Name: microbead implantation in the zebrafish embryo
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DP2OD008470.

Le procedure per l&#39;utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università di Notre Dame. Soluzione Preparazione di 1. Ringer <ol><li> Fare una soluzione di 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2, e 5 mm con Hepes ultrapuro H 2 O attraverso una continua agitazione per evitare qualsiasi precipitazione di sali. </li><li> Dopo aggiunta di sali e mentre la soluzione è ancora agitazione, aggiungere 100 unità / mL di penicillina per e 100 mg di streptomicina per ml. </li><li> Dopo aver aggiunto tutti gli antibiotici e sali, effettuare Filtro sterilizzante della soluzione e conservare in contenitore sterile. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU possono essere aggiunti alla soluzione di Ringer di bloccare la formazione di pigmento in perline embrioni impiantati senza conseguenze negative per la salute embrione. Per preparare la soluzione di blocco / pigmentazione di Ringer, utilizzare un concenzione del 0,003% PTU. A causa della bassa concentrazione di PTU da aggiungere si consiglia un volume maggiore di soluzione di Ringer essere fatta almeno 1 L, per evitare di aggiungere minuscole quantità di polvere PTU. Aggiungere PTU durante il passaggio 1.2, mentre la soluzione si agita. </li></ol> 2. Tricaine Soluzione Preparazione <ol><li> Aggiungere 2 g di etil 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaine) per l di soluzione più 0,1 M Tris, da uno stock 1 M equilibrata a pH 9,5 fornito con ultrapura H 2 O. Nota: Tricaine sarà utilizzato euthanize gli embrioni zebrafish al punto di tempo desiderato per eseguire il test del branello fenotipi impianto. </li></ol> 3. E3 Soluzione Preparazione <ol><li> Fare una soluzione di 0,25 M NaCl, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, e 16,6 mM MgSO 4 a 1 L di acqua ultrapura per creare 1 L di E3. </li><li> Aggiungere 200 ml di blu di metilene alla soluzione E3 per inibire la crescita fungina. </li></ol>4. Aghi Pulling per Microbead Transfer <ol><li> Utilizzare Sfaccettate vetro borosilicato con filamento ad un OD: 1,0 mm ID 0,5 mm, una lunghezza di 10 cm. </li><li> Posizionare il vetro borosilicato in un estrattore micropipetta per preparare aghi sottili. Nota: I seguenti quattro dimensioni può essere utilizzato come punto di partenza per tirare gli aghi: Calore = 540, Pull = 245, velocità = 200, e ora = 125. </li><li> Dopo aver tirato un numero adeguato di aghi, conservare in plastica coperto petri piatti, posizionate su strisce di pasta modellabile o nastro adesivo per evitare la rottura della punta dell&#39;ago, fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per tagliare la punta dell&#39;ago per il diametro desiderato, utilizzare un paio di pinze sottili a segnare la fine dell&#39;ago. Nota: Ago diametro varia a seconda delle dimensioni microbead essere utilizzato così come preferenze Gestione utente. Un buon punto di partenza è quello di diametri mestiere in un range tra 100 e 200 micron se saranno utilizzati microperle che vanno 50-100 micron. </li><li> Prior da utilizzare, inserire l&#39;ago tagliato nel supporto tubo capillare di moda lo strumento di trasferimento microperla completato. </li></ol> 5. Baffo / Lash Preparation Tool <ol><li> Ottenere un soffio, scatenarsi, o un altro piccolo pezzo ma ferma di filamento capelli naturali o sintetici. Tagliare vicino alla base del filamento ad un angolo di 45 °. Rispettare il baffo di un P-1000 micropipetta punta usando permanente chiaro colla adesiva. </li></ol> 6. microperla impianto Tray Preparazione <ol><li> Mescolare 2 g di agarosio con 100 ml di soluzione E3 per fare un E3 gel di agarosio al 2%. </li><li> Riscaldare la soluzione di agarosio al 2% per 1 min e 30 sec in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, agitando il matraccio ogni 30 secondi per evitare il gel dalla traboccante. </li><li> Prendere il coperchio di una x 15 mm di Petri 60 mm e posizionarlo in un grande 150 millimetri piatto x 15 mm con l&#39;interno rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Versare