Vorrei ringraziare i miei colleghi a MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, per il loro sostegno e la loro guida negli anni. Vorrei anche ringraziare Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson per il loro aiuto con la funzionalità BDC3 nel software IDEAS , Ryan P. Jessup per contribuire a modificare questo manoscritto, Raymond Kong per aiuto nel giorno della ripresa e un ringraziamento speciale All&#39;artista trucco Cynthia Xamonthiene.

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Sono impiegato da MilliporeSigma, il produttore dell&#39;immagine ImageStream di Amnis, che è stato utilizzato in questo studio.

Quando si esegue questa analisi, ci sono alcune cose da considerare. È importante avere campioni di controllo appropriati. Per questo esperimento sono stati utilizzati due diversi controlli: Controllo e Controllo + Chloroquine. Il campione di controllo è stato utilizzato per impostare la soglia per le regioni. Rappresenta il livello basale dell&#39;autofagia senza interrompere il degrado lisosomico ed è il controllo del campione di Starved. Tuttavia, il campione di controllo non è un controllo appropriato da confrontare con i risultati del campione di Starved + Chloroquine, in quanto il clorochina influisce sul campione di controllo. Pertanto, è stato necessario avere un campione Control + Chloroquine. Prima di effettuare qualsiasi analisi per l&#39;autofag, è importante analizzare / portare solo su singole celle che sono in messa a fuoco (ad esempio, gradiente RMS maggiore di 60), in quanto i risultati potrebbero essere influenzati se c&#39;è più di una cella o le immagini sono sfocato. È fondamentale che l&#39;autofagoEs e lisosomi sono al centro per il rilevamento corretto dei punti e l&#39;analisi BDC3. Le cellule apoptotiche devono essere rimosse prima dell&#39;analisi dell&#39;autofagia, in quanto possono risultare incline e non devono essere incluse. Ci dovrebbe essere una colorazione appropriata per tutti e tre i marcatori (ad es. LC3, p62 e LAMP1). Ad esempio, tutti e tre i marcatori sono intracellulari e devono avere un segnale punctato; Se il segnale non è punctato, o se è sulla superficie della cella, la colorazione non sarebbe appropriata e l&#39;esperimento / colorazione dovrebbe essere rifatta. Inoltre, affinché la BDC3 sia accurata, è fondamentale portare le celle che sono luminose per tutti e tre i marcatori fluorescenti di interesse. È necessario disporre di eventi positivi per impedire la misura di BDC3 su manufatti non specifici, artefatti di imaging e / o rumore. Ciò è cruciale, poiché BDC3 può potenzialmente amplificare gli artefatti che non sono veri segnali. Poiché BDC3 può essere eseguito solo su eventi luminosi positivi, molte celle potrebbero non essere incluse nell&#39;analisi finale; Questo è especVale per le celle di controllo che non hanno alcuna accumulazione di LC3, p62 e / o LAMP1. Pertanto, una limitazione di questo test è che BDC3 esamina solo le cellule positive per tutti e tre i marker, che potrebbero non essere appropriati per tutti gli esperimenti di autofagia. Come il BDS, che è stato precedentemente riportato 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 da solo non tiene conto del numero di organismi di autofagia che co-localizzano, risultando in larga misura Di variabilità nel numero di autofosomi. Pertanto, l&#39;approccio bivariato presentato da Rajan et al. era impiegato. Guardando le trame bivariate, si potrebbe chiedere seLe cellule devono essere positive per LC3, p62 e LAMP1; Perché ci sono tante cellule che hanno 0 punti? Questo perché il segnale LC3 potrebbe essere abbastanza luminoso per la co-localizzazione, ma potrebbe non soddisfare la soglia impostata dalla maschera di picco (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessaria per essere considerata una individuare. Il protocollo qui presentato ha usato il MIFC per contare puncta LC3 e la co-localizzazione di tre marcatori autofagia per misurare il flusso autofagico. In condizioni basali (campione di controllo), il numero di autofagosomi era basso e alcune cellule sono state trovate con &quot;High Spots&quot;. Con l&#39;aggiunta di clorochina, che inibisce la fusione di autosfosi / lisosomi, si è verificato un aumento del numero di macchie LC3. Dal momento che il lisosoma non è in grado di abbattere l&#39;autofagogo e il p62, che risiede nell&#39;autofago, ciò porta ad un aumento della co-localizzazione dell&#39;accumulo di autolysosomi LC3, p62 e LAMP1. Questo effetto è stato amplificato sotto lo starvat nutrienteIone, che induce autofagia. Tuttavia, senza l&#39;aggiunta di clorochina, non vi è stato un aumento significativo del numero di autofosomi, probabilmente a causa di un aumento del tasso di turnover autofagico. Quando le cellule sono state affamate in presenza di clorochina, vi è stato un aumento della co-localizzazione e il numero di autofosomi, che supporta la conclusione che la fame aumenta il flusso autofagico. EBSS è noto per essere un potente induttore di autofagia. Pertanto, si prevede che l&#39;aumento sia grande. Se si utilizza un altro metodo, ad esempio l&#39;induzione di farmaci, per indurre l&#39;autofagia, la differenza tra i controlli e quelli trattati può essere più sottile. Questo particolare protocollo è stato progettato per misurare l&#39;autofagia nelle linee cellulari umane, ma il dosaggio potrebbe essere adattato ad altre specie passando ad anticorpi per quella particolare specie. Inoltre, il metodo di analisi potrebbe essere utilizzato per qualsiasi applicazione intracellulare che richiede la co-localizzazioneDi tre sonde / marcatori.

