The authors thank Drs. Jeffrey Bloomquist and Daniel Swale for their technical comments and suggestions. This project was partially funded by the Department of Entomology and the College of Agriculture and Life Sciences at Virginia Tech.

1. Raccolta e preparazione dei soggetti di prova <ol><li> Raccogliere il numero appropriato di api dalla colonia. NOTA: Il numero necessario dipende non solo le dimensioni e la portata di questo esperimento, ma anche l&#39;abilità del ricercatore. Ad esempio, se ci sono 2 gruppi di trattamento con un campione desiderato di 10 api per gruppo, un investigatore ragionevolmente abile potrebbe raccogliere almeno 30 api per tenere conto di dissezioni senza successo e finire con 20 video utili per segnare. </li><li> Ridurre al minimo la quantità di tempo che intercorre tra la raccolta e la dissezione. NOTA: Sebbene api possono essere alloggiati in laboratorio per giorni prima dissezione, il tasso di successo di dissezioni (cioè, la probabilità di mantenere una frequenza cardiaca stabile in un vaso dorsale sezionato) è stato osservato a diminuire rispetto alla quantità di tempo che le api sono alloggiati lontano dalla colonia. <ol><li> Fornire api con una fonte di acqua e cibo, mentre ospitato in laboratorio. per example, come minimo, accessibile un 50% (w / v) di saccarosio in acqua (questo è sufficiente per durate inferiori a 6 ore). Per periodi più lunghi, forniscono le api accesso al miele. </li><li> Casa api nella notte laboratorio ad una temperatura di circa 32 ° C e 60-80% di umidità relativa per ridurre lo stress ed evitare la disidratazione. </li></ol></li><li> Prima di dissezione, anestetizzare le api brevemente per aiutare nella gestione. NOTA: Questo può diminuire il tasso di successo di dissezioni e ridurre il throughput. <ol><li> Raffreddare le api avviene mediante l&#39;immissione sul ghiaccio o in un frigorifero per il tempo sufficiente a ridurre il movimento al fine di aiutare nella gestione. </li><li> In alternativa, esporre brevemente le api a CO 2 al fine di aiutare nella gestione. NOTA: L&#39;esposizione prolungata al freddo può ridurre il tasso di successo delle dissezioni. Estesa o ripetuta esposizione al CO 2 può anche ridurre il tasso di successo delle dissezioni. </li></ol></li></ol> 2. La dissezionedi dorsale della parete addominale NOTA: Le api devono essere vivi al momento della dissezione. <ol><li> Utilizzando pinze e / o forbici microdissezione, rimuovere le gambe e le ali per facilitare la dissezione del ventre. Mantenere un piccolo beaker o simile contenitore riempito con acqua distillata vicina allo scopo di risciacquo strumenti tra dissezioni. </li><li> Mentre trattenete l&#39;ape con una pinza, utilizzare le forbici per tagliare microdissezione lateralmente lungo la parete addominale dorsale tra il primo e il secondo tergiti (vedi Figura 1). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> Figura 1: vista dorsale di api dell&#39;addome. L&#39;incisione iniziale deve essere fatta tra il primo e secondo tergiti, come indicato dalla linea rossa. Barra di scala = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare il suo</a>e per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="3"><li> Mentre leggermente tenendo l&#39;estremità posteriore del secondo tergite con la pinza, tagliare longitudinalmente lungo ogni lato delle api dall&#39;incisione iniziale al stinger (vedere Figura 2). Fare attenzione quando si tagliano per evitare la puntura del tratto gastrointestinale. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> Figura 2: Vista laterale di api dell&#39;addome. Il secondo e terzo incisioni devono essere effettuate lungo entrambi i lati del ventre, come indicato dalla linea rossa. Barra di scala = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Scambiare le forbici per una seconda serie di pinza sottile e utilizzarli per separare accuratamente la parete addominale dorsale dal resto of dell&#39;addome. Rimuovere delicatamente il stinger e qualsiasi parte del tratto gastrointestinale che rimane attaccata alla parete addominale dorsale. Evitare rottura dell&#39;intestino, come il contenuto può rivestire la parete addominale ed impedire la visualizzazione del vaso dorsale. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> Figura 3: Vista del vaso dorsale. Una volta che l&#39;intestino e Stinger sono stati rimossi, il vaso dorsale è visibile lungo la linea mediana della parete addominale dorsale sezionato. Barra di scala = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> Disporre la parete addominale dorsali nell&#39;orientamento desiderato sotto la telecamera in modo che il vaso dorsale è visibile (vedere Figura 3). Utilizzare le forbici per tagliare microdissezione via qualsiasi eccesso abmuro dominal che impedisce la visualizzazione del vaso dorsale. La forma della parete addominale dorsale dovrebbe essere simile a una tazza poco profonda o ciotola quando si trova in modo corretto. <ol><li> Poiché il vaso dorsale non si estende nel segmento addominale hindmost delle api, rimuovere il tergite finale per migliorare la visualizzazione del vaso dorsale. </li></ol></li><li> Utilizzando una micropipetta volume regolabile, coprire il vaso dorsale con 10 ml di soluzione isotonica di mantenere condizioni fisiologiche e facilitare un battito cardiaco costante. NOTA: La soluzione consigliata è forza trimestre soluzione di Ringer (0,120 g di cloruro / L di calcio, cloruro di potassio 0,105 g / L, 0,050 g / L di bicarbonato di sodio, e 2.250 g / L di sodio cloruro), che è stato trovato per facilitare una stalla, battito cardiaco continuo. </li></ol> 3. Osservazione e modulazione di frequenza cardiaca <ol><li> Lasciare che il vaso dorsale di sedersi indisturbati fino ad ottenere una stabile, battito cardiaco continua(Di solito entro 300 sec). NOTA: Heartbeat è visualizzato come contrazioni ritmiche del vaso dorsale. Inizialmente, ci possono sembrano essere alcun battito, specialmente se l&#39;ape è stato anestetizzato, ma il cuore sarà solitamente riprendere battitura dopo riposo in soluzione isotonica per alcuni minuti e può continuare a battere per ore, purché rimane immerso nella soluzione. </li><li> Misurare la frequenza cardiaca in termini di numero di battiti al minuto (BPM). <ol><li> Registrare il numero di contrazioni osservati durante un periodo di 60 sec. Utilizzare un contatore del riscontro della mano e un timer per facilitare questo processo. </li></ol></li><li> Misurare la variazione della frequenza cardiaca registrando il BPM osservata prima e dopo il trattamento con un composto cardiomodulatory. NOTA: Sebbene il tempo necessario per osservare un effetto sulla frequenza cardiaca può variare a seconda del composto in prova, variazioni della frequenza cardiaca in genere può essere osservato in pochi minuti. <ol><li> Determinare la frequenza cardiaca di base immediatamente primal&#39;aggiunta di composti di prova. NOTA: la frequenza cardiaca post-trattamento di solito può essere determinato dopo 90 a 120 sec. </li><li> Preparare potenziali cardiomodulators (ad esempio, octopamina) sciogliendo il composto nella stessa soluzione isotonica utilizzata per bagnare il vaso dorsale. </li><li> Aggiungere i composti in esame alla soluzione circonda il vaso dorsale utilizzando un micropipetter. </li></ol></li><li> Per una maggiore precisione e un throughput più elevato, effettuare una registrazione video di ciascun soggetto di prova e quindi utilizzare i video a segnare la frequenza cardiaca in un secondo momento. NOTA: Questo consente a un singolo ricercatore di scaglionare dissezioni al fine di facilitare la produzione quasi continua di video. Durante la registrazione video, la lunghezza minima consigliata è di circa 240 sec con qualsiasi composto di prova che si aggiunge alla boa 60 sec. Questo assicura che il ricercatore ha una finestra di 60 secondi per aver frequenza basale cuore e poi un&#39;altra finestra di 60 secondi per aver post-trattamento della frequenza cardiaca 120 secdopo il trattamento. </li></ol>

