L'obiettivo generale di questa procedura è quello di migliorare gli studi secondari sulla polmonite batterica fornendo una via semplice e non invasiva di inoculazione batterica nel tratto respiratorio inferiore seguita dal recupero batterico e dalla purificazione dell'RNA per l'analisi della trascrizione. Ciò sarà realizzato prima anestetizzando profondamente un mouse e inserendo un ago piegato con punta smussata precaricata nella trachea di un topo che è stato sospeso verticalmente dagli incisivi mascellari. In secondo luogo, a seguito di un'infezione riuscita, le unità batteriche che formano colonie vengono recuperate per escissione e omogeneizzazione dei polmoni.
L'omogeneato polmonare risultante viene diluito serialmente e placcato su un agar nutriente per enumerare le unità che formano colonie. Infine, l'RNA viene purificato dall'omogeneato polmonare. Il vantaggio di questa procedura è che consente una consegna controllata direttamente nelle vie respiratorie inferiori.
Questo ci consente di esaminare sia i contributi combinatori che individuali dell'agente patogeno verso l'esito della malattia. Recenti progressi in questo campo hanno dimostrato che la regolazione genica batterica può avere un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione. Questa tecnica beneficia della capacità di recuperare sia i CFU batterici che l'RNA.
Una volta isolato l'RNA, possiamo quindi valutare i contributi di specifici geni di virulenza all'infezione. Inoltre, questa tecnica trae vantaggio dall'essere non chirurgica. Ciò consente di posizionare uno stress minimo su tutti gli animali utilizzati nell'ambito di questa procedura e consente loro di avere un recupero immediato.
Questa procedura beneficia dell'utilizzo di attrezzature di laboratorio comuni senza l'uso di alcun tipo di cannule, fili guida o cavi in fibra ottica. Gli individui nuovi a questa tecnica possono lottare all'inizio con l'installazione effettiva attraverso la trachea. Una volta concettualizzata questa tecnica, diventa una procedura semplice ed efficace interrogare la polmonite batterica secondaria all'interno di un ospite murino.
Prima di iniziare la procedura, preparare lo spazio di lavoro con le seguenti forniture: una piattaforma di intubazione, una siringa sterile da un mL, pinza sterile a punta smussata, ago sterile a punta smussata calibro 21 e due tubi conici per conservare la siringa e le pinza. Iniziare la procedura preparando gli inoculi patogeni in modo che la concentrazione finale desiderata sia ottenuta in un volume di 50 microlitri. Successivamente, l'uso di guanti sterili prepara un ago con punta smussata da uno a 1,5 pollici calibro 21 piegalo ad un angolo approssimativo di 35 gradi.
Dopo aver sistemato l'ago alla siringa, disegnare un cuscino d'aria da 100 microlitri, seguito da 50 microlitri dell'agente infettivo. Il cuscino d'aria da 100 microliter assicura la piena consegna del carico patogeno una volta che la siringa è depressa. Posizionare l'ago caricato e la siringa in una posizione facilmente accessibile dalla mano dominante.
Rimuovere e anestetizzare il mouse dalla camera di anestesia e sospendere il mouse sulla piattaforma di intubazione dagli incisivi mascellari. Utilizzando le forcep a punta smussata, afferrare ed estendere delicatamente la lingua. Trasferire la lingua dalle forcep nel pollice e nell'indice della mano non dominante.
Rimanere tenendo la lingua nella mano non dominante e prendere la siringa precaricata. Puntare l'estremità piegata dell'ago lontano dal corpo. Inserire l'ago nella cavità orale.
Alla base della lingua inclinare delicatamente il polso per causare una leggera spinta dell'ago lontano dal corpo. Questa azione assicura che l'ago venga inserito nella trachea e non nell'esofago. Guida lentamente l'ago verso il basso nella trachea.
Spesso si sente un leggero segno di spunta mentre l'ago passa attraverso la piega vocale. Passare l'ago attraverso la trachea fino a quando non si sente una leggera resistenza mentre l'ago incontra la carena. Sollevare leggermente l'ago nella direzione verso l'alto per sospendere l'ago sopra la carena.
Ciò consente la consegna nei bronchi primari. Deprimere completamente lo stantuffo della siringa per fornire il carico infettivo. Rimuovere l'ago dalla trachea e scartare.