Macroautophagy, qui di seguito denominato autophagy, è un percorso catabolico in cui i componenti danneggiati o disfunzionali, le proteine ​​a lungo termine e gli organelli sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati 1 . L&#39;autofagia è un processo dinamico e multistep che coinvolge la formazione di un autofago; La fusione dell&#39;autofaggo con il lisosoma, formando l&#39;autolysosoma; E il degrado del contenuto dell&#39;autolysosoma 2 . Il marcatore biologico cruciale utilizzato per identificare l&#39;autofagia nei sistemi di mammiferi è la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3) legata alla microtubula, che costituisce la membrana autofagosomica. Durante l&#39;autofagia, LC3-1 citosolico è coniugato alla fosfatidiletiletanolo per formare LC3-II; LC3-II è quindi incorporato nella membrana autofosfoma 3 . Un altro marcatore ampiamente utilizzato per il flusso autofagico è il sequestosoma 1 del recettore autofagico (SQSTM1, p62) che fisicamente liNks cargo autofagico alla membrana autofagica 4 , 5 . I metodi tradizionalmente utilizzati per misurare l&#39;autofagia sono blots occidentali e microscopia a fluorescenza 7 . Tuttavia, nessuno di questi metodi è considerato come &quot;standard d&#39;oro&quot; , 2 , 6 poiché ci sono sfide associate a entrambe queste tecniche. Le macchie occidentali danno solo una media perché usano un campione omogeneo, in modo che gli osservatori non riescano a vedere cosa succede nelle singole cellule. D&#39;altra parte, la microscopia a fluorescenza dà informazioni a livello di singola cellula, ma manca di capacità di trasmissione, rendendo difficile ottenere valutazioni oggettive e statisticamente rigorose. Negli ultimi anni la misurazione di LC3 e p62 mediante citometria a flusso di imaging multispectrale (MIFC, vedi tabella dei materiali ) sta guadagnando popuLeggerezza dovuta al suo potere quantitativo, alle capacità di trasmissione elevata, al potenziale di multiplexing e alla capacità di immagine di ogni cella. Uno dei metodi più utilizzati per misurare l&#39;autofagia utilizzando il MIFC, insieme al software di analisi companion (vedi tabella dei materiali ), è attraverso il conteggio a spot di LC3 puncta o autofagosomi 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Tuttavia, un aumento degli autofosomi non implica necessariamente un aumento dell&#39;autofagia, in quanto potrebbe anche rappresentare un blocco nel processo 2 . Il fatturato LC3-II è un parametro utile per misurare il flusso autofagico analizzando le cellule in presenza eAssenza di un inibitore della degradazione lisosomiale, come la clorochina. Il clorochina inibisce la fusione dell&#39;autofaggoma al lisosoma, consentendo così la quantitazione della formazione di autofaggo come misura del grado di autofagia arrestando il flusso autofagico prima che possa verificarsi il degrado lisosomico 18 . Inoltre, p62 è degradato principalmente da autofagia, e se la degradazione lisosomiale della autofagosoma e il suo contenuto è bloccato, un accumulo di p62 è previsto 17, 19. L&#39;autofagia è un processo multistep e la misurazione di LC3 o p62 da solo non fornisce un quadro completo di ciò che sta accadendo nelle cellule. Le pubblicazioni recenti hanno sottolineato la necessità di esaminare la formazione concorrente dell&#39;autolysosoma 2 , 17 , 20 , 21 . Il MIFC èunica in grado di misurare la formazione della autolysosome dal imaging del co-localizzazione del autofagosoma al lisosoma 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Inoltre, è