Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DP2OD008470.

Le procedure per l&#39;utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università di Notre Dame. Soluzione Preparazione di 1. Ringer <ol><li> Fare una soluzione di 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2, e 5 mm con Hepes ultrapuro H 2 O attraverso una continua agitazione per evitare qualsiasi precipitazione di sali. </li><li> Dopo aggiunta di sali e mentre la soluzione è ancora agitazione, aggiungere 100 unità / mL di penicillina per e 100 mg di streptomicina per ml. </li><li> Dopo aver aggiunto tutti gli antibiotici e sali, effettuare Filtro sterilizzante della soluzione e conservare in contenitore sterile. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU possono essere aggiunti alla soluzione di Ringer di bloccare la formazione di pigmento in perline embrioni impiantati senza conseguenze negative per la salute embrione. Per preparare la soluzione di blocco / pigmentazione di Ringer, utilizzare un concenzione del 0,003% PTU. A causa della bassa concentrazione di PTU da aggiungere si consiglia un volume maggiore di soluzione di Ringer essere fatta almeno 1 L, per evitare di aggiungere minuscole quantità di polvere PTU. Aggiungere PTU durante il passaggio 1.2, mentre la soluzione si agita. </li></ol> 2. Tricaine Soluzione Preparazione <ol><li> Aggiungere 2 g di etil 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaine) per l di soluzione più 0,1 M Tris, da uno stock 1 M equilibrata a pH 9,5 fornito con ultrapura H 2 O. Nota: Tricaine sarà utilizzato euthanize gli embrioni zebrafish al punto di tempo desiderato per eseguire il test del branello fenotipi impianto. </li></ol> 3. E3 Soluzione Preparazione <ol><li> Fare una soluzione di 0,25 M NaCl, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, e 16,6 mM MgSO 4 a 1 L di acqua ultrapura per creare 1 L di E3. </li><li> Aggiungere 200 ml di blu di metilene alla soluzione E3 per inibire la crescita fungina. </li></ol>4. Aghi Pulling per Microbead Transfer <ol><li> Utilizzare Sfaccettate vetro borosilicato con filamento ad un OD: 1,0 mm ID 0,5 mm, una lunghezza di 10 cm. </li><li> Posizionare il vetro borosilicato in un estrattore micropipetta per preparare aghi sottili. Nota: I seguenti quattro dimensioni può essere utilizzato come punto di partenza per tirare gli aghi: Calore = 540, Pull = 245, velocità = 200, e ora = 125. </li><li> Dopo aver tirato un numero adeguato di aghi, conservare in plastica coperto petri piatti, posizionate su strisce di pasta modellabile o nastro adesivo per evitare la rottura della punta dell&#39;ago, fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per tagliare la punta dell&#39;ago per il diametro desiderato, utilizzare un paio di pinze sottili a segnare la fine dell&#39;ago. Nota: Ago diametro varia a seconda delle dimensioni microbead essere utilizzato così come preferenze Gestione utente. Un buon punto di partenza è quello di diametri mestiere in un range tra 100 e 200 micron se saranno utilizzati microperle che vanno 50-100 micron. </li><li> Prior da utilizzare, inserire l&#39;ago tagliato nel supporto tubo capillare di moda lo strumento di trasferimento microperla completato. </li></ol> 5. Baffo / Lash Preparation Tool <ol><li> Ottenere un soffio, scatenarsi, o un altro piccolo pezzo ma ferma di filamento capelli naturali o sintetici. Tagliare vicino alla base del filamento ad un angolo di 45 °. Rispettare il baffo di un P-1000 micropipetta punta usando permanente chiaro colla adesiva. </li></ol> 6. microperla impianto Tray Preparazione <ol><li> Mescolare 2 g di agarosio con 100 ml di soluzione E3 per fare un E3 gel di agarosio al 2%. </li><li> Riscaldare la soluzione di agarosio al 2% per 1 min e 30 sec in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, agitando il matraccio ogni 30 secondi per evitare il gel dalla traboccante. </li><li> Prendere il coperchio di una x 15 mm di Petri 60 mm e posizionarlo in un grande 150 millimetri piatto x 15 mm con l&#39;interno rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Versare il gel caldo nella x 15 mm Petri 150 