Rimuovere il mouse dalla piattaforma di intubazione deprimendo l'elastico, ma continuare a tenere il mouse in posizione verticale. Ostruire le vie aeree nasali posizionando un dito direttamente sopra i nares. Mantenere questa posizione per circa un minuto o fino a quando non si osservano diversi respiri profondi.
Quest'ultimo passaggio assicura che il volume totale dell'inoculo sia consegnato nelle vie respiratorie inferiori. Riportare l'animale nella sua gabbia e assicurarsi che ci sia un rapido recupero dall'anestesia. In determinati punti di tempo i polmoni infetti possono essere asportati per quantificare e valutare i contributi batterici all'aumento delle morbilità associate alla polmonite batterica secondaria.
Preparare uno spazio di lavoro con i seguenti elementi: una bilancia e una barca di pesata sterile, una piattaforma di dissezione, un kit di dissezione contenente forbici e forcep e garza sterile. Ai fini di questa dimostrazione l'escissione dei polmoni verrà eseguita su un banco. Tuttavia, al fine di mantenere la sterilità durante questa procedura si raccomanda di eseguire l'escissione polmonare all'interno di una cappa a flusso laminare.
Eutanasia di un topo infetto con CO2 o un metodo di eutanasia approvato dalla IACUC simile. Posizionare e fissare il mouse infetto sulla piattaforma di dissezione. Spruzzare il topo con etanolo per mantenere la sterilità sulle superfici di lavoro.
A partire dall'ombelico, utilizzare un paio di forcelle per sollevare la pelle e fare un'incisione verso la laringe. Afferrando la pelle su entrambi i lati dell'incisione iniziale, allontanare la pelle dal corpo e tagliare le connessioni tissutali. Può essere utile effettuare tagli laterale sulla pelle per rivelare più della regione toracica.
Partendo dalla base del processo xifoide, fare una piccola incisione con l'intenzione di forare il diaframma. Ciò si traduce in un aumento della pressione nella cavità toracica causando la retrazione dei polmoni. Con i polmoni retratti, continuare l'incisione per liberare il diaframma.
Rimuovere le costole facendo un'incisione su entrambi i lati. Questo esporrà la cavità toracica e i polmoni. Per asportare i polmoni afferrare la base del cuore con le forcep e sollevare verso l'alto.
Posizionare le forbici dietro i polmoni e iniziare a fare piccole incisioni attraverso le connessioni tissutali continuando a sollevare il cuore verso l'alto. Una volta che i polmoni sono stati asportati, posizionarli su una garza sterile e rimuovere il cuore sollevandolo dai polmoni e tagliando le restanti connessioni tissutali. Trasferire i polmoni sulla barca di pesatura pre-tarata e registrare la massa.
Dopo aver pesato i polmoni, trasferire i polmoni in soluzione salina sterile tamponata da fosfati e conservarli temporaneamente sul ghiaccio. Ora che i polmoni sono stati asportati e pesati, i batteri possono essere recuperati per determinare il loro ruolo verso la patogenesi. In preparazione al recupero batterico, saranno necessarie le seguenti forniture: una smerigliatrice tissutale, PBS sterile privo di RNasi, RLT tampone integrato con beta-mercaptoetanolo e tubi di microcentrifugo senza RNasi da 1,5 ml.
Inizia aggiungendo prima un mL di PBS sterile privo di RNasi alla smerigliatrice tissutale. Una volta riempito, conservare la smerigliatrice di tessuto sul ghiaccio. Successivamente, preparare una serie di tubi di diluizione seriale sterili senza RNasi per quantificare la carica batterica recuperata dai polmoni infetti.
Trasferire i polmoni nella smerigliatrice di tessuto preparata e omogeneizzare accuratamente il tessuto premendo sul piedistallo mentre si ruota. Aprire la smerigliatrice tissutale e aliquota 100 microlitri del campione omogeneizzato nel primo dei tubi di diluizione seriali preparati. Diluire serialmente i campioni e la piastra sull'agar nutriente per enumerare le unità che formano la colonia.
I CFC possono essere registrati come CFC per mL o CFC per mL, per milligrammo di tessuto polmonare. Dopo aver rimosso l'aliquota di 100 microliter, sostituire il piedistallo di macinazione e centrifugare il campione a 4.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il supernatante dal campione pelletato.
Il supernatante può essere salvato e conservato a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi in un secondo momento. Sospendere di nuovo il pellet di tessuto omogeneizzato in 700 microlitri di beta-mercaptoetanolo RLT e trasferire il campione in un tubo di centrifuga sterile privo di RNasi da 1,5 ml. A questo punto il campione può essere conservato a meno 80 gradi.
