Gli autori desiderano ringraziare i membri del personale del Fondo per la Deakin University Zebrafish per fornire un&#39;eccellente assistenza in corso allevamento. YG è supportato da una borsa di studio di ricerca post-dottorato e Alfred Deakin un assegno di ricerca Central da Deakin University. SLM è supportato da una borsa di studio NHMRC sviluppo della carriera. ACW è sostenuta da una sovvenzione NHMRC Attivazione. Tutti gli autori sono supportati dal Molecular &amp; Medical Research Centre di ricerca strategica presso Deakin University.

Parte 1: trattamento chimico di embrioni di zebrafish <ol><li> Raccogliere embrioni di zebrafish dopo la fecondazione. Incubare a 28,5 ° C in terreno E3 in 100 × 15 millimetri Petri. Nota: per ibridazione in situ o Oil-Red-O colorazione, 1-fenil-2-tiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,2 mM viene aggiunto inibire la formazione di pigmento, 1 ma non è necessario per l&#39;analisi Seahorse. </li><li> Per gli studi farmacologici, aggiungere la sostanza chimica necessaria ad una concentrazione finale adeguata per lo sviluppo di embrioni di zebrafish in circa 26 ore dopo la fecondazione (HPF) con un adeguato controllo con solo veicolo. Nota: per gli inibitori farmacologici sensibili alla luce, gli embrioni possono essere consentito di sviluppare in il priore buio per l&#39;analisi. </li></ol> Parte 2: il profilo metabolico dal vivo con il Seahorse XF 24 Analyser <ol><li> Prima di ogni esecuzione, il Seahorse XF 24 cartuccia Analyser che ospita il 2 O e H <s&gt; + fino fluorofori è calibrato attraverso un processo automatizzato eseguito dall&#39;analizzatore. </li><li> Preparazione del 24 pozzetti XF piastra da 24 isole. La seguente sequenza sperimentale è impiegato: <ol><li> Poiché il consumo di ossigeno è sensibile alle variazioni di temperatura, quattro pozzi sono usati per controllare le fluttuazioni di temperatura possibili attraverso la piastra. Questi pozzetti non contengono embrioni, ma sono riempiti con 700 pl di mezzo E3 (Figura 2A). </li><li> I restanti 20 pozzi (cfr. parte 2.2) sono riempiti con 700 ml di mezzo di E3 e un embrione ciascuno (Figura 2B). </li><li> Per ogni esperimento, 10 embrioni sono trattati con veicolo (controllo) e 10 trattati con inibitore chimico (trattata). Embrioni di controllo e trattato si alternano (ad esempio, ben A2: embrione di controllo; bene A3: embrione trattato: A4 anche: embrione di controllo; ben embrione A5 trattamento, ecc.) </li><li> Una schermata di acquisizione isolotto è aggiunto in cima. ogni pozzetto per garantire che il campione rimane nella camera di misura all&#39;interno del dosaggio (Figura 2B) Nota: trattati chimicamente embrioni rimangono con la soluzione chimica originale durante l&#39;intera procedura, senza necessità di lavare il prodotto chimico prima esecuzione dell&#39;analizzatore Seahorse programma. </li><li> Una volta terminata, la lastra viene caricata nel Analyser Seahorse ed il dosaggio viene avviato. </li></ol></li><li> Analisi di campioni. Due diverse prove sono eseguite di routine. <ol><li> Basale respirazione / Massimo programma respirazione (durata circa 90 min.). Le alterazioni della respirazione basale sostenere disfunzione metabolica, mentre la respirazione massima è una misura della capacità totale di produzione di energia e alterazioni in questo parametro associato con un certo numero di stati sia patologici e fisiologici. La capacità respiratoria di riserva, o la capacità di sistema di aumentare ulteriormente la produzione di ATP, viene inoltre calcolatada questa prova dalla sottrazione di respirazione basale da massima. Tre ripetizioni di ciascuna miscela (2 min) / attesa (1 min) / misura (2 min) ciclo viene eseguita per stabilire prima la respirazione basale. Al termine del terzo ciclo, una concentrazione finale di 2,5 pM di FCCP (mitocondriale protonophore / disaccoppiatore) viene aggiunto a ciascun pozzetto permettendo la misurazione della respirazione massima. Il ciclo di misura viene quindi ripetuto 5-8 volte (Figura 3). </li><li> ATP fatturato / Proton programma di perdita (durata circa 60 min.). La respirazione a causa di fatturato ATP rappresenta la principale funzione dei mitocondri in forma di produzione di ATP, mentre la respirazione a causa della perdita di protoni, o respirazione disaccoppiati, è strettamente legata ad altri parametri della funzione mitocondriale tra cui la respirazione basale e reattiva la formazione di specie di ossigeno. Respirazione a causa turnover ATP è rappresentato dalla differenza di respirazione dopo l&#39;aggiunta di 25 pM oligomicina (un inibitore di ATP sintasi) rispetto alla respirazione basale. Respirazione disaccoppiata, o respirazione a causa di perdita protonica, viene determinato calcolando la differenza tra oligomicina-mediata respirazione respirazione e dopo l&#39;aggiunta di 25 uM rotenone (un inibitore del complesso I). Cicli di misura vengono ripetuti 8 volte dopo l&#39;aggiunta di ciascun inibitore mitocondriale. </li></ol></li></ol> Alla fine delle piste, i valori medi del controllo 10 e 10 embrioni trattati chimicamente sono calcolati. Parte 3: Oil-Red-O di colorazione <ol><li> Gli embrioni a 50 HPF sono dechorionated utilizzando una pinza sottile e fissate in 4% PFA per una notte a 4 ° C. </li><li> Oil-Red-O colorazione viene effettuata, come precedentemente descritto 2 (vedi Figura 4). </li></ol>

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	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Zebrafish è una consolidata modello genetico sia in avanti (ENU mutagenesi) e reverse (Tilling, zinc finger nucleasi mirata knock-out, knockdown morfolino) approcci genetici 3,4, mentre la funzione del gene in embrioni di zebrafish può anche essere facilmente bloccato o attivato utilizzando selettivi composti farmacologici specifici per i prodotti codificati. Grazie al loro sviluppo esterno e piccole dimensioni, embrioni di zebrafish sono particolarmente adatti per l&#39;analisi metabolica. Tuttavia, la misura del profilo metabolico robusta e funzione mitocondriale in vivo in embrioni di zebrafish non è stato raggiunto, con una sola descrizione preliminari riportate 5. Analisi Seahorse stato originariamente progettato per basati su celle studi metabolici e ha dimostrato di dare risultati precisi e affidabili 6. L&#39;applicazione di questa nuova metodologia di embrioni di zebrafish è significativo, e in grado di aumentare l&#39;uso più ampio di questo modello per gli studi metabolici. In questo studio, abbiamo dimostrato la misurazione di una serie di parametri di respirazione in embrioni di zebrafish utilizzando l&#39;analizzatore Seahorse, tra cui la respirazione basale, respirazione massima, di ricambio capacità respiratoria, fatturato ATP e perdite protone. Forniamo anche un esempio di come tali misurazioni possono essere correlati con altri parametri fisiologici, in questo caso accumulo di lipidi, e dell&#39;uso di inibitori farmacologici in questo sistema di analisi. In combinazione con l&#39;uso di embrioni geneticamente alterati, questo fornisce una potente piattaforma sperimentale per comprendere i fattori che incidono sul metabolismo. Ci sono una varietà di applicazioni per questa nuova metodologia, con disfunzione mitocondriale è implicato in molte malattie umane, come il diabete mellito 7, obesità 8, 9 sclerosi multipla, Parkinson 10, morbo di Alzheimer 11 e alcuni tipi di cancro 12. È importante sottolineare che, our lavoro viene eseguito in vivo, in cui tutte le influenze ambientali - quali citochine, sviluppo connesse etc crescita - sono attivi, fornendo così una vista fisiologicamente rilevante nella respirazione vivo e profilo metabolico. Come schermi chimici sono eseguiti di routine in wild type e mutanti embrioni di zebrafish sfondo (Figura 1), i prodotti farmaceutici innovativi che influenza la respirazione, la funzione dei mitocondri e metabolismo rischiano di essere facilmente identificabili con l&#39;analizzatore Seahorse. I risultati ottenuti utilizzando l&#39;analizzatore Seahorse