mm, avendo cura di ancorare giùil coperchio del piatto più piccola con il dito indice. Nota: Consentire un sottile strato di agarosio al di sotto del coperchio del piatto più piccolo per rimuovere la condensa che si forma quando si versa il gel; questo renderà le perle più facile vedere al microscopio dissezione. </li><li> Come l&#39;agarosio si raffredda, ma prima che si solidifica, posizionare uno stampo ben sul gel. Ciò consentirà per facilitare il posizionamento degli embrioni. </li><li> Nota: Per evitare bolle nei pozzetti, posizionare lo stampo lentamente con un angolo fino a che galleggia sulla superficie del gel. </li><li> Utilizzando un microspatula, rimuovere con attenzione lo stampo bene una volta il gel si è solidificato. Aggiungere la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 7. embrioni Collection <ol><li> Preparare le camere di accoppiamento, separati da divisori, da essi riempiendo d&#39;acqua il sistema, e poi mettendo maschio adulto zebrafish (s) e (s) coppie di sesso femminile nelle camere di O / N. </li><li> Raccogliere uova fecondate con un colino rete metallica (stadi embrionali possono variare leggermente). </li><li> Depositare le uova fecondate in una, dieci centimetri di diametro piatto di Petri pulita ruotando il filtro a testa in giù e risciacquo con un bel flusso di E3 finché non ci sono le uova rimaste nel colino, e ci circa 25 ml di soluzione E3 nel piatto. </li><li> Dopo la raccolta, dividere le uova in diversi piatti (circa 50-60 uova per piatto) per evitare il sovraffollamento, che potrebbe condurre a asincronia di sviluppo all&#39;interno della frizione e rendere la raccolta di momenti desiderati punti difficili. </li><li> Incubare gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 ° C per consentire la valutazione dello sviluppo secondo la serie messa in scena zebrafish standard a 40. Nota: Gli embrioni devono essere trasferiti E3 / PTU a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per prevenire lo sviluppo di pigmento se manipolazioni nelle fasi più anziani richiedono chiarezza ottica. </li></ol> 8. Bead impianto <ol><li> Incubare le microsfere di concentrazione di prova molecola desiderata o al veicolo corrispondente soluzione per il tempo necessario a un volume adeguato. Nota: Il ricercatore può utilizzare piastre sterili vanno 3-6 cm di diametro, o piastre a più pozzetti, entrambi i quali consentono la visualizzazione delle microsfere all&#39;interno della soluzione. Il tempo può variare a seconda del tipo e della quantità di molecola di interesse, e il ricercatore dovrebbe riferirsi fabbricante o raccomandazioni pubblicate per durata dell&#39;incubazione e altri aspetti come la sensibilità alla luce e temperatura. </li><li> Una volta che gli embrioni hanno raggiunto il punto di tempo di sviluppo desiderato, rimuovere gli embrioni dai loro chorions utilizzando una pinza sottile. </li><li> Incubare gli embrioni nella soluzione Ringer filtrata con antibiotici per 10 minuti per loro ambientarsi alla soluzione. </li><li> Mentre gli embrioni sono acclimating, trasferire le microsfere nella piastra microbead annidato all&#39;interno del vassoio impianto e sciacquare in soluzione Ringer per 10 min. Nota: Impianto le perle a meno di 50 minuti dopo aver raggiunto questo punto. Questo will diminuire la probabilità che uno impiantare un cordone con una minore concentrazione della molecola di interesse. </li><li> Array gli embrioni nei pozzetti del vassoio microbead impiantazione, avendo cura di orientarle quindi la zona di interesse in cui la microbead sarà impiantato è accessibile. </li><li> Fai una piccola incisione sull&#39;embrione utilizzando l&#39;ago di tungsteno. </li><li> Trasferire una microbead sul embrione utilizzando la pipetta di trasferimento microcapillare: premendo il bulbo della pipetta, tirare delicatamente il microbead nella colonna capillare, e poi rilasciare la pressione per trasferire il microbead alla destinazione desiderata. </li><li> Utilizzare lo strumento basette / sferza per posizionare il microbead all&#39;interno dell&#39;embrione. Nota: Assicurarsi di posizionare il microbead nel tessuto lontano dal sito di incisione in modo che il microbead non sarà espulso dal embrione come si guarisce. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nel secolo scorso, la comprensione del piano corpo patterning e organogenesi ha subito progressi monumentali. Tecniche di manipolazione dei tessuti erano critici nello scoprire informazioni chiave su questi processi vitali. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per l&#39;accertamento funzione dei geni, e metodi di analisi mosaico, come il trapianto di cellule, fornisce approcci utili a comprendere l&#39;autonomia della funzione del gene. Impianto microperla fornisce un altro luogo per interrogare come le molecole particolare alterare le dinamiche evolutive, in quanto questo metodo consente al ricercatore di alterare un ambiente del tessuto locale con l&#39;introduzione di molecole di segnalazione o inibitori. Una gamma di microsfere sono disponibili in commercio, che hanno varie dimensioni e altre proprietà fisiche esistere (ad esempio, carica) tale che essi possono essere impiegati per le condizioni sperimentali di interesse. Così, impiantando microsfere che sono immersi in una proteina o chimicocal di interesse all&#39;interno di un organismo, i ricercatori possono studiare gli effetti localizzati durante lo sviluppo e trovare le associazioni tra il gene o molecola di interesse e particolare fenotipo biologico (s). Studi come quello eseguito da Wada e colleghi hanno utilizzato microperla l&#39;impianto al fine di valutare l&#39;effetto di un aumento Hedgehog in patterning scheletrico neurocranio anteriore (ANC) in zebrafish 23. Studi precedenti hanno dimostrato che Shh è necessario per la formazione ANC 14. Uso microsfere Shh rivestite ricercatori hanno identificato che questo segnale promuove la formazione della cartilagine nell&#39;ANC. Il processo di impianto microperla è stato utilizzato per dimostrare un chiaro legame tra segnalazione Hedgehog e la formazione di cartilagine dell&#39;ANC. Un altro esempio chiave di questa tecnica manipolazione dei tessuti in zebrafish è osservata in studi in cui gli scienziati hanno studiato il controllo trascrizionale del Erythroblastoma ventisei (ETS) dominio fmolecola attori ETS relative (Erm) e Polyoma enhancer attivatore 3 (Pea3) di FGF signaling durante le prime fasi di sviluppo del cervello zebrafish 19. Attraverso esperimenti di impianto microperla, sono stati in grado di dimostrare che Fgf8 e FGF3 possono ectopicamente attivare l&#39;espressione di ERM e pea3. Questi esempi illustrano l&#39;utilità di microsfere di fornire informazioni sui meccanismi di sviluppo che collaborano durante la formazione del tessuto, che possono essere ben caratterizzato dall&#39;utilizzo di metodi per valutare l&#39;espressione genica 41. Così, il trapianto microbead può essere un metodo praticabile per esplorare altri tessuti, come il mesoderma intermedio (IM) che dà origine al rene. In particolare, sarebbe di aiuto negli studi di sviluppo renale, per indagare come le diverse molecole influenzano nefrone segmentazione 42 e tubulogenesi 43,44, processi che sono solo superficialmente compresi attualmente. Inoltre, microbead impianto è già iniziato ad essere utilizzato al montanteprocessi y rigenerazione in zebrafish 29] e potrebbero essere adattati per l&#39;utilizzo con qualsiasi numero di modelli di rigenerazione di organi, come ad esempio in seguito ablazione laser dei tessuti embrionali, come il nefrone 45 o in combinazione con metodi che sono stati formulati per eseguire la ricerca con le corrispondenti strutture per adulti 46-49. Infine, microbead impianto ha il potenziale per essere utilizzato in modelli di malattie umane, come il cancro 50,51 o tessuto degenerazione 52,53. Nel presente protocollo, dimostriamo il metodo di microbead impianto in embrioni di zebrafish, che è anche stato simile descritto da altri ricercatori, ma non dimostrato, attraverso protocolli di video 1. Con la pratica minimo siamo stati in grado di impiantare microsfere ad una velocità di circa 8-10 embrioni / h, che mette in relazione la fattibilità di questa procedura una