Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno da Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e dalla borsa DFG KH 376 / 1-1 assegnata a HK

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell&#39;Università di Cambridge. 1. Manutenzione degli animali <ol><li> Embrioni di rana NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l&#39;impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale. <ol><li> Preparare la soluzione soluzione modificata di Barth (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 e 4.1 μM CaCl2, pH 7,6 . </li><li> Ottenere embrioni di Xenopus laevis dalla fecondazione in vitro . <ol><li> Indurre l&#39;ovulazione nelle rane africane africane adulte ( Xenopus laevis) mediante iniezione con gonadotropina sierica di mare incinta una settimana (60 UI) e 12 h (500 UI) prima della posa dell&#39;uovo. </li><li> Raccogliere oociti e fertilizzarli in vitro con testicoli maschi omogeneizzati. </li><li> RaiSe embrioni in 0,1x MBS a 16 - 18 ° C. Stabilire gli embrioni secondo la tabella Normale di Xenopus laevis 14 . Prestate attenzione nella scelta di embrioni interi e vivi per l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol></li><li> Zebrafish embrioni NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l&#39;impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale. <ol><li> Preparare il medium embrionale: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4 e 0,00001% blu metilene. </li><li> Mantenere e generare il ceppo WT AB Danio rerio a 26,5 ° C. </li><li> Raccogliere gli embrioni alla mattina della fecondazione, sollevare fino a 4 giorni dalla fecondazione (dpf) a 28 ° C in mezzo ad embrione preparato come sopra descritto, selezionare e mettere come descritto in precedenza 15 . </li></ol></li></ol> 2. Induzione dell&#39;ipossia in vivo </p&gt; <ol><li> Costruzione della camera di incubazione del gas <ol><li> Utilizzare un serbatoio acquatico riproduttore ( Figura 1A ) che normalmente è utilizzato nella struttura dei pesci per la costruzione di camere ipossiche. Questo serbatoio dovrebbe montare una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Preparare una piastra a 24 pozzetti in mesh, come illustrato nella figura 1 . Rimuovere il fondo in plastica della piastra a 24 pozzetti ( figura 1B ), ad es ., Utilizzando una macchina di fresatura a tale scopo. </li><li> Riempire lo spazio tra la plastica dei pozzetti e le pareti della lastra con resina epossidica. Fissare il filtro in nylon ( Figura 1C ) con un diametro della maglia di 0,1-0,2 mm sulla plastica rivestita in resina e lasciare che la piastra sia completamente asciutta. </li><li> Una volta asciutta, trapano tre o quattro gallerie ( Figura 1D ) di lunghezza 10 mm e diametro 5 mm nelle pareti di piastre rivestite in resina e in rete. Collegare barre di plastica o teflon( Figura 1E ) di diametro appropriato e lunghezza 30 mm alle gallerie e posizionare la piastra nel serbatoio di scelta. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti in fondo alla rete nel serbatoio acquatico di scelta. Utilizzando tubi in silicone ( Figura 1F ), collegare un serbatoio a gas ( Figura 1G ) con la miscela O 2 / N 2 desiderata o un&#39;altra miscela di gas scelta a una valvola di distribuzione ( Figura 1H ) utilizzando un appropriato regolatore del gas (I) (BOC 200 bar). Qui si utilizzano serbatoi a gas contenenti una miscela di ossigeno al 5% e 95% N 2 negli esperimenti di ipossia qui presentati. </li><li> Regolare la portata dell&#39;ossigeno nel mezzo della camera a 0,0017-0,0019 metri cubi al secondo. In questa portata di gas, non si deve vedere alcun disturbo del mezzo nei pozzetti della piastra. <ol><li> A tale scopo utilizzare il regolatore a gas a due stadi ad alta purezza. Impostare il regolatore per ridurre la pressione interna di th(1000 - 2500 PSI) ad una pressione di consegna di 10 PSI durante l&#39;esperimento. Pertanto, in conformità alle specifiche di questo regolatore di gas, è