L'RNA può essere purificato dal liquame omogeneato polmonare RLT caricando il campione in un tubo di microcentrifugo da due ml contenente perline di silice da 1 millimetro ed elaborato tramite un battitore di perline per 20 secondi a sei metri al secondo. L'RNA viene quindi immediatamente purificato usando un adattamento del metodo RNeasy come riportato in Voyich, et al. Methods in Molecular Biology"2008, e descritto nel manoscritto che accompagna questo video.
Dopo la purificazione, la resa dell'RNA può essere quantificata utilizzando uno spettrofotometro. Una volta quantificato, è utile diluire l'RNA risultante in diverse aliquote di 50 nanogrammi per microlitro. Ciò consente di utilizzare l'RNA del campione per più analisi senza essere soggetto a cicli multipli di congelamento-scongelamento.
L'uso di questa tecnica consente l'installazione di un carico patogeno controllato direttamente nelle vie respiratorie inferiori. L'efficienza di questo sistema di erogazione può essere dimostrata attraverso l'installazione di una soluzione blu brillante 1%Coomassie. La riga superiore mostra un paio di polmoni non infetti per fungere da controllo, mentre la riga inferiore mostra un paio di polmoni che hanno ricevuto 50 microlitri della tintura blu brillante 1%Coomassie attraverso un'installazione intratracheale.
L'uso di questo colorante dimostra come l'installazione intratracheale fornisca una distribuzione uniforme del carico patogeno nei polmoni sinistro e destro e in tutti i polmoni sinistro. Una volta infettato, il carico patogeno può essere recuperato e analizzato in vari punti di tempo dopo l'installazione intratracheale mediante escissione e omogeneizzazione del tessuto polmonare. Per dimostrare l'efficienza di questa tecnica di recupero due gruppi contenenti tre topi ciascuno sono stati infettati da una dose bassa e alta di Staphylococcus aureus.
L'input batterico è stato placcato sull'agar nutriente per enumerare i CFC. Un'ora dopo l'installazione intratracheale, i topi sono stati eutanasiati, i polmoni asportati e omogeneizzati in una smerigliatrice tissutale. Il tessuto omogeneizzato è stato diluito serialmente e placcato su agar nutriente per enumerare i CFC.
L'RNA isolato dal tessuto polmonare omogeneizzato può essere esaminato mediante PCR con trascrittasi inversa e utilizzato per quantificare l'abbondanza relativa di trascrizione dei geni bersaglio. Per garantire una contaminazione minima del DNA di fondo si raccomanda di eseguire una reazione PCR, senza l'aggiunta di trascrittasi inversa, insieme a eventuali reazioni qRT-PCR. Oltre ai carichi batterici, questa tecnica può essere estesa all'installazione e all'isolamento di carichi virali.
Dopo l'omogeneizzazione del tessuto polmonare, l'RNA virale può essere isolato e utilizzato per misurare l'abbondanza di trascrizione di geni virali o costruire una curva standard per la quantificazione virale. L'uso di questo sistema fornisce un sistema altamente efficiente e riproducibile per studiare la polmonite batterica secondaria. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere utilizzata in esperimenti su larga scala.
Lavorando in lotti per eutanasiare i topi, l'installazione intratracheale può avvenire entro 30 secondi per mouse. Una volta completato questo, passando all'escissione dei polmoni, questo può essere completato in circa due o tre minuti per topo. Mentre i metodi qui discussi erano stati nel contesto di un'infezione batterica secondaria, possono essere estesi a qualsiasi procedura in cui sia necessario un parto controllato e il recupero di un inoculo.
Oltre ai metodi qui descritti, questa procedura può essere integrata dall'aggiunta di un lavaggio broncoalveolare prima dell'escissione dei polmoni. Mentre questo spesso si traduce in una diminuzione del recupero del carico patogeno, beneficia dell'ottenimento di dati, come l'analisi delle citochine, l'attività della lattato deidrogenasi e l'identificazione di diverse popolazioni cellulari. Per ottenere una comprensione più completa della patogenesi della malattia diventa importante interrogare sia i contributi dell'ospite che degli agenti patogeni alla malattia.
Lo scopo di questo video era quello di fornire un metodo semplice ed efficiente per esplorare la polmonite batterica secondaria all'interno di un ospite murino.