stata esplorata la co-localizzazione di p62 e LC3 utilizzando MIFC per misurare il flusso autofagico 5 . Nel software di analisi di riferimento, la &quot;funzionalità&quot; che misura la co-localizzazione è chiamata &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) ed è stata specificamente progettata per confrontare i piccoli dettagli luminosi di due immagini. BDS è il coefficiente di correlazione Pearson trasformato dal log con i punti luminosi localizzati con un raggio di 3 pixel o meno; In altre parole, il BDS calcola il grado di oConfronta pixel da due diversi canali fluorescenti. I punti luminosi sono correlati ( cioè, la stessa posizione spaziale) o non correlati ( vale a dire differenti posizioni spaziali). Pertanto, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l&#39;intervallo tra zero e infinito 26 , 27 . BDS da solo potrebbe non essere sufficiente; Rajan et al. Ha scoperto che l&#39;utilizzo di solo BDS potrebbe portare a risultati falsi positivi o falsi negativi 21 . BDS valuta la co-localizzazione di due marcatori di autofagia, ma non prende in considerazione il numero di autofosomi. Per tenere conto del numero di autofosomi, Rajan et al. Incluso il punteggio a punti della LC3 puncta 21 . Rajan et al. Ha proposto di utilizzare un diagramma di dispersione bivariato di punti spot LC3 contro BDS. Utilizzando questa trama bivariata, due popolazioni sono andateE in primo luogo identificato: uno con le cellule che hanno un alto livello di LC3 e uno con le cellule che hanno un basso livello di LC3 macchie. La popolazione a punti LC3 è stata ulteriormente classificata in due popolazioni: le cellule con bassa co-localizzazione ( ossia l&#39; accumulo di autofosomi) e le cellule con elevata co-localizzazione ( ossia l&#39; accumulo di autolysosomi). Questa trama bivariata permette di distinguere tra cellule con pochi autofosomi e cellule con un accumulo di autofosomi e / o autolysosomi 21 . Fino ad ora la co-localizzazione simultanea di LC3, p62 e LAMP1 (marker lizosomico) non era possibile utilizzando un singolo &quot;tipo di funzionalità&quot; nel software di analisi del companion MIFC (vedi tabella dei materiali ). Tuttavia, una nuova funzionalità, recentemente introdotta nella versione 6.1, si chiama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 confronta le immagini del dettaglio luminoso da ciascuna delle tre immagini (in questo caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica la co-localizzazione delle tre sonde ( es. LC3, p62 e LAMP1). La funzione BDC3 calcola il coefficiente di correlazione di Pearson modificato per estendersi a tre immagini. Poiché le macchie luminose nelle tre immagini sono correlate o non correlate, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l&#39;intervallo dinamico tra 0 e infinito. Attivando la funzione BDS con la funzione BDC3, il metodo di analisi presentato da Rajan et al. Ora possono incorporare i tre indicatori più utilizzati per misurare l&#39;autofagia in un unico sistema contemporaneamente. La capacità di co-localizzare questi tre marcatori di autofagia in un singolo dosaggio potrebbe portare a nuovi approfondimenti sull&#39;induzione e la regolazione dell&#39;autofagia. Il seguente protocollo descrive i passi per indurre l&#39;autofagia nelle cellule Jurkat; Etichettare le cellule con gli anticorpi LC3, p62 e LAMP1; Acquisire dati su un multispCitometro di flusso ectrale di imaging; E analizzare i dati per valutare il flusso autofagico.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