stata raggiunta una portata pari a 0,00189 metri cubi al secondo durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Collegare il tubo in silicone e la valvola di distribuzione a un diffusore a disco in ceramica ( figura 1J ) all&#39;interno del serbatoio acquatico. Chiudere il serbatoio acquatico e sigillare con cura il coperchio, rivestendolo con grasso in silicone ( Figura 1K ) (confronta con la Figura 1 ). Se è necessaria una particolare temperatura non-ambiente, posizionare la camera ipossica in un incubatore di laboratorio di temperatura desiderata. </li><li> A seconda del tipo di embrioni utilizzati nell&#39;esperimento, riempire il serbatoio della camera ipossica con l&#39;apposito mezzo embrionale e iniziare a diffondere la miscela di gas attraverso il diffusore a disco in ceramica. Equilibrare per 10-15 min. </li><li> Dopo l&#39;equilibratura con la thE la miscela di ossigeno desiderata, misurare la concentrazione di ossigeno nell&#39;acqua usando una sonda ossimetrica o ossigeno. A questo scopo, utilizzare un ossimetro con l&#39;ossigeno disciolto e il sensore di temperatura in fibra ottica. </li></ol></li><li> Induzione di ipossia negli embrioni <ol><li> Selezionare con cura gli embrioni per l&#39;esperimento, utilizzare embrioni interi e vivi per l&#39;incubazione dell&#39;ipossia. Qui, noi embrioni di rana dello stadio 38 o zebrafish embrioni 4 dpf negli esperimenti presentati qui. </li><li> Posizionare i piatti di embrione nell&#39;incubatrice ( Figura 1K ) contenente la camera di incubazione del gas e lasciarli equilibrare alla temperatura dell&#39;incubatore. </li><li> Trasferire con cura gli embrioni nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti ( fig. 1B ) della camera di incubazione del gas, utilizzando una pipetta di plastica. Utilizzare sempre una pipetta di plastica per il trasferimento di embrioni durante tutto il protocollo. NOTA: ogni pozzetto di questa piastra può contenere in suA 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni di zebrafish di 4 dpf. Etichettare con attenzione i pozzetti se usi genotipi diversi. </li><li> Mantenere la camera di incubazione del gas sotto un&#39;infusione costante con la miscela di gas di scelta per 5 ore o per un tempo più lungo che si adatta all&#39;esperimento. Utilizzare una miscela di 5% O 2 e 95% N 2 qui. </li><li> Trasferire con cura gli embrioni dalla camera di incubazione del gas nel mezzo normossico corrispondente al tipo di embrione e procedere immediatamente con i passaggi 3 o 4. </li><li> Se è necessario un ulteriore trattamento normossico, trasferire con cura gli embrioni nel mezzo normoxico corrispondente al tipo di embrione. </li></ol></li></ol> 3. Controllo dell&#39;insufficienza di ipossia attraverso monitoraggio dei livelli HIF-1α <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione 0,4 mg / mL di MS222 in 0,1 x MBS. </li><li> Preparare il tampone di omogeneizzazione: Acquistare il buffer di analisi della radioimmunoprecipitazione (RIPA bUffer) per l&#39;omogeneizzazione del tessuto e integrare la quantità di tampone necessaria per l&#39;esperimento con l&#39;inibitore della proteasi ad una concentrazione finale di 1: 100 v / v. </li><li> Preparare soluzioni per Western blot. <ol><li> Preparare il tampone di carico del gel di Laemmli 4x: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerolo, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-mercaptoetanolo, 0,5% w / v Bromofenolo blu, 10 ml volume totale ddH2 O. </li><li> Preparare il tampone di esercizio 5x: 15 g di base Trizma, 72 g di Glicina, 5 g di SDS, 1 L di volume totale ddH 2 O. </li><li> Preparare il tampone di trasferimento: 2,66 g di base Trizma, 14,4 g di glicina, 200 ml di metanolo al 100%, volume totale di 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparare 10 volte TBST: 5 mL di 1 M Tris pH 8,0, 30 mL di 5M NaCl, 2,5 mL Tween 20, 1 L volume totale H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione di blocco: 4% in