volta che il ricercatore ha una certa esperienza. I risultati riportati nel presente documento dimostrano che perle di vari dimensioni possono essere impiantati nelle fasi iniziali, e che con cura, questa tecnica manipolazione dei tessuti possono essere implementati con minimo impatto fisico per l&#39;embrione. Un miglioramento che va sottolineato è l&#39;uso di uno strumento basette / ciglia posizionarla microbead nell&#39;embrione. Questo pezzo relativamente economico e semplice di apparecchiature è circa lo stesso diametro del microperla, è facile da ottenere e aiuta a velocizzare il processo di impianto. Il baffo / sferza può essere tagliato alla lunghezza desiderata per la produzione di una ditta e delicato strumento-tallone gestione, a seconda del ricercatore destrezza e la preferenza. Infine, mentre abbiamo descritto qui come manipolare fisicamente microsfere ed embrioni di zebrafish per eseguire l&#39;impianto, questo protocollo non delineare specifiche procedure di gestione per i farmaci o peptidi diversi. In generale, microsfere trattate chimicamente devono essere impiantati nell&#39;animale con espedienti, per evitare effetti indesiderati in altre aree dell&#39;organismo, e ricercatori dovrebbero essere largoformata sui possibili problemi di sicurezza associati a tali sostanze chimiche prima di iniziare i loro studi. In sintesi, abbiamo dimostrato un metodo microbead impianto relativamente semplice ed efficiente con una vasta gamma di applicazioni che utilizzano materiali che sono facilmente disponibili in laboratorio. In definitiva, ci auguriamo che questo manuale sarà di aiuto ai ricercatori la delicatezza di manipolazione dei tessuti zebrafish.

I ricercatori di biologia dello sviluppo utilizzano una vasta gamma di metodi di cellulari, molecolari e genetici per scoprire i meccanismi che controllano come si forma un organismo. Tra questi approcci, manipolazione dei tessuti è uno strumento chiave nel decifrare questioni complesse circa il destino della cellula, il movimento cellulare, e l&#39;organizzazione dei tessuti. Un modo per alterare ambienti locali tissutali è attraverso l&#39;applicazione chirurgica di microsfere che sono utilizzati per fornire una sorgente focale di proteine ​​o altre molecole di segnalazione 1. Questo tipo di manipolazione sperimentale è stato ampiamente implementato in classici modelli embriologia vertebrati, come la rana e pulcino 2. Il pesce zebra è diventato un importante organismo modello vertebrato per lo studio della organogenesi e fornisce anche molti vantaggi unici per la modellazione malattia 3-5 in quanto condividono la conservazione genetica alto con gli esseri umani 6. In particolare, la trasparenza ottica ed exsviluppo Ternal dell&#39;embrione zebrafish offre un punto di vista senza pari per l&#39;osservazione del tessuto ontogenesi 3-5. La realizzazione di schermi genetici forward grandi ha generato un potente repository di ceppi mutanti zebrafish per ulteriori studi 7,8, e l&#39;identificazione di tecniche di screening alternativi che possono essere efficacemente condotta a scala ridotta in singoli laboratori 9,10. Ulteriore lavoro sperimentale con zebrafish è stata facilitata grazie ai progressi nelle metodologie transgeniche e invertire approcci genetici 11,12, così come la genetica chimici 13-15. Tecniche di manipolazione dei tessuti, come la realizzazione di microsfere, non sono stati così ampiamente impiegato nel zebrafish, ma comunque fornire uno strumento utile per comprendere ulteriormente la segnalazione delle cellule durante lo sviluppo. Microperla impianto è stato utilizzato per interrogare i processi di formazione dell&#39;organo nella retina zebrafish16,17, 18 cuore, il cervello 19-22, neural crest 23, e fin 24,25. In questi ed altri studi, perline sono state applicate durante lo sviluppo per comprendere la diffusione delle molecole di segnalazione 26, come gradienti influenzano migrazione cellulare 27 e assiale patterning 28. Più recentemente, microsfere sono stati utilizzati per valutare i meccanismi di rigenerazione in adulti zebrafish 29. Negli studi di sviluppo, ad esempio, il lavoro