potrebbe essere utilizzato in combinazione con altri saggi di fornire ulteriori informazioni. Questo può includere analisi fisiologica, come olio rosso-colorazione, o analisi molecolare, come l&#39;ibridazione in situ per adipociti marcatori specifici come cebpα, PPARa, PPARy, ecc FAS Restano alcune limitazioni a questa metodologia. Anche se e gli altri erano in grado di utilizzare oligomicina per misuraure produzione di ATP e perdita protonica sugli embrioni giovani 5 (vedi figura 3), in embrioni di età superiore ai 60 Trattamento hpf oligomicina è inefficiente. Riteniamo che nei vecchi embrioni oligomicina non può diffondere con la stessa facilità che nei giovani embrioni rendendo i risultati impossibili da interpretare. Dal momento che i risultati oligomicina sono obbligatori per la determinazione della respirazione a causa di fatturato ATP e la respirazione disaccoppiato, stiamo attualmente studiando concentrazioni più elevate di oligomicina per gli anziani embrioni. Tuttavia, antimicina A trattamenti rimangono più efficace, con altre misure, come la respirazione basale, respirazione massima e ricambio capacità respiratoria, può essere eseguita in embrioni di zebrafish anziani, fino a 68 HPF (non mostrato). Un&#39;altra limitazione utilizzando l&#39;attuale configurazione Analyser Seahorse è lo spazio fisico all&#39;interno di ogni piastra di cattura isolotto bene, in modo tale che essi sono adatti solo per embrioni di zebrafish e larve giovani. Pertanto, eseguendo metabolic studi sulla dieta obesità indotta nei pesci adulti, per esempio, non è ancora tecnicamente possibile. Tuttavia, questo studio possono indurre lo sviluppo di lastre appositamente studiati per il novellame o adulto, in modo da estendere l&#39;ambito di analisi possibili.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> XF 24 analizzatore di flusso extracellulare </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> Formato 24 ben </td></tr><tr><td> Islet Capture micropiastra </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> Formato 24 ben </td></tr><tr><td> XF calibrante Soluzione </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF saggio medio </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (media embrionale) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 millimetri Petri piatti </td><td> Falco </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomicina </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

Un obiettivo crescita nel campo del metabolismo è quello di determinare l&#39;impatto della genetica su diversi aspetti della funzione mitocondriale. La comprensione di queste relazioni aiuterà a comprendere l&#39;eziologia di fondo per una serie di malattie legate alla disfunzione mitocondriale, come il diabete e l&#39;obesità. I recenti progressi nella strumentazione, ha permesso il monitoraggio dei parametri distinti della funzione mitocondriale in linee cellulari o espianti di tessuto. Presentiamo qui un metodo per un&#39;analisi rapida e sensibile di parametri funzione mitocondriale in vivo durante lo sviluppo embrionale di zebrafish usando l&#39;Seahorse Bioscience XF 24 analizzatore extracellulare flusso. Questo protocollo utilizza la cattura Islet micropiastre in cui un singolo embrione si trova in ciascun pozzetto, consente la misurazione della bioenergetica, tra cui: (i) la respirazione basale, (ii) la respirazione mitocondriale basale (iii) la respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP, (iv) mitocondriale respirazione disaccoppiato o prOton perdita e (iv) la respirazione massimo. Utilizzando questo approccio embrionali parametri respiratori zebrafish può essere paragonato tra wild-type e di embrioni geneticamente modificati (mutante, gene sovra-espressione o knockdown gene) o quelli manipolato farmacologicamente. Si prevede che la diffusione di questo protocollo fornirà ai ricercatori nuovi strumenti per analizzare le basi genetiche dei disturbi metabolici in vivo nel modello animale vertebrato rilevante.