peso di latte scremato in polvere in 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Raccolta di tessuti <ol><li> Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS22216 , 17 e trasferirli in un tubo di reazione di plastica riempito con tampone di omogeneizzazione usando una pipetta di plastica. Usare 20 μL di tampone per embrione. Si noti che almeno 5 embrioni di rana dello stadio 38 o 7 embrioni zebrafish di 4 dpf sono necessari per determinare una significativa modifica dei livelli di proteine ​​HIF1α. </li><li> Omogeneizzare il tessuto utilizzando un appropriato omogeneizzatore di tessuti o un sonicatore. Rimuovere i detriti per centrifugazione (15 min; 13.000 xg; 4 ° C). <ol><li> In alternativa, dissectare le retine dagli embrioni rana anestetizzati 17 e omogeneizzare come sopra. Utilizzare 20 μl di tampone di omogeneizzazione per 10 retine. </li></ol></li><li> Portare il surnatante usando una pipetta denaturandola a 85 ° C per 5 min e completare il tampone di carico del gel di Laemmli fino a una concentrazione finale di 1x v / v ( ad esempio aggiungere 5 μl di tampone Laemmli 4x a 15 μl di homogenato). Usa questo supernatante per la WesO bloccare i campioni a -20 ° C. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Caricare i campioni preparati come descritto nella fase 3.2 su un gel prefabbricato del 12% in un sistema di elettroforesi usando un tampone di rotazione di 1x v / v. Utilizzare una scala proteica per determinare la dimensione delle proteine. Trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa (membrana da 0,45 μm) nel tampone di trasferimento per 1 ora imballata su ghiaccio a 4 ° C, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Bloccare siti di associazione non specifici che incubicano la membrana nel buffer di blocco per 60 min. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST. </li><li> Incubare la membrana in soluzione di anticorpi anti-HIF-1α coniglio e anti-α-tubulina del mouse, diluiti rispettivamente 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v nella soluzione di blocco, per 2,5 h alla RT. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST. </li><li> Per il rilevamento, incubare negli anticorpi coniugati HRP con anti-coniglio e capra anti-topo diluiti 1: 1000 v / v nella soluzione di blocco per 1 h.Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST e visualizzare la colorazione HRP usando un kit commerciale e una macchina sviluppatrice di scelta. </li><li> Quantificare la quantità di proteina HIF1α usando la quantificazione digitale. </li></ol></li></ol> 4. Monitoraggio della proliferazione cellulare in ipossia <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare una soluzione di 5 mM EdU nel mezzo di embrione di scelta. La soluzione può essere utilizzata immediatamente o in aliquota e conservata a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. </li><li> Preparare la salina fosfata-bufferizzata (PBS) o acquistare PBS da risorse commerciali. Autoclave per 10 minuti a 115 ° C. </li><li> Preparare soluzioni per la rilevazione dell&#39;incoronazione di EdU. <ol><li> Preparare la soluzione di fissazione: 4% v / v del 16% Soluzione di formaldeide in PBS. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio: 30% in peso di saccarosio in PBS. </li><li> Preparare PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS. </li><li> Preparare la soluzione di blocco: 10% v / v Serum di capra inattivato termicamente (HIGS) in PBST. </li><li> Preparare la soluzione DAPI: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubazione di embrioni in ipossia per l&#39;incorporazione di EdU <ol><li> Riempire la camera di incubazione del gas con 400-500 ml di soluzione di 5 mM EdU integrata con 1% v / v DMSO. Pre-equilibrare la soluzione con la stessa miscela di gas utilizzata nell&#39;esperimento per 15 minuti prima dell&#39;esperimento. Si noti che il volume della soluzione di incubazione può essere minimizzato mediante l&#39;aggiunta di