<ol>
	<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+Systems.">Circulatory Systems.</a> Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 365-413 (2013).</li><li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements.">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects.">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li><li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee,+Apis-Mellifera.">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li><li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees.">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li><li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+(Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae):+Acceleration+vs.+inhibition.">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li><li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso,+Ethanol,+Tween-20,+Tween-80,+and+Emulphor-620.">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li><li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz.">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li><li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+in+invertebrates.">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li><li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters.">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect5 or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel7, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

L&#39;obiettivo generale di questa metodologia è quello di consentire al ricercatore di rapidamente e facilmente osservare e quantificare l&#39;effetto che un agente farmacologico ha sulla frequenza cardiaca di api mellifere. Api, come altri insetti, hanno un sistema circolatorio aperto che diffonde emolinfa, l&#39;equivalente insetti di sangue, durante la cavità del corpo, conosciuto come hemocoel. La circolazione di emolinfa è essenziale per il trasporto di sostanze nutritive, fattori immunitari, rifiuti, così neurohormones e altre molecole di segnalazione 1. La circolazione è facilitata dal vaso dorsale, che si estende lungo la linea mediana dorsale dell&#39;insetto, nonché organi pulsatile accessori. Il vaso dorsale è divisa in due sezioni funzionalmente distinte, designato cuore nell&#39;addome e l&#39;aorta nel torace e la testa. contrazioni propagate nel emolinfa cuore pompa verso il torace e la testa, mentre gli organi pulsatile accessori assicurano il flusso di emolinfa alle estremità. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; funzione cardiaca insetti può essere osservato usando una varietà di metodi, a seconda delle dimensioni, fase fisiologia, o la vita dell&#39;insetto. Un approccio comune per l&#39;osservazione della frequenza cardiaca in larve o insetti più piccoli è l&#39;uso di immagini intravitale 2. Questo metodo è meno utili api adulte, tuttavia, in quanto può essere difficile visualizzare chiaramente il vaso dorsale attraverso la parete addominale. Un approccio stabilito per la registrazione della frequenza cardiaca in una varietà di insetti, comprese le api, è l&#39;uso di contatto termografia, che utilizza termistori applicati all&#39;esterno dell&#39;insetto per rilevare pulsazioni cardiache 3,4. La frequenza cardiaca in api adulte è stato registrato anche utilizzando una tecnica elettrofisiologico per misurare una elettrica 4,5 segnale di impedenza. Questa tecnica richiede l&#39;inserimento di elettrodi nell&#39;animale vicino al cuore e l&#39;utilizzo di un convertitore di impedenza per registrare battiti cardiaci 4. Analogamente, elettrocardiogrammi sono stati utilizzati per DATECt segnali elettrici prodotti dal cuore e combinati con registrazione video delle api per osservare variazioni dell&#39;attività cardiaca 6. Un distinto vantaggio di questi approcci è che la frequenza cardiaca viene valutata in intatto, ape vivente, piuttosto che in un campione sezionato, che contribuisce a garantire la disponibilità della gamma di risposte fisiologiche del soggetto. Le sfide di questi approcci includono la contabilità per l&#39;immobilizzazione o anestesia del soggetto, la necessità di limitare le variabili esterne e stimoli che potrebbero alterare la frequenza cardiaca, oltre a determinare un metodo di consegna appropriato quando il test agenti farmacologici. Un altro approccio che è stato usato per studiare l&#39;attività cardiaca ape è di sezionare parzialmente l&#39;insetto per esporre cuore, quindi misurare contrazioni vaso dorsale usando un trasduttore di spostamento forza 7. In questo protocollo, il cuore è continuamente bagnata con la corsa soluzione fisiologica e di prova compounds possono essere sciolti in questa soluzione per applicazione al soggetto 7. Una differenza significativa tra questo metodo e quelli precedentemente descritti è che il cordone nervoso ventrale è rimosso, eliminando il ruolo che il sistema nervoso centrale ha dimostrato di giocare in modulazione di frequenza cardiaca 5. Il risultato è che il battito cardiaco basale, che è di solito piuttosto irregolare, stabilizza ad una frequenza molto bassa e l&#39;ampiezza a quello tipicamente osservato in un insetto vivente 5,7. Ciò che tutti questi metodi hanno in comune è che essi richiedono attrezzature altamente specializzate e spesso