Il nostro protocollo consente di misurare la velocità di autofagia e attività proteasomale nei tessuti dei topi ed è abbastanza sensibile da rilevare variazioni circadiane all'interno di queste attività. Questa tecnica può essere utilizzata in vivo per valutare il catabolismo proteico in cellule e tessuti e i materiali richiesti sono relativamente a bassa tecnologia e accessibili a qualsiasi laboratorio di biologia molecolare. A dimostrare la procedura sarà Mikhail Ryzhikov, un post-doc del mio laboratorio.
Per quindici minuti prima di ogni punto di tempo, scaldare le soluzioni stock di leupeptina e bortezomib a temperatura ambiente e diluire il bortezomib scongelato in PBS sterile per produrre una soluzione di lavoro da 50 milligrammi per millilitro. Per la somministrazione dell'inibitore della proteasi, iniettare per via intraperitoneale 40 milligrammi per chilogrammo di leupeptina o 1,6 microgrammi per chilogrammo di bortezomib in ciascun animale sperimentale. Per un controllo negativo, iniettare topi con 0,5 millilitri di PBS.
Riportare ogni topo in gabbie raggruppate per il tipo di trattamento ricevuto man mano che vengono iniettati e registrare il tempo in cui i topi vengono trattati o manipolati in una tabella standardizzata. Due ore dopo l'iniezione, immergere il lobo epatico sinistro raccolto da ogni animale sperimentale sacrificato in sette millilitri di tampone di omogeneizzazione a freddo ghiacciato in tubi conici da 15 milliliter opportunamente etichettati sul ghiaccio. Una volta acquisiti tutti i campioni, trasferire il primo campione e l'intero volume del buffer di omogeneizzazione in un omogeneizzatore Dounce da 15 millilitri e omogeneizzare il campione con 10 tratti del pistone allentato e 15 tratti del pistone stretto.
Riportare l'omogeneato grezzo risultante nel suo tubo originale e omogeneizzare il campione successivo come appena dimostrato. Una volta omogeneizzati tutti i campioni, sedimentare i nuclei e i detriti omogeneizzati mediante centrifugazione e trasferire i primi quattro millilitri di ogni supernatante post-nucleare in nuovi tubi da 15 millilitri. Determinare la concentrazione proteica di questa prima frazione supernatante secondo protocolli standard ed equalizzare le concentrazioni di tutti i campioni a 2,1 milligrammi per millilitro con tampone di omogeneizzazione fresco, se necessario.
Per l'analisi a valle e il miglioramento della qualità, aliquota 500 microlitri delle frazioni proteiche totali normalizzate in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per meno 80 gradi Celsius. Trasferire 1,5 millilitri di ciascuna delle restanti frazioni proteiche totali in singoli tubi di microcentrifugo e pelletare i campioni proteici mediante centrifugazione. Trasferire un millilitro dei supernatanti della seconda frazione risultanti in nuovi tubi di microcentrifugo sul ghiaccio e aspirare i supernatanti rimanenti.
Lavare i pellet 3K due volte in 1,5 millilitri di tampone fresco di omogeneizzazione a freddo per lavaggio, quindi risospendare il pellet 3K in 200 microlitri di tampone campione SDS-PAGE e far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Ruotare i supernatanti della seconda frazione per 20 minuti a 20.000 x g e quattro gradi Celsius e trasferire i supernatanti della terza frazione citoplasmatica risultanti in un nuovo tubo di microcentrifugo. Per l'analisi SDS-PAGE, combinare 150 microlitri della frazione citoplasmatica con 50 microlitri di tampone campione 4x SDS-PAGE e far bollire i campioni di frazione citoplasmatica a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante rimanente dai pellet 20K e lavare i campioni due volte con 1,5 millilitri di tampone fresco di omogeneizzazione a freddo per lavaggio. Quindi rimospendare il pellet 20K in 100 microlitri di tampone campione SDS-PAGE per l'ebollizione a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Per l'analisi western blot, diluire serialmente le proteine della curva standard da uno a tre in 1x tampone campione per un totale di sei diluizioni e caricare 10 microlitri di ogni campione di curva standard in un pozzo di un gel midi da 26 ben quattro a 12%SDS-PAGE, quindi caricare uno standard di peso molecolare commerciale prestained.
Per misurare il flusso autofagico, caricare 12 microlitri di ogni campione di pellet 3K nei pozzi appropriati. Per misurare il flusso proteasomale, caricare 12 microlitri di ogni frazione citoplasmatica nei pozzi appropriati. Una volta caricati tutti i campioni di controllo e sperimentali, separare i campioni proteici da SDS-PAGE prima di trasferire le proteine su membrane fluorurate di polivinilidene secondo protocolli standard.
Per l'analisi del flusso macroautofagico, le membrane macchie contenenti i campioni di pellet 3K con anticorpo anti-p62 o anti-LcB durante la notte a quattro gradi Celsius. Per l'analisi del flusso proteasomale, le membrane macchie contenenti i campioni di frazione citoplasmatica con anticorpo poli ubiquitina anti-lisina 48-specifico durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi immagini le macchie occidentali usando anticorpi secondari standard e dispositivi di imaging.
Per eseguire misurazioni densitometriche su bande di interesse sia per la curva standard che per i campioni sperimentali, aprire un programma software di analisi delle immagini appropriato e disegnare un lungo rettangolo che comprenda il monomero proteico di interesse nella parte inferiore dell'immagine macchiata che si estende fino alla parte superiore della membrana. Copiare e incollare per spostare il rettangolo negli esempi rimanenti, mantenendo il rettangolo coerente tra i campioni. Salvare la quantificazione in un foglio di calcolo e generare una curva standard densitometrica all'interno del foglio di calcolo utilizzando il campione standard diluito in serie nella regressione lineare o polinomiale per ottenere un'equazione di curva standard più adatta.
Usando questa equazione, estrapolare la quantità dei monomeri di interesse all'interno dei campioni sperimentali. Per ottenere misurazioni del flusso, sottrarre la quantità proteica estrapolata di ciascun campione trattato dall'inibitore dal valore medio dei campioni PBS dallo stesso punto di tempo. Quindi valutare la significatività statistica della variazione temporale nel turnover proteico utilizzando ANOVA unizionale.
La lettura primaria per il flusso autofagico in un dato punto di tempo è la differenza nella quantità di marcatori specifici di macroautofagia tra la leupeptina trattata rispetto ai campioni fittizi nella frazione di pellet 3K arricchita di lisosomi diviso per due. Tipicamente, i risultati sono normalizzati alla media che semplifica il confronto tra esperimenti indipendenti. La nostra procedura per misurare il flusso proteolitico dipende dalla capacità della leupeptina o del bortezomib di causare l'accumulo di autofagia e substrati proteasome, che è un processo dipendente dal tempo.
Questa tecnica ha permesso di esplorare come i ritmi biologici programmano il catabolismo proteico epatico. Speriamo che spianerà la strada allo studio degli effetti della malattia sulle funzioni di pulizia cellulare.