aste più corte ( figura 1E ) alla piastra inferiore della rete. </li><li> Collegare il tubo del gas al cilindro di gas contenente una miscela di gas di 5% O 2 e 95% N 2 . Incubare la soluzione per 15 minuti. </li><li> Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per 2 ore. Ogni pozzetto può ospitare fino a 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni zebrafish 4 dpf. </li><li> Analizzare l&#39;embrioneS per l&#39;incorporazione di EdU. </li></ol></li><li> Corso di tempo dell&#39;incubazione embrionale in ipossia e incorporazione di EdU <ol><li> Riempire la camera di incubazione del gas con 500 ml di mezzo di embrione di scelta. Collegare la tubazione del gas al cilindro del gas contenente una miscela di gas del 5% O 2 e 95% N 2 e bilanciare il mezzo con la miscela di gas per 15 minuti. </li><li> Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per il periodo di tempo desiderato fino a 48 h. Negli ultimi 1 h, sostituire il mezzo embrionale con 5 mM EdU soluzione integrata con 1% v / v DMSO. </li><li> Trasferisci gli embrioni al piatto normoxico e analizza per l&#39;incorporazione di EdU. </li></ol></li><li> Rilevamento ed analisi di incorporazione di EdU <ol><li> Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS222. </li><li> Trasferire gli embrioni in un appropriato flaconcino di vetro e fissarlo incubando in soluzione di Fissaggio per 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in PBS. Trasferire con cura gli embrioni alla soluzione di saccarosio per la criocorrosione dei tessuti. Incubare per 4 ore o fino a che gli embrioni non si affondano sul fondo della fiala di vetro. </li><li> Incorporare gli embrioni nel mezzo incorporante (composto ottimale della temperatura di taglio). Bloccare i blocchi con embrioni immediatamente o conservare fino a 14 giorni a -80 ° C. </li><li> Cryosection i blocchi contenenti embrioni usando un cryostat. Raccogli le sezioni di 12 μm (embrioni di zebrafish) o 16 μm (embrioni di rana) sulle vetrini del microscopio e lasciar asciugare. Crioconduttori di processo immediatamente o conservare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. </li><li> Rileva l&#39;incorporazione di EdU mediante la colorazione immunofluorescenti usando un kit di chimica commerciale. Preparare la quantità di EdU Reaction Mix necessaria per il numero di criose nell&#39;esperimento, come descritto dal produttore. <ol><li> Per 500 μL di EdU Reaction Mix, utilizzare 430 μl di 1X EdU buffer di reazione, 20 μl di CuSO 4 , 1,2 μL di Alexa Fluor azide, 50 μl di additivo 1 X EdU tampone. </li></ol></li><li> Lavare le criose una volta con PBS per rimuovere il mezzo di incorporazione e 3 x 5 min con PBST per permeabilizzare il tessuto. Incubare le criose nella soluzione di blocco per 30 min. </li><li> Incubare le criose con la EdU Reaction Mix per 1 h e seguire 3 volte 10 minuti di lavaggio in PBST. Conservare le criose con soluzione DAPI per 15 minuti, seguite da 3 x 10 min di lavaggio in PBST. Montare le diapositive con criose colorate in un supporto di montaggio, coprire con coperchio e lasciare asciugare prima di analizzare sotto un microscopio fluorescente o conservare a 4 ° C per un periodo di 1 anno. </li><li> Analizzare le criose con la colorazione anti-EdU sotto un microscopio di scansione confocale invertito e determinare il numero di cellule EdU-positive utilizzando la quantificazione digitale. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui abbiamo presentato un nuovo metodo semplice ma robusto per indurre l&#39;ipossia che è regolato per l&#39;uso con embrioni di rana e zebrafish, ma può anche essere adatto ad altri organismi acquatici. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella semplicità e nell&#39;efficienza dei costi. Tuttavia, i risultati ottenuti con questo metodo sono molto robusti. Abbiamo dimostrato che l&#39;ipossia può essere efficacemente indotta nella camera sia in embrioni interi che in tessuti specifici - qui, retinas. ...

La ricerca di ipossia ha numerose applicazioni. Questi includono indagare la patogenesi e sviluppare trattamenti per le condizioni mediche caratterizzate da ipossia 1 e malattia acuta di alta altitudine 2 . Lo stress ipossico provoca importanti cambiamenti metabolici in tutti gli organismi che richiedono ossigeno. Lo stress ipossico influenza anche la crescita fetale e lo sviluppo e la patogenesi di diverse malattie umane, inclusa la restrizione intrauterina della crescita 3 . Lo stress ipossico non può solo portare a ridurre il peso alla nascita, la mortalità fetale e neonatale, ma può anche provocare molte complicazioni nella vita adulta, come la malattia cardiovascolare, il diabete di tipo 2, l&#39;obesità e l&#39;ipertensione 4 . Lo stress ipossico è spesso osservato durante lo sviluppo del tumore solido, quando il tessuto tumorale supera la sua offerta di sangue. È quindi fondamentale poter studiare gli effetti dell&#39;ipossia in vivo e direttamente durante l&#39;embr<html> Lo sviluppo yonic. Tra i metodi più noti che sono stati utilizzati per studiare gli effetti dell&#39;ipossia durante lo sviluppo è l&#39;impiego di cloruro di cobalto nel mezzo di crescita o l&#39;incubazione dell&#39;organismo in una camera ipossica. La cloruro di cobalto induce artificialmente una reazione ipossidica alla normale concentrazione di ossigeno, a causa del suo ruolo nella stabilizzazione di alfa (HIF-1α) di fattore-1 indotta da ipossia, impedendo il degrado proteosomico 5 , 6 , 7 . Tuttavia, essendo un metodo conveniente 8 , l&#39;uso di cloruro di cobalto e altri simili mimetici di ipossia chimica possono avere effetti deleteri non specifici sulle cellule e sui tessuti, ad esempio l&#39; apoptosi 9 . Di conseguenza, le camere ipossiche sono un metodo migliore per l&#39;induzione di &quot;ipossia naturale&quot; negli organismi viventi attraverso il corso di uno sviluppo normale. Ntent &quot;&gt; Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un sistema per l&#39;induzione di ipossia negli embrioni animali acquatici, sia le rane che gli zebrafish che sono diventati degli organismi modello vertebrati informativi per studi di numerosi processi biologici, nonché modelli per varie malattie umane. Sviluppare ulteriormente, eliminando la complicazione della compensazione materna Inoltre, un rapido sviluppo dello sviluppo consente di manipolare i fattori ambientali e di osservare i cambiamenti fenotipici nella formazione degli organi in tempo reale. Inoltre, molti componenti dei principali percorsi di trasduzione del segnale sono altamente conservati Questi organismi di modello sono stati caratterizzati in dettaglio da un ampio volume di letteratura. Il principale vantaggio nell&#39;uso delle rane e degli embrioni di zebrafish per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sullo sviluppo del vertebrato è che tutti i processi possono essere monitorati direttamente, in quanto l&#39;ossigeno penetra rapidamente negli embrioni. Così, in rane e zebrafish, come in contrasto con altri organismi di modello comeEmbrioni di topi, l&#39;influenza di una specifica concentrazione di ossigeno può essere studiata nel tessuto di interesse, senza prendere in considerazione la presenza o la mancanza di vascolarizzazione funzionale. La maggior parte delle configurazioni commercialmente disponibili per l&#39;incubazione ipossica presenta lo svantaggio di essere comparabilmente grandi e avendo così elevati costi di funzionamento. Oltre al loro elevato costo iniziale e al consumo di gas, l&#39;equilibratura e la manutenzione di camere comuni di ipossia richiedono l&#39;assunzione di un&#39;atmosfera ipossica costante contro il gradiente del gas che si verifica naturalmente in queste camere a causa della loro dimensione e / o respiratorio dell&#39;organismo. Ciò richiede l&#39;impiego di ventilatori a gas e di un sistema di raffreddamento, che aumenta la quantità di apparecchiature necessarie aggiuntive, ostacola la destrezza del ricercatore e in generale diminuisce la semplicità della procedura sperimentale. Al contrario, l&#39;installazione che presentiamo qui è comparabilmente robusta ma molto conveniente, piccola, facile da stabilire e permette fL&#39;equilibratura del gas, l&#39;atmosfera ipossica stabile e lo scambio semplice di materiali e soluzioni all&#39;interno della camera. Il nostro sistema può essere utilizzato per l&#39;utilizzo con qualsiasi organismo di interesse acquatico. Abbiamo costruito una camera ipossica che è convenientemente piccola e quindi può essere collocata all&#39;interno di un incubatore di laboratorio comune, che consente facilmente le procedure sperimentali a qualsiasi temperatura specifica. Fornire un comodo controllo della temperatura e la concentrazione di ossigeno nel mezzo, il vantaggio del nostro sistema contro gli incubatori di ipossia commercialmente disponibili risiede nella sua ridotta dimensione e nell&#39;efficienza dei costi. Quindi, la nostra configurazione può essere creata usando le forniture di