L&#39;autofagia è un percorso catabolico in cui i componenti cellulari normali o disfunzionali che si accumulano durante la crescita e la differenziazione sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati. Durante l&#39;autofagia, la proteina LC3 citoplasmatica viene lipidizzata e reclutata alle membrane autofagosomali. L&#39;autofaggo quindi si fonde con il lisosoma per formare l&#39;autolysosoma, dove si verifica la rottura della vescicola di autofagosoma e il suo contenuto. La proteina associata con ubiquitina p62, che si lega a LC3, è anche usata per monitorare il flusso autofagico. Le cellule sottoposte a autofagia dovrebbero dimostrare la co-localizzazione di marcatori p62, LC3 e lisosomiali. La microscopia immunofluorescenza è stata usata per identificare visivamente LC3 puncta, p62 e / o lysosomi su base per cellula. Tuttavia, può essere difficile ottenere una valutazione oggettiva e statisticamente rigorosa. Per ovviare a questi problemi, è stata utilizzata citometria di flusso multispectrale di imaging e una caratteristica analitica che confronta la luminosità(LC3, p62 e lysosomal LAMP1) e quantifica la loro co-localizzazione in combinazione con il conteggio dei punti LC3 per misurare l&#39;autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Questo metodo di analisi utilizza molteplici funzionalità per assaggiare il flusso autofagico. Per comprendere appieno la trama bivariata finale, bisogna prima studiare le caratteristiche di analisi individuale. Il conteggio degli autofosomi è un modo logico per misurare l&#39;autofagia; Tuttavia, la dimensione / forma / luminosità di LC3 puncta può variare drasticamente tra le celle. La variazione può rendere difficile il conteggio manuale di autofagozomi o l&#39;utilizzo di una funzione spot-count nel software di analisi. Pertanto, nessuna funzione di conteggio dei punti sarà perfetta a causa di questa grande variabilità in autofosomi. Tuttavia, una buona funzione di conteggio dei punti funzionerà sulla maggior parte delle celle 26 . La figura 3 mostra esempi di maschera spot di LC3 puncta nelle celle Jurkat usando differenti maschere spot. La funzione di conteggio spot selezionata per questo set di dati è Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, il che significa che la funzione di conteggio spot conta i punti che il peMaschera AK individuata all&#39;interno del canale predefinito 11 maschera (M11) sul canale 11 (Ch11-LC3-AF647) con un rapporto di sfondo spot-to-cell 4 (Bright, 4). La Figura 4 mostra istogrammi di conteggio spot e immagini rappresentative per il conteggio spot medio per le cellule Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-LC3-AF647. I conteggi spot di Controllo e Starving non sono significativamente diversi; Con l&#39;aggiunta di clorochina, c&#39;è una grande differenza nella media del Control + Chloroquine rispetto alla Starved + Chloroquine. La prossima funzionalità da indagare è BDC3. BDC3 è una misura della co-localizzazione di tre marcatori / sonde, in questo caso, LC3, p62 e LAMP1. La Figura 5A - 5D mostra gli istogrammi BDC3 per le cellule di Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. C&#39;è uno spostamento tra la media del Controllo e la media Starved, così come il Control + Chloroquine media alla media di Starved + Chloroquine. Tuttavia, guardando le immagini delle cellule dai punteggi medi di BDC3 nella figura 5E - 5H , c&#39;è una maggiore differenza tra i campioni che gli istogrammi possono portare a credere. Questo perché BDC3 non prende in considerazione il numero di organi di autofagia che co-localizzano, con conseguente grande variabilità del numero di autofosomi per lo stesso punteggio BDC3. Nella maggior parte dei casi, vi sono sovrapposizioni tra tutte le tre sonde perché, anche a livelli basali, p62, LAMP1 e LC3 dovrebbero in una certa misura co-localizzare o risiedere in regioni simili nelle cellule. In contrasto, un esempio di tre sonde che non dovrebbero essere co-localizzate sono il colorante nucleare anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e DAPI per il campione Starved + Chloroquine, mostrato in Figura 6. &lt;/ P&gt; Quando si combinano la funzione di conteggio dei punti e la funzione BDC3, è evidente la presenza di diverse sottopopolazioni che migliorano la capacità di distinguere tra i diversi campioni / condizioni. La figura 7 mostra la trama bivariata di conteggio spot di LC3 rispetto a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per i quattro campioni: Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine. Il campione di Controllo è stato utilizzato per impostare la strategia di gating per tre popolazioni: Low Spots, High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3. I campioni di controllo hanno dimostrato che più del 98% delle cellule avevano 1 o meno punti. Il limite tra le High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 è stato impostato su un punteggio BDC3 di 1 perché più del 91% del campione di controllo ha ottenuto un punteggio BDC3 inferiore a 1. Un riepilogo dei risultati dei plotter bivariati È mostrato nella tabella 1 . age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figura 1: Impostazione strumento MIFC. Uno screenshot delle impostazioni dello strumento MIFC utilizzato per questo esperimento descritto nel passaggio 8 del protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi Software Gating Strategy. Uno screenshot dello schema di analisi del software di analisi, descritto nel passaggio 9 del protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Maschera Spot LC3. Le immagini delle cellule Jurkat e le maschere utilizzate per creare la funzione di conteggio spot. Sono mostrati i picchi (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright 2) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5, 3, 1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6, 2, 1). La maschera che ha funzionato meglio per tutte le celle mostrate era Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figura 4: istogrammi LC3 di conteggio dei punti. Utilizzando la funzione Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e gli istogrammi di conteggio spot LC3-AF647 per controllo ( A , azzurro), Control + ChloroquinE ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). I conteggi spot medi per Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine sono rispettivamente 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77. Sono mostrati i controlli di controllo (punti E , 0), controllo + clorochina ( F , 1 spot), Starved ( G , 0 spot), e Starved + Chloroquine ( H , 3 spot). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figura 5: istogrammi BDC3 di p62 / LAMP1 / LC3. Istogrammi BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 perR Controllo ( A , azzurro), Control + Chloroquine ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). Il punteggio medio BDC3 per Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine è rispettivamente di 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 di cellule rappresentative per il BDC3 medio sono mostrate per Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) e Starved + Chloroquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figura 6: istogrammi BDC3 di p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine. ( A ) L&#39;istogramma BDC3 p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine è mostrato. Il punteggio medio BDC3 è 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (rosso); DAPI (blu); E un composito delle immagini p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI delle cellule rappresentative per il BDC3 medio è mostrato per il campione Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figura 7: Parti Bivariate di Count LC3 Spot Count nei confronti di BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parti bivariate di punti LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per le cellule di controllo, controllo + clorochina, fame e starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 provenienti da tre regioni ( cioè, punti bassi, alti punti / bassi BDC3 e High Spots / High BDC3) sono mostrati per il campione Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Cell Count </td><td> Bright Detail Colocalization 3 Medio </td><td> Punto di conteggio LC3 Mean </td><td> % Basso punto </td><td> % Alto punto / basso BDC3 </td><td> % Alto punto / alto BDC3 </td></tr><tr><td> Controllo </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0,07 </td><td> 98,2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Control + Chloroquine </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Starved </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31,0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Sommario del conteggio di punti Jurkat LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l&#39;autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

31.1K Views.  MilliporeSigma.  Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto. 

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Ricerca

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del rilascio di EV LC3-II-positivo nell'autofagia con fusione lisosomiale compromessa

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

Biochimica

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>Saggio basato sul flusso per l'identificazione di modulatori dell'autofagia per l'osteoartrite

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Saggio basato sul flusso per l'identificazione di modulatori dell'autofagia per l'osteoartrite

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Riepilogo

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Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

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