<html> Siamo interessati a capire il ruolo dei geni specifici sul metabolismo, in particolare il tasso di respirazione e il metabolismo dei lipidi. Pertanto, abbiamo trattato selvatici embrioni di zebrafish tipo da 26 in poi HPF con uno specifico inibitore farmacologico di enzima codificato da uno di questi geni. A 50 HPF, metà del veicolo e inibitore trattati embrioni sono stati analizzati utilizzando la Seahorse per la funzione mitocondriale, mentre la restante metà sono stati fissati in 4% PFA notte a 4 ° C e successivamente trattata per deposizione di lipidi con Oil-Red-O. Il trattamento con l&#39;inibitore di enzima specifico condotto un ~ 2 volte più elevata respirazione basale (Figura 4A), che è stata associata con un aumento deposizione di lipidi soprattutto nel telencefalo e sotto la vescicola otica (Figura 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica di trattamento chimico di embrioni di zebrafish. Wildtype, geneticamente manipolati, trattati farmacologicamente o embrioni di zebrafish sono sfondo. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figura 2. XF24 piatto isolotto impostare. (A) Quattro pozzi contenere mezzo embrionale solo come il controllo della temperatura (indicate con una X) e gli altri contengono un embrione / bene. (B) Close-up di un pozzo (C6) che mostra un 50 embrione wild type hpf trattati con veicolo (DMSO) coperta da una schermata di acquisizione isolotto (punta di freccia). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figura 3. Respiratparametri di ioni per selvatici di tipo 50 embrioni di zebrafish HPF. (A) Per ogni misura, la media dei 20 embrioni singoli è presentato. Respirazione basale (media: 299,7; SD: 75.7; SEM: 16.9), la respirazione massima (media: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20,9), la capacità respiratoria di ricambio (media: 87,7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (B) Per ciascuna misurazione, la media dei 20 singoli risultati è presentato. Basale respirazione mitocondriale; respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP mitocondriale respirazione disaccoppiato e non mitocondriale respirazione. Mt: mitocondriale; SRC: ricambio capacità respiratoria; SD: Deviazione Standard, SEM: Errore standard della media. I risultati sono presentati in pmol di O 2 consumata / min / embrione. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Rappresenrisultati rappresentativi dell&#39;esposizione a sostanze chimiche sulla respirazione basale e la deposizione di lipidi. (A, B) 50 HPF embrioni colorati con olio rosso O in vista laterale. L&#39;embrione incubate con l&#39;inibitore selettivo (B) mostra più la colorazione Oil-Red-O nel telencefalo (punta di freccia) e sotto la vescicola otica (freccia) rispetto ad un veicolo trattato con embrione di controllo. (C) respirazione basale mostra un aumento di circa 2 volte negli embrioni trattati chimicamente (n = 10 embrioni per gruppo). I risultati sono presentati in pmol di O 2 / min / embrione.

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare la<em&gt; In vivo</em&gt; Profilo metabolico di zebrafish in via di sviluppo che permette la comparazione di diversi parametri della funzione mitocondriale tra geneticamente o farmacologicamente embrioni manipolati, aumentando in tal modo l&#39;applicabilità di questo organismo.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.9K Views.  School of Medicine, Deakin University. Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare la In vivo Profilo metabolico di zebrafish in via di sviluppo che permette la comparazione di diversi parametri della funzione mitocondriale tra geneticamente o farmacologicamente embrioni manipolati, aumentando in tal modo l'applicabilità di questo organismo.

Video: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...