costosi, oltre ad un certo livello di competenza, per essere realizzato. Forse il più grande svantaggio è che nessuno di questi approcci sono particolarmente adatti per gli esperimenti che coinvolgono test un gran numero di soggetti, come ad esempio lo screening di una libreria di composti potenzialmente cardiomodulatory. Il maggior punto di forza dell&#39;approccio qui descrittoè la sua semplicità. Il protocollo è relativamente facile da padroneggiare la configurazione richiede poco spazio, ed è necessario solo un ingresso finanziario minimo. Il metodo richiede poco più di alcune api, alcuni strumenti chirurgici, una soluzione isotonica, e di un microscopio digitale o un microscopio tradizionale con una fotocamera digitale. Le api sono sezionati per visualizzare il vaso dorsale e video digitali vengono utilizzati per registrare la frequenza cardiaca prima e dopo il trattamento con agenti farmacologici. Sebbene la registrazione video non è effettivamente necessario per osservare i cambiamenti nella frequenza cardiaca, sarà notevolmente aumentare il throughput (cioè, il numero di soggetti che possono essere elaborati in un determinato periodo di tempo). L&#39;investigatore può massimizzare l&#39;efficienza registrando un gran numero di video in una sola volta e poi segnando questi video in un momento più conveniente. Un altro vantaggio di questo approccio è che i video permettono al ricercatore di ricominciare, se il processo di punteggio essere interrotto, e rendere più facile per la vdel visualizzatore accecare al trattamento, al fine di ridurre i pregiudizi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Dino-Lite Edge digital USB microscope</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">AM4815ZT</td>
			<td style="width:405px;">Any digital microscope or similar setup will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Microscope stand</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">RK-10</td>
			<td>Any stand appropriate for the digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Laptop or PC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Necessary for digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:200px;">Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">14003</td>
			<td>Any similar scissors suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504482</td>
			<td>Any similar forceps suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Ringers solution 1/4 strength tablets&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">96724-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Dissecting tray</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any surface suitable for microdissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Single channel 10 &#181;l pipette</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any device capable of accurately delivering 10 &#181;l volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Small beaker or container of water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to rinse instruments between subjects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Hand tally counter</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">295033</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Timer</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">644219</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Deionized water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preparation of Ringers solution and rinsing instruments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Poiché molti dei composti farmacologicamente attivi che possono essere testati utilizzando questo protocollo non sono solubili in acqua, è necessario avere un solvente affidabile che consenta composti di prova da consegnare tramite la soluzione isotonica utilizzata per bagnare il vaso dorsale. Dimetilsolfossido (DMSO) è un solvente che viene comunemente utilizzato come veicolo per fornire farmaci sperimentali e altri composti negli animali 8, ed è stato usato con successo ...

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Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissezione e di osservazione di Honey Bee dorsale della nave per gli studi della funzione cardiaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  Virginia Tech. The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Video: Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

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We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

Ottenere campioni con rallentato, accelerato e invertito l&#39;invecchiamento in Honey Bee Modello

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Dissezione e di osservazione di Honey Bee dorsale della nave per gli studi della funzione cardiaca

Riepilogo

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Capitoli in questo video

In vivo Ca ^{2 +} - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l'apprendimento olfattivo nel Honey Bee

Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

Di base

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Ottenere campioni con rallentato, accelerato e invertito l'invecchiamento in Honey Bee Modello

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele