromatina sperma devono essere aggiunte a estratti di uova immediatamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di una struttura di DNA Damage-imitazione (AT70) <ol><li> Sciogliere due oligonucleotidi sintetici poli-(dA) 70 (designato come A70) e poli-(dT) 70 (designato come T70) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / microlitro, rispettivamente. </li><li> Aggiungere 100 pl di A70 e 100 pl di T70 una provetta 1,5 ml microcentrifuga. Bollire mista soluzione sintetica oligo per 5 min a 95 ° C in un heatblock. </li><li> Prendete il blocco secco bagno fuori (con il tubo contenente miscela in esso), e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente su un banco di laboratorio. Questa regolazione della temperatura dura circa 45-60 min. </li><li> La miscela raffreddata è AT70 con una concentrazione finale di 2 mg / mL. Magazzino 10 pl di AT70 aliquote in congelatore a -20 ° C per un ulteriore uso. </li></ol> 4. Attivazione della Checkpoint danno al DNA in cromatina LSE con sperma danneggiato o di un danno al DNA-Imitazione Struttura <ol><li> Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con cromatina degli spermatozoi danneggiati <ol><li> Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e integrare con 1 ml di miscela di energia e 2 ml di cromatina degli spermatozoi danneggiati (concentrazione finale ~ 4.000 spermatozoi / reazione microlitri). </li><li> Incubare la provetta di reazione a temperatura ambiente per 90 min e aspirare il tubo ogni 10 min. </li><li> Dispensare 1 ml di miscela di reazione su un vetrino da microscopio integrato con 1 ml di soluzione colorante nucleare dopo 30 minuti di incubazione. Posizionare un vetrino sopra la miscela di reazione e controllare la formazione di nuclei con microscopio a fluorescenza. In genere, nuclei rotondi formerà dopo 30 minuti di incubazione, che indica la replicazione del DNA ha avviato. </li><li> Prendere 10 pl di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni sono analizzati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi. </li></ol></li><li> Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con ilAT70 <ol><li> Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga integrata con 1 ml di miscela di energia e 1,6 l di brodo Tautomycin. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di pre-made AT70 (2 pg / pl) o acqua (come controllo negativo) ad ogni reazione. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 90 min. Flick le provette di reazione ogni 10 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni vengono esaminati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi La cromatina sperma danneggiato o danno al DNA che imitano la struttura può attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA nel sistema Xenopus estratto uovo. Figura 2a mostra che induce MMS Chk1 fosforilazione a Ser344 (Chk1 P-S344), che è un indicatore di l&#39;attivazione della chinasi ATR. figura 2B mostra che AT70, come un danno al DNA-imitazione structure, attiva anche Chk1 fosforilazione. Totale campioni Chk1 sono utilizzati come controlli carico in entrambi gli esempi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Figura 1. Uno schema della segnalazione checkpoint danno al DNA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Figura 2. Chk1 fosforilazione è indotta da uno o MMS AT70 trattamenti in Xenopus estratti uovo. (A) MMS-danneggiato sperma cromatina (MMS) o cromatina spermatica normale (Con) vengono incubati in estratti di uova per 90 min. Chk1 fosforilazione di Ser344 (Chk1 P-S344) e Chk1 totale in estratti di uova sono esaminati mediante immunoblotting. (B) AT70 o acqua (Con) vengono aggiunti estratti di uova, rispettivamente. I campioni sono analizzati mediante immunoblotting come in (A).

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono diversi vantaggi nello studio il punto di controllo danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. L&#39;uso di estratti di uova fornisce una grande quantità di estratti acellulari sincronizzati al interfase del ciclo cellulare. Gli estratti uovo può essere facilmente ed economicamente realizzato. È relativamente facile danneggiare il DNA o cromatina e per rivelare un difetto del checkpoint danno al DNA dopo immunodepleting una proteina bersaglio estratto da uovo. Successivamente, un difetto d...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 anticorpo </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Chk1 anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metile methanesulfonate (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Esempio di buffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Benna per la deposizione delle uova </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 centrifuga IEC con rotore oscillante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotore oscillante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 più centrifuga superspeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Reticolante UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzioni </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, regolare il pH a 7,8 con NaOH 10 M </td></tr><tr><td> Aprotinina / leupeptina magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in acqua ciascuno. Memorizzare 20 pl aliquote a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M saccarosio, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, regolare il pH a 7,5 per HCl </td></tr><tr><td> Cicloeximide magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in acqua. Negozio aliquote da 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Citocalasina B magazzino </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Memorizzare 20 pl aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) stock </td><td></td><td></td><td> 1 M in acqua. Negozio aliquote da 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M saccarosio, 1 mM DTT, 50 pg / ml cicloeximide, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM di HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. Memorizzare aliquote di 5 pl a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energy Miscela </td><td></td><td></td><td> Creatina fosfato 375 mM, ATP 50 mM, e 25 mM MgCl 2. Aliquote vengono salvate a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Soluzione colorante nucleare </td><td></td><td></td><td> 0,4 mcg / ml Hoechst 33258, glicerolo 25%(V / v), in PBS 1x </td></tr><tr><td> Tautomycin magazzino </td><td></td><td></td><td> 100 mM in DMSO. Memorizzare aliquote da 10 pl a -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Su base giornaliera, le cellule vengono sottoposte ad una serie di insulti endogeni e ambientali. Per combattere questi insulti, le cellule si sono evoluti danno checkpoint del DNA segnalazione come un meccanismo di sorveglianza per rilevare danni al DNA e dirette risposte cellulari al danno al DNA. Ci sono diversi gruppi di proteine ​​chiamate sensori, trasduttori ed effettori coinvolti nella segnalazione checkpoint danni al DNA (Figura 1). In questo complesso percorso di segnalazione, ATR (ATM e RAD3 correlato) è uno dei principali chinasi che può rispondere al danno del DNA e stress replicazione. Attivato ATR può fosforilare i suoi substrati a valle, come Chk1 (Checkpoint chinasi 1). Di conseguenza, fosforilata e attivata Chk1 porta a molti effetti a valle nel checkpoint danno del DNA compresi arresto del ciclo cellulare, l&#39;attivazione della trascrizione, danni riparazione del DNA, e apoptosi o senescenza (Figura 1). Quando il DNA è danneggiato, non riuscendo ad attivare i risultati danno checkpoint del DNA in unrepdanni in onda e, successivamente, instabilità genomica. Lo studio del punto di controllo danno al DNA chiariranno come le cellule di mantenere l&#39;integrità genomica e fornire una migliore comprensione di come malattie umane, quali il cancro, lo sviluppo. Xenopus laevis estratti di uova stanno emergendo come un potente sistema acellulare modello estratto nella ricerca checkpoint danni al DNA. A bassa velocità estratto (LSE) è stato inizialmente descritto dal gruppo Masui 1. L&#39;aggiunta di cromatina spermatica demembranated ai risultati LSE in formazione nuclei dove viene replicato DNA in maniera semiconservativa volta per ciclo cellulare. La via di segnalazione ATR/Chk1-mediated checkpoint viene attivata da danni al DNA o stress replica 2. Due metodi sono attualmente utilizzati per indurre il checkpoint danno al DNA: approcci che danneggiano il DNA e il DNA danni che imitano le strutture 3. Danno al DNA può essere indotta da raggi ultravioletti (UV) di irradiazione, γ-irradiazione, metil metanoesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitrochinolina-1-ossido di (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS è un agente alchilante che inibisce la replicazione del DNA e attiva il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA 4-7. Irradiazione UV innesca anche il danno ATR/Chk1-dependent 8 checkpoint del DNA. Il danno che imitano la struttura del DNA AT70 è un complesso di due oligonucleotidi ricotto-poli (dA) 70 e poli-(dT) 70. AT70 Il sistema è stato sviluppato nel laboratorio di Bill Dunphy ed è ampiamente utilizzato per indurre ATR/Chk1 segnalazione checkpoint 9-12. Qui, descriviamo protocolli (1) per preparare estratti privi di cellule uovo (LSE), (2) per il trattamento di cromatina spermatica Xenopus con due DNA diversi approcci di danneggiare (MMS e UV), (3) per preparare il danno-imitazione struttura del DNA AT70, e (4) per attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA in LSE con cromatina sperma danneggiato o un danno che imitano la struttura del DNA.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus uovo estratto è un sistema modello utile per studiare il punto di controllo danno al DNA. Questo protocollo è per la preparazione di estratti di uova di Xenopus e danno del DNA reagenti inducenti checkpoint. Queste tecniche sono adattabili ad una varietà di approcci di danneggiamento del DNA nello studio del DNA segnalazione checkpoint danni.

Studio del danno al DNA con Checkpoint<em&gt; Xenopus</em&gt; Uovo Estratti

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K Views.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus uovo estratto è un sistema modello utile per studiare il punto di controllo danno al DNA. Questo protocollo è per la preparazione di estratti di uova di Xenopus e danno del DNA reagenti inducenti checkpoint. Queste tecniche sono adattabili ad una varietà di approcci di danneggiamento del DNA nello studio del DNA segnalazione checkpoint danni.

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Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

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Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

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Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

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In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

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Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Un test cellulare gratuitamente utilizzando<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; Embryo Estrae per studiare i meccanismi del regolamento Size nucleare

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.

Dimostrazione del saggio delle fibre di DNA per lo studio del danno al DNA e delle dinamiche di riparazione indotte dalle nanoparticelle

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione dell'interazione e della localizzazione delle proteine nel danno al DNA

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Combinazione del saggio del ligando di prossimità con la colorazione Gamma-H2AX per caratterizzare le interazioni proteiche nella risposta a

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

Methods Article

Studio del danno al DNA con Checkpoint