il gel caldo nella x 15 mm Petri 150 mm, avendo cura di ancorare giùil coperchio del piatto più piccola con il dito indice. Nota: Consentire un sottile strato di agarosio al di sotto del coperchio del piatto più piccolo per rimuovere la condensa che si forma quando si versa il gel; questo renderà le perle più facile vedere al microscopio dissezione. </li><li> Come l&#39;agarosio si raffredda, ma prima che si solidifica, posizionare uno stampo ben sul gel. Ciò consentirà per facilitare il posizionamento degli embrioni. </li><li> Nota: Per evitare bolle nei pozzetti, posizionare lo stampo lentamente con un angolo fino a che galleggia sulla superficie del gel. </li><li> Utilizzando un microspatula, rimuovere con attenzione lo stampo bene una volta il gel si è solidificato. Aggiungere la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 7. embrioni Collection <ol><li> Preparare le camere di accoppiamento, separati da divisori, da essi riempiendo d&#39;acqua il sistema, e poi mettendo maschio adulto zebrafish (s) e (s) coppie di sesso femminile nelle camere di O / N. </li><li> Raccogliere uova fecondate con un colino rete metallica (stadi embrionali possono variare leggermente). </li><li> Depositare le uova fecondate in una, dieci centimetri di diametro piatto di Petri pulita ruotando il filtro a testa in giù e risciacquo con un bel flusso di E3 finché non ci sono le uova rimaste nel colino, e ci circa 25 ml di soluzione E3 nel piatto. </li><li> Dopo la raccolta, dividere le uova in diversi piatti (circa 50-60 uova per piatto) per evitare il sovraffollamento, che potrebbe condurre a asincronia di sviluppo all&#39;interno della frizione e rendere la raccolta di momenti desiderati punti difficili. </li><li> Incubare gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 ° C per consentire la valutazione dello sviluppo secondo la serie messa in scena zebrafish standard a 40. Nota: Gli embrioni devono essere trasferiti E3 / PTU a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per prevenire lo sviluppo di pigmento se manipolazioni nelle fasi più anziani richiedono chiarezza ottica. </li></ol> 8. Bead impianto <ol><li> Incubare le microsfere di concentrazione di prova molecola desiderata o al veicolo corrispondente soluzione per il tempo necessario a un volume adeguato. Nota: Il ricercatore può utilizzare piastre sterili vanno 3-6 cm di diametro, o piastre a più pozzetti, entrambi i quali consentono la visualizzazione delle microsfere all&#39;interno della soluzione. Il tempo può variare a seconda del tipo e della quantità di molecola di interesse, e il ricercatore dovrebbe riferirsi fabbricante o raccomandazioni pubblicate per durata dell&#39;incubazione e altri aspetti come la sensibilità alla luce e temperatura. </li><li> Una volta che gli embrioni hanno raggiunto il punto di tempo di sviluppo desiderato, rimuovere gli embrioni dai loro chorions utilizzando una pinza sottile. </li><li> Incubare gli embrioni nella soluzione Ringer filtrata con antibiotici per 10 minuti per loro ambientarsi alla soluzione. </li><li> Mentre gli embrioni sono acclimating, trasferire le microsfere nella piastra microbead annidato all&#39;interno del vassoio impianto e sciacquare in soluzione Ringer per 10 min. Nota: Impianto le perle a meno di 50 minuti dopo aver raggiunto questo punto. Questo will diminuire la probabilità che uno impiantare un cordone con una minore concentrazione della molecola di interesse. </li><li> Array gli embrioni nei pozzetti del vassoio microbead impiantazione, avendo cura di orientarle quindi la zona di interesse in cui la microbead sarà impiantato è accessibile. </li><li> Fai una piccola incisione sull&#39;embrione utilizzando l&#39;ago di tungsteno. </li><li> Trasferire una microbead sul embrione utilizzando la pipetta di trasferimento microcapillare: premendo il bulbo della pipetta, tirare delicatamente il microbead nella colonna capillare, e poi rilasciare la pressione per trasferire il microbead alla destinazione desiderata. </li><li> Utilizzare lo strumento basette / sferza per posizionare il microbead all&#39;interno dell&#39;embrione. Nota: Assicurarsi di posizionare il microbead nel tessuto lontano dal sito di incisione in modo che il microbead non sarà espulso dal embrione come si guarisce. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nel secolo scorso, la comprensione del piano corpo patterning e organogenesi ha subito progressi monumentali. Tecniche di manipolazione dei tessuti erano critici nello scoprire informazioni chiave su questi processi vitali. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per l&#39;accertamento funzione dei geni, e metodi di analisi mosaico, come il trapianto di cellule, fornisce approcci utili a comprendere l&#39;autonomia della funzione del gene. Impianto microperla fornisce un altro luogo per interrogare come le molecole particolare alterare le dinamiche evolutive, in quanto questo metodo consente al ricercatore di alterare un ambiente del tessuto locale con l&#39;introduzione di molecole di segnalazione o inibitori. Una gamma di microsfere sono disponibili in commercio, che hanno varie dimensioni e altre proprietà fisiche esistere (ad esempio, carica) tale che essi possono essere impiegati per le condizioni sperimentali di interesse. Così, impiantando microsfere che sono immersi in una proteina o chimicocal di interesse all&#39;interno di un organismo, i ricercatori possono studiare gli effetti localizzati durante lo sviluppo e trovare le associazioni tra il gene o molecola di interesse e particolare fenotipo biologico (s). Studi come quello eseguito da Wada e colleghi hanno utilizzato microperla l&#39;impianto al fine di valutare l&#39;effetto di un aumento Hedgehog in patterning scheletrico neurocranio anteriore (ANC) in zebrafish 23. Studi precedenti hanno dimostrato che Shh è necessario per la formazione ANC 14. Uso microsfere Shh rivestite ricercatori hanno identificato che questo segnale promuove la formazione della cartilagine nell&#39;ANC. Il processo di impianto microperla è stato utilizzato per dimostrare un chiaro legame tra segnalazione Hedgehog e la formazione di cartilagine dell&#39;ANC. Un altro esempio chiave di questa tecnica manipolazione dei tessuti in zebrafish è osservata in studi in cui gli scienziati hanno studiato il controllo trascrizionale del Erythroblastoma ventisei (ETS) dominio fmolecola attori ETS relative (Erm) e Polyoma enhancer attivatore 3 (Pea3) di FGF signaling durante le prime fasi di sviluppo del cervello zebrafish 19. Attraverso esperimenti di impianto microperla, sono stati in grado di dimostrare che Fgf8 e FGF3 possono ectopicamente attivare l&#39;espressione di ERM e pea3. Questi esempi illustrano l&#39;utilità di microsfere di fornire informazioni sui meccanismi di sviluppo che collaborano durante la formazione del tessuto, che possono essere ben caratterizzato dall&#39;utilizzo di metodi per valutare l&#39;espressione genica 41. Così, il trapianto microbead può essere un metodo praticabile per esplorare altri tessuti, come il mesoderma intermedio (IM) che dà origine al rene. In particolare, sarebbe di aiuto negli studi di sviluppo renale, per indagare come le diverse molecole influenzano nefrone segmentazione 42 e tubulogenesi 43,44, processi che sono solo superficialmente compresi attualmente. Inoltre, microbead impianto è già iniziato ad essere utilizzato al montanteprocessi y rigenerazione in zebrafish 29] e potrebbero essere adattati per l&#39;utilizzo con qualsiasi numero di modelli di rigenerazione di organi, come ad esempio in seguito ablazione laser dei tessuti embrionali, come il nefrone 45 o in combinazione con metodi che sono stati formulati per eseguire la ricerca con le corrispondenti strutture per adulti 46-49. Infine, microbead impianto ha il potenziale per essere utilizzato in modelli di malattie umane, come il cancro 50,51 o tessuto degenerazione 52,53. Nel presente protocollo, dimostriamo il metodo di microbead impianto in embrioni di zebrafish, che è anche stato simile descritto da altri ricercatori, ma non dimostrato, attraverso protocolli di video 1. Con la pratica minimo siamo stati in grado di impiantare microsfere ad una velocità di circa 8-10 embrioni / h, che mette in relazione la fattibilità di questa