microperla zebrafish ha fornito informazioni sui meccanismi di formazione degli arti attraverso studi della pinna pettorale 25. Il pesce zebra pettorali germoglio pinna è omologa al germoglio arti anteriori nel topo 30 e pulcino 31. La gemma vertebrati arto ha due nodi fondamentali di segnalazione: la zona di attività polarizzante (ZPA), che stabilisce l&#39;asse anteriore-posteriore attraverso l&#39;espressione di Sonic hedgehog (Shh) ea valle geni bersaglio Hox,e la cresta ectodermica apicale (ARE) presente sulla punta della gemma dell&#39;arto, che agisce per stabilire prossimale all&#39;identità distale degli arti attraverso l&#39;espressione di fattori di crescita dei fibroblasti (Fgfs). Con l&#39;impianto di microsfere Fgf imbevuti in zebrafish mutanti genetici Shh, investigatori identificato Fgf come essenziale per la progressione del ciclo cellulare e la crescita dell&#39;arto vertebrati 25. In aggiunta a FGF e Shh cascate di segnalazione che stabiliscono identità posizionale, studi pionieristici utilizzando la gemma pulcino arto identificato acido retinoico (RA) come una molecola che potrebbe mimare l&#39;azione della regione polarizzatore per stabilire anteriore a posteriore identità 32. Questi esperimenti coinvolti mettendo piccole strisce di carta Whatman RA-impregnato nella arto pulcino di valutare cifre patterning 32. Inoltre, i ricercatori hanno eseguito altri studi eleganti che impiegano l&#39;uso di microsfere, trapianto di cellule, ed esogenoTrattamenti RA in zebrafish per determinare che RA agisce per fornire a lungo raggio spunti di posizione all&#39;interno romboencefalo zebrafish e mesoderma 28. Tuttavia, attualmente molte domande rimangono circa i ruoli di segnalazione fattori come Fgf e RA durante numerosi aspetti dello sviluppo dei vertebrati. Gli effetti di segnalazione di RA, che agisce come un morfogeno, incidono molti organi 33, come il cuore lo sviluppo 34 e progenitori renali, dove RA specifica cellule renali prossimali tipo destino 35-39. Ulteriore comprensione di tali argomenti potrebbe beneficiare in modo significativo da studi sperimentali che utilizzano tecniche di manipolazione dei tessuti e microperla impianto. Mentre meno studi sono stati condotti con microperla impianto in zebrafish, rispetto a modelli come il pulcino, quelli che sono stati eseguiti sono stati altamente informativo. Uno dei motivi per la scarsità di microbead impianto-ricerca con sede nell&#39;embrione zebrafish è likely la nozione che ci sono difficili sfide tecniche, in base alle dimensioni dell&#39;embrione, che costituiscono un impedimento per eseguire con successo tali manipolazioni. Tuttavia, microbead impianto in embrioni di zebrafish può essere apprese con la pratica e assistito attraverso l&#39;osservazione visiva della tecnica, e quindi può essere perseguito come un mezzo per interrogare i meccanismi di sviluppo. Qui, dimostriamo l&#39;applicazione precisa di una microbead nell&#39;embrione zebrafish, che può essere utilizzato per condurre una vasta varietà di saggi di formazione del tessuto e la morfogenesi cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Il pesce zebra è emerso come un valido sistema di modello genetico per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia. Zebrafish condividono un alto grado di conservazione genomica, nonché similarità nei processi cellulari, molecolari e fisiologici, con altri vertebrati compresi gli esseri umani. Durante la prima ontogenesi, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo ai ricercatori di visualizzare la dinamica di organogenesi utilizzando un semplice stereomicroscopio. Impiantazione microperla è un metodo che permette la manipolazione dei tessuti attraverso l&#39;alterazione dei fattori negli ambienti locali. Questo permette ai ricercatori di saggiare gli effetti di un qualsiasi numero di molecole di segnalazione di interesse, come i peptidi secreti, nei punti spaziali e temporali specifiche all&#39;interno dell&#39;embrione in via di sviluppo. Qui, i dettagli di un protocollo per il modo di manipolare e perline impianti durante le prime fasi di sviluppo zebrafish.

