I mitocondri dipendono fortemente dal genoma nucleare, nonostante abbiano il proprio DNA. Pertanto, è necessario un meccanismo di importazione altamente regolamentato. Questo metodo aiuta a studiare il processo e come può adattarsi agli stimoli esterni.
Questa è l'unica tecnica biochimica disponibile per valutare quantitativamente l'importazione di proteine nei vari sottocompartimenti dei mitocondri. La vitalità dei mitocondri è implicata in vari stati patologici, quindi capire come è regolata l'importazione di proteine può aiutare a contribuire a nuovi approcci terapeutici che colpiscono i mitocondri. È necessaria una cura extra durante l'isolamento per garantire la vitalità e l'integrità dei mitocondri.
È necessaria un'accurata tritatura del tessuto e una delicata riesuspressione di tutti i pellet successivi. A dimostrare la procedura sarà Ashley Oliveira, dottoranda nel mio laboratorio. Per iniziare l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico, rimuovere il grasso e il tessuto connettivo dai muscoli e tritare i tessuti su un vetro dell'orologio pre-refrigerato fino a quando non si tratta di un liquame omogeneo.
Posizionare il tessuto tritato in un tubo di centrifugazione di plastica pre-refrigerato da 50 millilitri e registrare il peso esatto. Quindi, diluire il tessuto tritato dieci volte con tampone 1 contenente ATP. Utilizzare un omogeneizzatore a doppia lama da otto millimetri per omogeneizzare il campione muscolare a una potenza di 9,8 Hertz per 10 secondi, assicurando che non rimangano blocchi visibili di muscoli.
Dopo aver ruotato il campione a 9.000x G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, risospesere accuratamente il pellet in circa 95 microlitri del mezzo di risospensione. Centrifugare il campione prima di scartare il surnatante e risospesare delicatamente il pellet con circa 180 microlitri di mezzo di risospensione utilizzando una pipetta P-200. Per la traduzione in vitro, preparare un mix di reazioni di traduzione sufficiente a fornire 20 microlitri per campione di mitocondri da utilizzare in esperimenti di importazione e per una corsia di traduzione.
Posizionare la reazione per l'incubazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti. 15 minuti dopo l'inizio della reazione di traduzione, aliquotare 90 microgrammi di mitocondri in tubi sterili da 1,5 millilitri e pre-incubare a 30 gradi Celsius per 10 minuti. In un nuovo set di tubi sterili da 1,5 millilitri, combinare 75 microgrammi di mitocondri con 18 microlitri della reazione di traduzione e incubare il tubo a 30 gradi Celsius per il tempo desiderato.
Mantenere il volume rimanente della reazione di traduzione sul ghiaccio. Per terminare la reazione di importazione dopo il tempo di incubazione appropriato, rimuovere il tubo da 30 gradi Celsius per posizionarlo sul ghiaccio, quindi trasferire con attenzione la reazione di importazione sulla parte superiore del tubo con il cuscino di saccarosio. Centrifugare i campioni con cuscino di saccarosio a 17.000x G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta P-1000, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Per importare nella membrana esterna, eseguire la reazione utilizzando Tom40 e risospesciare il pellet in 50 microlitri di carbonato di sodio 0,1 molare appena preparato e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 14.000x G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, preparare i campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE come descritto nel manoscritto. Preparare la corsia di traslazione di controllo mescolando tre microlitri della reazione di traslazione rimanente con 37 microlitri di tampone di lisi e cinque microlitri di colorante campione. Far bollire i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius e girare delicatamente verso il basso a bassa velocità per evitare di pellettare i mitocondri.
Dopo aver applicato i campioni al gel di poliacrilammide SDS, far bollire il gel in acido tricloroacetico al 5%, o TCA, in una cappa aspirante per cinque minuti con agitazione continua. Quindi, posizionare il gel in acqua a doppio distillato su una piastra rotante per un minuto a 50 rotazioni al minuto. Lavare il gel in Tris da 10 millimolari su una piastra rotante per cinque minuti a 50 rotazioni al minuto.
Per precipitare la proteina, lavare il gel in un volume sufficiente di acido salicitico monofusolare per coprire il gel su una piastra rotante per 30 minuti. Per disidratare il gel, posizionare un grande foglio di carta assorbente sul letto poroso dell'essiccatore di gel e un foglio di carta assorbente nell'area in cui verrà applicato il gel. Quindi, tagliare 11 centimetri per 9 centimetri pezzo di carta assorbente e posizionare la carta sul tovagliolo di carta.
Utilizzare un secondo pezzo di carta assorbente di 11 centimetri per 9 centimetri per estrarre il gel dal contenitore e stendere il gel in piano sopra il primo pezzo. Posizionare un pezzo di plastica leggermente più grande sul gel, assicurandosi che non ci siano pieghe o bolle sotto l'involucro. Quindi, stendere il coperchio di plastica dell'essiccatore di gel sopra la parte superiore dell'involucro.
Accendi l'aspirapolvere. Assicurarsi che il coperchio di plastica abbia formato un sigillo sollevando l'angolo del coperchio di plastica e aspettando che il coperchio si risigilli. Chiudere l'essiccatore di gel per 90 minuti, iniziando a 30 gradi Celsius per raggiungere gradualmente gli 80 gradi Celsius e tornare a 30 gradi Celsius alla fine della corsa.
Avvolgere il gel nell'involucro di plastica utilizzato nel processo di essiccazione. Una volta disidratato, il gel si solidificherà e si sentirà sottile come la carta. Posizionare il gel disidratato in una cassetta con un film di fosforo sopra.
Esporre la pellicola per 24 ore prima di visualizzare il gel utilizzando l'autoradiografia con qualsiasi imager adatto in grado di imaging al fosforo. L'analisi rappresentativa mostra i normali tassi di importazione di malato deidrogenasi, o MDH, nei mitocondri subsarcolemmali e intermiofibrillari e il prodotto di traduzione del precursore MDH. L'aggiunta di valinomicina ha inibito l'importazione di proteine MDH nella matrice dei mitocondri SS e IMF.
Allo stesso modo, il detergente Triton X ha inibito l'importazione di MDH in entrambe le sottofrazioni a causa della solubilizzazione della membrana interna. La stima dell'importazione di proteine è stata effettuata per periodi di tempo crescenti e i dati conseguenti hanno illustrato che l'importazione è un processo dipendente dal tempo e che i mitocondri SS e IMF hanno tassi o capacità diversi per l'importazione. Quando i ratti sono stati sottoposti a stimolazione elettrica, l'importazione di Tom 40 nella membrana esterna era più alta nei muscoli da animali cronicamente stimolati rispetto ai controlli.
L'ornitina transcarbamilasi, o importazione di OCT, nella matrice mitocondriale è stata aumentata in ogni punto temporale di incubazione, con conseguente aumento di 1,4 volte dei mitocondri dal muscolo cronicamente stimolato. L'importazione di proteine è stata correlata positivamente con un indice di contenuto mitocondriale e valutata dall'attività della COX. Nello studio dell'apoptosi mediata dai mitocondri, gli animali a doppio knockout Bax e Bak hanno mostrato una ridotta importazione di proteine nella matrice mitocondriale.
Sei settimane di corsa della ruota volontaria hanno salvato il difetto di importazione in animali a doppio knockout. È importante considerare variabili come la durata della reazione di importazione e quale proteina deve essere importata. Le frazioni citosoliche possono essere incorporate nella reazione per capire come i fattori citosolici possono influenzare il tasso di importazione.
In alternativa, le proteine possono essere modificate prima dell'incubazione per capire come le proteine possono essere importate selettivamente. Questa tecnica può aiutare a comprendere le complesse eziologie delle miopatie mitocondriali che possono presentarsi in vari stati patologici.