procedura una volta che il ricercatore ha una certa esperienza. I risultati riportati nel presente documento dimostrano che perle di vari dimensioni possono essere impiantati nelle fasi iniziali, e che con cura, questa tecnica manipolazione dei tessuti possono essere implementati con minimo impatto fisico per l&#39;embrione. Un miglioramento che va sottolineato è l&#39;uso di uno strumento basette / ciglia posizionarla microbead nell&#39;embrione. Questo pezzo relativamente economico e semplice di apparecchiature è circa lo stesso diametro del microperla, è facile da ottenere e aiuta a velocizzare il processo di impianto. Il baffo / sferza può essere tagliato alla lunghezza desiderata per la produzione di una ditta e delicato strumento-tallone gestione, a seconda del ricercatore destrezza e la preferenza. Infine, mentre abbiamo descritto qui come manipolare fisicamente microsfere ed embrioni di zebrafish per eseguire l&#39;impianto, questo protocollo non delineare specifiche procedure di gestione per i farmaci o peptidi diversi. In generale, microsfere trattate chimicamente devono essere impiantati nell&#39;animale con espedienti, per evitare effetti indesiderati in altre aree dell&#39;organismo, e ricercatori dovrebbero essere largoformata sui possibili problemi di sicurezza associati a tali sostanze chimiche prima di iniziare i loro studi. In sintesi, abbiamo dimostrato un metodo microbead impianto relativamente semplice ed efficiente con una vasta gamma di applicazioni che utilizzano materiali che sono facilmente disponibili in laboratorio. In definitiva, ci auguriamo che questo manuale sarà di aiuto ai ricercatori la delicatezza di manipolazione dei tessuti zebrafish.

I ricercatori di biologia dello sviluppo utilizzano una vasta gamma di metodi di cellulari, molecolari e genetici per scoprire i meccanismi che controllano come si forma un organismo. Tra questi approcci, manipolazione dei tessuti è uno strumento chiave nel decifrare questioni complesse circa il destino della cellula, il movimento cellulare, e l&#39;organizzazione dei tessuti. Un modo per alterare ambienti locali tissutali è attraverso l&#39;applicazione chirurgica di microsfere che sono utilizzati per fornire una sorgente focale di proteine ​​o altre molecole di segnalazione 1. Questo tipo di manipolazione sperimentale è stato ampiamente implementato in classici modelli embriologia vertebrati, come la rana e pulcino 2. Il pesce zebra è diventato un importante organismo modello vertebrato per lo studio della organogenesi e fornisce anche molti vantaggi unici per la modellazione malattia 3-5 in quanto condividono la conservazione genetica alto con gli esseri umani 6. In particolare, la trasparenza ottica ed exsviluppo Ternal dell&#39;embrione zebrafish offre un punto di vista senza pari per l&#39;osservazione del tessuto ontogenesi 3-5. La realizzazione di schermi genetici forward grandi ha generato un potente repository di ceppi mutanti zebrafish per ulteriori studi 7,8, e l&#39;identificazione di tecniche di screening alternativi che possono essere efficacemente condotta a scala ridotta in singoli laboratori 9,10. Ulteriore lavoro sperimentale con zebrafish è stata facilitata grazie ai progressi nelle metodologie transgeniche e invertire approcci genetici 11,12, così come la genetica chimici 13-15. Tecniche di manipolazione dei tessuti, come la realizzazione di microsfere, non sono stati così ampiamente impiegato nel zebrafish, ma comunque fornire uno strumento utile per comprendere ulteriormente la segnalazione delle cellule durante lo sviluppo. Microperla impianto è stato utilizzato per interrogare i processi di formazione dell&#39;organo nella retina zebrafish16,17, 18 cuore, il cervello 19-22, neural crest 23, e fin 24,25. In questi ed altri studi, perline sono state applicate durante lo sviluppo per comprendere la diffusione delle molecole di segnalazione 26, come gradienti influenzano migrazione cellulare 27 e assiale patterning 28. Più recentemente, microsfere sono stati utilizzati per valutare i meccanismi di rigenerazione in adulti zebrafish 29. Negli studi di sviluppo, ad esempio, il