Diversi tipi di strumenti di manipolazione sono utili per il trattamento microsfere durante applicazioni di ricerca (Figura 1). Inoltre, un semplice stampo agarosio con pozzetti può essere utilizzata per tenere l&#39;embrione zebrafish, che è fondamentale per effettuare questi esperimenti in modo tempestivo ed efficace (Figura 1). L&#39;impianto di una microbead può essere eseguita alla posizione spaziale e temporale della fase di interesse, che permette ai ricercatori per limitare una specifica finestra di azione per la molecola di interesse. Qui, singole microsfere sono stati impiantati in embrioni di zebrafish allo stadio bocciolo coda o in successivi momenti durante le fasi somitogenesis (Figura 3). Due microsfere di dimensioni differenti, sciacquati con soluzione di Ringer sola, sono stati utilizzati in questo protocollo dimostrazione (Figura 3A, 3B e 3C). Questo impianto microbead in assenza di qualsiasi coniugatopiccole molecole dimostra che tallone impianto può essere raggiunto senza effetti morfologici lordi durante il corretto sviluppo dell&#39;embrione zebrafish (Figura 4). Il sperimentalista può incontrare difficoltà con la manovra della microbead nel foro di puntura fatta da un ago di tungsteno in cima l&#39;embrione. Per ottenere una migliore gestione del microbead volta immesso sul embrione dal micro-ago, un / strumento ciglia whisker può essere utilizzato. Questo può essere realizzato con cadute naturalmente felino o basette canino, anche se altri filamenti ciglia naturali o sintetici possono essere utilizzati (Figura 1). Una leggera spinta del microbead sia con l&#39;ago di tungsteno o lo strumento baffo dovrebbe vedere la microbead affondare la soluzione di Ringer dello stampo. Una volta che il microbead è affondato nello stampo dovrebbe essere spostato grandi distanze, se necessario, utilizzando l&#39;ago di tungsteno e una volta in cima dell&#39;embrione dell&#39;utensile ago o whisker può essere utilizzato per position per la microbead nell&#39;embrione. Il successo del fissaggio microbead può essere misurata immediatamente attraverso la visualizzazione a uno stereomicroscopio, come il tallone rimane stabilmente posizionato nel tessuto. Per valutare la posizione tallone nel tempo, ogni campione embrione può essere ripreso con vivo time-corso di fotografia o controllato ad intervalli periodici (come illustrato nella Figura 4) per assicurare che la posizione tallone non è spostato sopra la durata dell&#39;esperimento dovuta al tessuto endogeno morfogenesi. Comprensione della posizione del tallone nel tempo è critico per l&#39;interpretazione più informata dei risultati, come valutare l&#39;effetto di una piccola molecola su un tessuto bersaglio o un processo evolutivo. L&#39;uso di questi passaggi sopra fornirà un ambiente ideale per incastonare microsfere nell&#39;embrione zebrafish alla volta e posizione desiderata. Nella nostra esperienza, gli utenti meno esperti di questo protocollo microperla impianto tipicamente guadagnato il ne abilitàsario effettuare impianto chirurgico coerente microsfere nell&#39;embrione zebrafish, dopo circa una settimana di pratica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. strumenti utilizzati per eseguire microbead impiantazione. (A) Il vassoio impiantazione tallone (sinistra 15 cm di diametro) con stampi embrione (a sinistra) e un vassoio microbead incubazione (a destra, diametro 6 cm). Questo vassoio di lavoro permette al ricercatore di posizionare gli embrioni nell&#39;orientamento desiderato per microperla impianto, e di avere le microsfere preparati per l&#39;impianto in prossimità alla