laboratorio disponibili per la maggior parte dei laboratori di ricerca e non richiedono materiali costosi. Inoltre, la nostra configurazione non genera calore, a differenza degli incubatori di ipossia commercialmente disponibili e consente l&#39;utilizzo a temperature inferiori alla temperatura ambiente in un incubatore. La laSt è particolarmente importante per il lavoro con organismi sangue freddi come rane e pesci dove i tassi di sviluppo e metabolismo sono fortemente dipendenti dalla temperatura. Essendo molto conveniente e facilmente costruito, la nostra camera di incubazione del gas è tuttavia molto versatile nella determinazione di diverse condizioni ipossiche o iperossiche, oltre a consentire una gestione rapida e facile di diversi supporti e soluzioni per un vasto numero di condizioni sperimentali. Inoltre, impiegando una piastra a 24 pozzetti invece di piatti comunemente usati o serbatoi di laboratorio 10 , 11 , 12 , il nostro sistema consente di osservare e sperimentare contemporaneamente diverse condizioni mutanti. Per controllare la corretta induzione dell&#39;ipossia, abbiamo monitorato i livelli della proteina HIF-1α mediante la rilevazione Western blot. Inoltre, il numero di cellule proliferanti prima e dopo l&#39;incubazioneN nella camera ipossica può essere utilizzato per determinare se l&#39;ipossia è stata indotta nel tessuto. Questo metodo si basa sui nostri risultati pubblicati in precedenza 13 , mostrando che la proliferazione nella nicchia delle cellule staminali del retino embrionale diminuisce dopo l&#39;induzione dell&#39;ipossia. Così abbiamo monitorato il livello della proliferazione delle cellule staminali retiniche aggiungendo l&#39;5-etinil-2&#39;-deoxyuridine (EdU) al mezzo embrionale e misurando la sua incorporazione nel DNA delle cellule appena proliferanti.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Qui introduciamo un nuovo sistema per l&#39;induzione di ipossia, che abbiamo sviluppato per studiare gli effetti dell&#39;ipossia negli organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema comprende una camera con una semplice configurazione che è tuttavia robusta per indurre e mantenere una specifica concentrazione e temperatura di ossigeno in qualsiasi soluzione sperimentale di scelta. Il sistema presentato è molto efficace in termini di costi, ma altamente funzionale, permette l&#39;induzione e il sostegno di ipossia per esperimenti diretti in vivo e per vari periodi di tempo fino a 48 ore. Per monitorare e studiare gli effetti dell&#39;ipossia, abbiamo impiegato due metodi: la misura dei livelli di fattore 1alpha (HIF-1α) inducibile all&#39;ipossia in embrioni interi o nei tessuti specifici e la determinazione della proliferazione delle cellule staminali retiniche mediante 5-etinil-2&#39;- Deoxyuridine (EdU) nel DNA. I livelli HIF-1α possono servire da indicatore di ipossia generale in tutto l&#39;embrione o il tessutoDi scelta, qui retina embrionale. L&#39;incorporazione di EdU nelle cellule proliferanti della retina embrionale è un&#39;uscita specifica dell&#39;induzione di ipossia. Così abbiamo dimostrato che i progenitori ematici retinici ipossici diminuiscono la proliferazione entro 1 ora di incubazione sotto il 5% di ossigeno di entrambi gli embrioni di rana e zebrafish. Una volta acquisita, la nostra configurazione può essere impiegata per l&#39;utilizzo con piccoli organismi del modello acquatico, per esperimenti diretti in vivo , in un determinato periodo di tempo e in concentrazione normale o ipossidica o iperossica o sotto qualsiasi altra miscela di gas.

L&#39;impiego del sistema ipossidico a camera che presentiamo consente di studiare gli effetti dell&#39;ipossia individualmente e in vivo in tutti gli animali vivi. L&#39;ipossia può essere indotta mettendo interi rana o zebrafish nella camera ipossica ( Figura 1 ) e intraprendere diverse combinazioni di condizioni. Un&#39;immagine della nostra configurazione camera a gas completata è mostrata in Figura 2 . Abbiamo mo...

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l&#39;induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l&#39;efficacia dell&#39;ipossia.

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Views.  University of Cambridge.  Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l'induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l'efficacia dell'ipossia. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologia

Studiare lo sviluppo con la manipolazione della segnalazione optogenetica nel pesce zebra

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autore in primo piano: Manipolazione della segnalazione negli embrioni di zebrafish per decodificare le decisioni sul destino cellulare 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neuroscienze

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Riepilogo

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Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

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