lavoro microperla zebrafish ha fornito informazioni sui meccanismi di formazione degli arti attraverso studi della pinna pettorale 25. Il pesce zebra pettorali germoglio pinna è omologa al germoglio arti anteriori nel topo 30 e pulcino 31. La gemma vertebrati arto ha due nodi fondamentali di segnalazione: la zona di attività polarizzante (ZPA), che stabilisce l&#39;asse anteriore-posteriore attraverso l&#39;espressione di Sonic hedgehog (Shh) ea valle geni bersaglio Hox,e la cresta ectodermica apicale (ARE) presente sulla punta della gemma dell&#39;arto, che agisce per stabilire prossimale all&#39;identità distale degli arti attraverso l&#39;espressione di fattori di crescita dei fibroblasti (Fgfs). Con l&#39;impianto di microsfere Fgf imbevuti in zebrafish mutanti genetici Shh, investigatori identificato Fgf come essenziale per la progressione del ciclo cellulare e la crescita dell&#39;arto vertebrati 25. In aggiunta a FGF e Shh cascate di segnalazione che stabiliscono identità posizionale, studi pionieristici utilizzando la gemma pulcino arto identificato acido retinoico (RA) come una molecola che potrebbe mimare l&#39;azione della regione polarizzatore per stabilire anteriore a posteriore identità 32. Questi esperimenti coinvolti mettendo piccole strisce di carta Whatman RA-impregnato nella arto pulcino di valutare cifre patterning 32. Inoltre, i ricercatori hanno eseguito altri studi eleganti che impiegano l&#39;uso di microsfere, trapianto di cellule, ed esogenoTrattamenti RA in zebrafish per determinare che RA agisce per fornire a lungo raggio spunti di posizione all&#39;interno romboencefalo zebrafish e mesoderma 28. Tuttavia, attualmente molte domande rimangono circa i ruoli di segnalazione fattori come Fgf e RA durante numerosi aspetti dello sviluppo dei vertebrati. Gli effetti di segnalazione di RA, che agisce come un morfogeno, incidono molti organi 33, come il cuore lo sviluppo 34 e progenitori renali, dove RA specifica cellule renali prossimali tipo destino 35-39. Ulteriore comprensione di tali argomenti potrebbe beneficiare in modo significativo da studi sperimentali che utilizzano tecniche di manipolazione dei tessuti e microperla impianto. Mentre meno studi sono stati condotti con microperla impianto in zebrafish, rispetto a modelli come il pulcino, quelli che sono stati eseguiti sono stati altamente informativo. Uno dei motivi per la scarsità di microbead impianto-ricerca con sede nell&#39;embrione zebrafish è likely la nozione che ci sono difficili sfide tecniche, in base alle dimensioni dell&#39;embrione, che costituiscono un impedimento per eseguire con successo tali manipolazioni. Tuttavia, microbead impianto in embrioni di zebrafish può essere apprese con la pratica e assistito attraverso l&#39;osservazione visiva della tecnica, e quindi può essere perseguito come un mezzo per interrogare i meccanismi di sviluppo. Qui, dimostriamo l&#39;applicazione precisa di una microbead nell&#39;embrione zebrafish, che può essere utilizzato per condurre una vasta varietà di saggi di formazione del tessuto e la morfogenesi cellulare.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Il pesce zebra è emerso come un valido sistema di modello genetico per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia. Zebrafish condividono un alto grado di conservazione genomica, nonché similarità nei processi cellulari, molecolari e fisiologici, con altri vertebrati compresi gli esseri umani. Durante la prima ontogenesi, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo ai ricercatori di visualizzare la dinamica di organogenesi utilizzando un semplice stereomicroscopio. Impiantazione microperla è un metodo che permette la manipolazione dei tessuti attraverso l&#39;alterazione dei fattori negli ambienti locali. Questo permette ai ricercatori di saggiare gli effetti di un qualsiasi numero di molecole di segnalazione di interesse, come i peptidi secreti, nei punti spaziali e temporali specifiche all&#39;interno dell&#39;embrione in via di sviluppo. Qui, i dettagli di un protocollo per il modo di manipolare e perline impianti durante le prime fasi di sviluppo zebrafish.