stazione microscopio. Microsfere devono essere incubate a piccola molecola (s) e / o del veicolo e quindi risciacquati in una piastra separata microbead (destra) prima di posizionarli nel vassoio impiantazione tallone che è posizionato sotto la stazione microscopio. (B) Due coppie di pinza sottile saranno utilizzati per rimuovere il Chorisulla circostante ogni embrione zebrafish e anche a rompere la fine dell&#39;ago microcapillare. (C) Un ago di tungsteno sarà utilizzata per realizzare un sottilissimo foratura nell&#39;embrione zebrafish in cui posizionare il microperla. (D) Il trasferimento pipetta microcapillari sarà utilizzato per prelevare e posizionare un microbead in cima zebrafish vicino al sito della puntura. (E) Il / strumento sferza baffo consentirà il posizionamento dolce del microbead nel sito di incisione all&#39;interno dell&#39;embrione che è stato precedentemente fatto dal ago di tungsteno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Schema del procedimento microbead impianto. (A) Un vassoio impiantazione microbead con microsfere soaking nella soluzione di lavaggio desiderato sia impostato sotto una stazione stereomicroscopio, e gli embrioni posizionati con il tessuto rivolto verso l&#39;alto. (B) Usando un ago di tungsteno, una piccola incisione nella embrione può essere effettuato con un lieve movimento ancora forte. (C) Usando una pipetta di trasferimento microcapillari, il microbead desiderato può essere ritirato dalla camera microbead incubazione nel vassoio, situata a destra, e portato al vano sinistra dove la zona di lavoro embrione è situato. Il microbead deve essere depositato vicino al sito di incisione, poi delicatamente posizionata nel sito di incisione fatta dall&#39;ago tungsteno utilizzando lo strumento / ciglia basette. Una volta che un microbead è manovrato nel sito di incisione, dovrebbe essere inserito nel tessuto (distanza dall&#39;incisione) per posizionare stabilmente la microbead e prevenire successivo movimento fuori dell&#39;embrione come sviluppo continua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microsfere possono essere impiantati in embrioni a diversi stadi di sviluppo. (A) zebrafish embrioni sono stati impiantati con un microbead (diametro di circa 50 micron) nel tronco in fase di germoglio di coda. Esaminato in 24 ore dopo branello impianto (hpbi), gli embrioni avevano sviluppato normalmente e la microbead mostrato minimo movimento durante il passaggio del tempo evolutivo. (B) zebrafish embrioni impiantati con microsfere (con un diametro di circa 50 micron) nel sacco vitellino nella fase 3 somite (ss) visualizzate sviluppo normale con movimento tallone relativamente minore nel tempo. (C) microsfere grandi (diametro di circa 70 micron) sono stati impiantati nell&#39;embrione 7 ss simile mostrato successivo sviluppo normale, così come minimal se dal sito dell&#39;impianto alcun movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. sviluppo Gross dell&#39;embrione zebrafish è imperturbato dalla presenza di un microbead attraverso 72 hpbi. Zebrafish embrioni sono stati impiantati con microsfere imbevute di soluzione di Ringer (con un diametro di circa 50 micron) nella fase 7 somite (ss). Ogni microperla stato chirurgicamente inserito nel bagagliaio, tra le somiti 3 e 4. La presenza del cordone non era associata a difetti palesi sviluppo a 24 ore dopo perlina impianto (hpbi), 48 hpbi, o 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

L'efficacia di Air Stripping in due di salmonidi, trota iridea (Oncorhynchus Mykiss) e la trota fario (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...