Diversi tipi di strumenti di manipolazione sono utili per il trattamento microsfere durante applicazioni di ricerca (Figura 1). Inoltre, un semplice stampo agarosio con pozzetti può essere utilizzata per tenere l&#39;embrione zebrafish, che è fondamentale per effettuare questi esperimenti in modo tempestivo ed efficace (Figura 1). L&#39;impianto di una microbead può essere eseguita alla posizione spaziale e temporale della fase di interesse, che permette ai ricercatori per limitare una specifica finestra di azione per la molecola di interesse. Qui, singole microsfere sono stati impiantati in embrioni di zebrafish allo stadio bocciolo coda o in successivi momenti durante le fasi somitogenesis (Figura 3). Due microsfere di dimensioni differenti, sciacquati con soluzione di Ringer sola, sono stati utilizzati in questo protocollo dimostrazione (Figura 3A, 3B e 3C). Questo impianto microbead in assenza di qualsiasi coniugatopiccole molecole dimostra che tallone impianto può essere raggiunto senza effetti morfologici lordi durante il corretto sviluppo dell&#39;embrione zebrafish (Figura 4). Il sperimentalista può incontrare difficoltà con la manovra della microbead nel foro di puntura fatta da un ago di tungsteno in cima l&#39;embrione. Per ottenere una migliore gestione del microbead volta immesso sul embrione dal micro-ago, un / strumento ciglia whisker può essere utilizzato. Questo può essere realizzato con cadute naturalmente felino o basette canino, anche se altri filamenti ciglia naturali o sintetici possono essere utilizzati (Figura 1). Una leggera spinta del microbead sia con l&#39;ago di tungsteno o lo strumento baffo dovrebbe vedere la microbead affondare la soluzione di Ringer dello stampo. Una volta che il microbead è affondato nello stampo dovrebbe essere spostato grandi distanze, se necessario, utilizzando l&#39;ago di tungsteno e una volta in cima dell&#39;embrione dell&#39;utensile ago o whisker può essere utilizzato per position per la microbead nell&#39;embrione. Il successo del fissaggio microbead può essere misurata immediatamente attraverso la visualizzazione a uno stereomicroscopio, come il tallone rimane stabilmente posizionato nel tessuto. Per valutare la posizione tallone nel tempo, ogni campione embrione può essere ripreso con vivo time-corso di fotografia o controllato ad intervalli periodici (come illustrato nella Figura 4) per assicurare che la posizione tallone non è spostato sopra la durata dell&#39;esperimento dovuta al tessuto endogeno morfogenesi. Comprensione della posizione del tallone nel tempo è critico per l&#39;interpretazione più informata dei risultati, come valutare l&#39;effetto di una piccola molecola su un tessuto bersaglio o un processo evolutivo. L&#39;uso di questi passaggi sopra fornirà un ambiente ideale per incastonare microsfere nell&#39;embrione zebrafish alla volta e posizione desiderata. Nella nostra esperienza, gli utenti meno esperti di questo protocollo microperla impianto tipicamente guadagnato il ne abilitàsario effettuare impianto chirurgico coerente microsfere nell&#39;embrione zebrafish, dopo circa una settimana di pratica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. strumenti utilizzati per eseguire microbead impiantazione. (A) Il vassoio impiantazione tallone (sinistra 15 cm di diametro) con stampi embrione (a sinistra) e un vassoio microbead incubazione (a destra, diametro 6 cm). Questo vassoio di lavoro permette al ricercatore di posizionare gli embrioni nell&#39;orientamento desiderato per microperla impianto, e di avere le microsfere preparati per l&#39;impianto in prossimità alla stazione microscopio. Microsfere devono essere incubate a piccola molecola (s) e / o del veicolo e quindi risciacquati in una piastra separata microbead (destra) prima di posizionarli nel vassoio impiantazione tallone che è posizionato sotto la stazione microscopio. (B) Due coppie di pinza sottile saranno utilizzati per rimuovere il Chorisulla circostante ogni embrione zebrafish e anche a rompere la fine dell&#39;ago microcapillare. (C) Un ago di tungsteno sarà utilizzata per realizzare un sottilissimo foratura nell&#39;embrione zebrafish in cui posizionare il microperla. (D) Il trasferimento pipetta microcapillari sarà utilizzato per prelevare e posizionare un microbead in cima zebrafish vicino al sito della puntura. (E) Il / strumento sferza baffo consentirà il posizionamento dolce del microbead nel sito di incisione all&#39;interno dell&#39;embrione che è stato precedentemente fatto dal ago di tungsteno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Schema del procedimento microbead impianto. (A) Un vassoio impiantazione microbead con microsfere soaking nella soluzione di lavaggio desiderato sia impostato sotto una stazione stereomicroscopio, e gli embrioni posizionati con il tessuto rivolto verso l&#39;alto. (B) Usando un ago di tungsteno, una piccola incisione nella embrione può essere effettuato con un lieve movimento ancora forte. (C) Usando una pipetta di trasferimento microcapillari, il microbead desiderato può essere ritirato dalla camera microbead incubazione nel vassoio, situata a destra, e portato al vano sinistra dove la zona di lavoro embrione è situato. Il microbead deve essere depositato vicino al sito di incisione, poi delicatamente posizionata nel sito di incisione fatta dall&#39;ago tungsteno utilizzando lo strumento / ciglia basette. Una volta che un microbead è manovrato nel sito di incisione, dovrebbe essere inserito nel tessuto (distanza dall&#39;incisione) per posizionare stabilmente la microbead e prevenire successivo movimento fuori dell&#39;embrione come sviluppo continua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microsfere possono essere impiantati in embrioni a diversi stadi di sviluppo. (A) zebrafish embrioni sono stati impiantati con un microbead (diametro di circa 50 micron) nel tronco in fase di germoglio di coda. Esaminato in 24 ore dopo branello impianto (hpbi), gli embrioni avevano sviluppato normalmente e la microbead mostrato minimo movimento durante il passaggio del tempo evolutivo. (B) zebrafish embrioni impiantati con microsfere (con un diametro di circa 50 micron) nel sacco vitellino nella fase 3 somite (ss) visualizzate sviluppo normale con movimento tallone relativamente minore nel tempo. (C) microsfere grandi (diametro di circa 70 micron) sono stati impiantati nell&#39;embrione 7 ss simile mostrato successivo sviluppo normale, così come minimal se dal sito dell&#39;impianto alcun movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. sviluppo Gross dell&#39;embrione zebrafish è imperturbato dalla presenza di un microbead attraverso 72 hpbi. Zebrafish embrioni sono stati impiantati con microsfere imbevute di soluzione di Ringer (con un diametro di circa 50 micron) nella fase 7 somite (ss). Ogni microperla stato chirurgicamente inserito nel bagagliaio, tra le somiti 3 e 4. La presenza del cordone non era associata a difetti palesi sviluppo a 24 ore dopo perlina impianto (hpbi), 48 hpbi, o 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

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JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Biologia dello sviluppo

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Chiarire il comportamento della microglia nello sviluppo del tectum ottico del pesce zebra

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Utilizzo del pesce zebra per esplorare la migrazione delle microglia durante lo sviluppo del cervello

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Microperla impianto nel zebrafish

Riepilogo

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Capitoli in questo video

L'infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità