Ringraziamo i membri del laboratorio Rosenblatt per discussioni scientifiche, suggerimenti e commenti. Vorremmo anche ringraziare Maria Halloran che ha gentilmente fornito la codifica plasmide RFP-UtrCH e David Grunwald che ha fornito il CK: GFP zebrafish transgenico. Grazie anche a Gretchen re e il personale della risorsa Zebrafish centralizzata presso l&#39;Università dello Utah per la manutenzione eccellente e la cura del pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Innovator Award di New NIH-NIGMS direttore del NIH di 1 DP2 OD002056-01 a JR. GTE è stato sostenuto dalla formazione multidisciplinare del cancro del NIH Grant Program 5T32 CA03247-8.

Flusso di lavoro di base per la visualizzazione di Dinamica actina durante l&#39;estrusione cella nel Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo L&#39;epidermide del pesce zebra di sviluppo è composto da due strati distinti, lo strato superficiale (o periderm) e uno strato basale di cellule che contattare la membrana basale 2. Le cellule dello strato superficiale esterno apoptosi e vengono eliminati dal tessuto di estrusione 3 (Figura 1). Per visualizzare questo processo in tempo reale, abbiamo iniettare RNA codifica una proteina fluorescente rossa fusa al dominio di omologia calponina utrophin, una proteina actina vincolante (RFP-UtrCH) 4,5, in una cella di zebrafish fase transgenici che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP ) sotto il promotore citocheratina epiteli stratificati 8 6 (Figura 2A). Anche se RFP-UtrCH è ubiquitariamente espressa l&#39;animale dopo l&#39;iniezione di RNA, ci concentriamo sulle cellule superficiali dell&#39;epidermide che esprimono entrambe le RFP e GFP per seguire le dinamiche actina specificamente nell&#39;epidermide (Figura 2B). Abbiamo poi trattare le larve con G418 di indurre apoptosi delle cellule di estrusione e l&#39;immagine dei filamenti di actina epidermide e usando un microscopio confocale a disco rotante e di acquisire serie di dati 4D. Prima di iniziare l&#39;esperimento <ol><li> In vitro trascrivere l&#39;RNA da un modello di DNA linearizzato utilizzando il mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) e purificare l&#39;RNA innevate utilizzando il RNeasy Mini kit (Qiagen). Diluire l&#39;RNA a ~ 60ng/ul con acqua sterile, fare 3-5μl aliquote e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;iniezione. Nota: Evitare di congelare e ripetitivo / scongelamento per evitare la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Fare uno stampo per tenere gli embrioni durante l&#39;iniezione versando 40 ml di agarosio al 2% nel medio embrione E3 (E3) in un 15 millimetri x 100 piastra di coltura e l&#39;immissione di uno stampo microiniezione (Adaptive Strumenti Scienza, # I-34) in questo vassoio. Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo per esporre le depressioni in agarosio. Conservare la piastra a 4 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. </li><li> Tirare aghi capillare per iniezione utilizzando vetro borosilicato con filamenti (OD 1.0mm, ID 0,78, lunghezza 10 cm) e un P-97 Estrattore Pipettare Sutter a le seguenti impostazioni (Calore 485, Pull 50, velocità 60, Delay / ora 90, pressione 200 ). Nota: I diversi tipi di vetro richiede l&#39;ottimizzazione delle condizioni elencate. </li><li> Costituiscono l&#39;1% Low Melt (LM) agarosio in E3 e conservare 1mL aliquote a 42 ° C. Fare attenzione a come l&#39;evaporazione di E3 dalle scorte può aumentare la concentrazione di agarosio. </li><li> Mantenere zebrafish adulti in condizioni di laboratorio standard, con un regolare luce / buio ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio 7. La notte prima l&#39;esperimento costituito di pesce di accoppiarsi mettendo 3 femmine e 2 maschi in una vasca separati da un divisorio. La mattina seguente, cambiare l&#39;acqua nel serbatoio e tirare il divisore quando le luci si accendono. </li></ol> 1. L&#39;iniezione di RNA codifica per la proteina fluorescente Actina Tagged Binding <ol><li> Scongelare il RNA sul ghiaccio. Aggiungere 0,5% rosso fenolo per l&#39;RNA con un rapporto 1:1 per una concentrazione finale di RNA di ~ 30ng/μl e caricare 1ml soluzione in un ago capillare tirato da back-filling. </li><li> Raccogliere ~ 75 1-cellula fase 8 CK: embrioni GFP in E3. Preparare la pipetta raccolti embrioni nello stampo microiniezione con un 5 ¾ Pasteur e delicatamente orientare gli embrioni nella vasca con FST Dumont # 5 pinze. Nota: fare attenzione a lavorare in fretta per evitare di iniettare in un multi-cellula embrionale fase, che può portare a mosaico espressione dell&#39;RNA iniettato. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio standard di laboratorio dissezione, iniettare l&#39;RNA nel tuorlo degli embrioni usando una pressione controllata microinjector (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-iniettore). Una macchia rossa (rosso fenolo) dovrebbe essere visibile nell&#39;embrione dopo l&#39;iniezione. Iniettare almeno 50 embrioni per ciascun esperimento. (Vedere il precedente protocollo Giove per un protocollo dettagliato sulla iniezione di RNA in embrioni di zebrafish 9). Nota: <ol type="A"><li> Un volume di circa 2NL dovrebbe essere usato per l&#39;iniezione di RNA in una cella-embrioni palco. Per determinare la quantità di RNA iniettato, dispensare un bolo di RNA in una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico calibrato o sotto un microscopio con una barra di scala costruita negli oculari. La goccia di RNA dovrebbe essere una sfera perfetta. Calcolare la quantità consegnata con la seguente equazione: Volume (in nl) = 4/3πr 3. Regolare il volume erogato, modificando la pressione di iniezione o il tempo sullo strumento. </li><li> Si deve inoltre fare attenzione a iniettare l&#39;importo più basso di RNA che consente di visualizzare il fluoroforo, come alte concentrazioni di RNA possono essere tossici per l&#39;embrione di sviluppo. Per determinare il livello appropriato di espressione, una curva dose-esperimento dovrebbe essere effettuato prima di eseguire l&#39;esperimento. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Ordina gli embrioni per rimuovere tutte le uova non fecondate o danneggiati e luogo tutti gli embrioni rimasti a 28.5 ° C. </li><li> Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio a fluorescenza dissezione per selezionare embrioni di zebrafish che hanno un alto livello di GFP (epidermide) e RFP (actina) fluorescenza. Mettere gli embrioni selezionati a 28,5 ° C fino al momento di procedere con il trattamento farmacologico per indurre l&#39;apoptosi. </li></ol> 2. Induzione di estrusione in cella Le larve Zebrafish utilizzando G418 Abbiamo scoperto che l&#39;esposizione al aminoglicoside antibiotico G418, o Geneticin, provoca apoptosi ed estrusione di cellule epidermiche nello sviluppo di larve di zebrafish 3 con un meccanismo sconosciuto. È importante sottolineare che questo trattamento funziona solo sulle larve che sono 4 giorni dopo la fecondazione e più anziani. Troviamo che ~ 5-25 cellule possono essere trovati estrusione in ogni momento dalla pinna epiteliali del pesce zebra G418 trattati larvale. Poiché la quantità di cellule apoptotiche estrusione può variare da pesce a pesce, è consigliato il montaggio più pesce per l&#39;imaging. <ol><li> Raccogliere e posto 4 giorno dopo la fecondazione (DPF) larve di zebrafish espositrici sia GFP e RFP fluorescenza in un piatto da 35 x 10 mm cultura contenente 3 millilitri (ml) di E3. Si può trattare fino a 25 larve di questo piatto cultura dimensioni. </li><li> Ricollocare accuratamente i media con 3mLs dell&#39;E3 1mg/mL contenenti delle larve G418 e incubare la droga per 4 ore a 28,5 ° C. Si noti che G418 è sensibile alla luce, in modo da fare attenzione a mantenere il piatto cultura coperto o al buio. </li><li> Rimuovere i supporti e sostituire con pre-riscaldato 28,5 ° C i media E3 contenente 0,02% Tricaine e procedere al montaggio delle larve. </li></ol> 3. Zebrafish Larve di montaggio per l&#39;imaging <ol><li> Trasferimento 3 larve in una provetta eppendorf da 1,5 ml e rimuovere la maggior parte delle E3 dopo il lavandino pesce a fondo della provetta. Abbiamo scoperto che fino a 3 animali possono essere correttamente montato prima l&#39;agarosio si solidifica. </li><li> Utilizzando una punta tagliata pipetta, 120ul pipetta di 1% LM-agarosio (42 ° C) nel tubo, mescolare, e poi delicatamente pipetta le larve e la miscela di agarosio sul coprioggetti sul fondo di un piatto cultura MatTek. </li><li> Utilizzando un supporto FST pin con un perno di inserimento o di tungsteno ago inserito, in modo rapido orientare le larve in modo che siano dritte e piatte contro il coprioggetti del piatto MatTek. Nota: Si utilizzano in genere un perno dritto al primo orientare le larve e poi una a forma di L pin per assicurare che siano piatti contro il coprioggetti evitando danni ai campioni. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, gentilmente riempire il piatto con E3 contenente 0,02% Tricaine. Nota: in alternativa, G418 può essere aggiunto alla E3 nel piatto di imaging per continuare estrusione indurre, anche se a lungo termine dell&#39;esposizione a 1mg/mL G418 ucciderà le larve. </li></ol> 4. Vivere Imaging di Dynamics actina e comportamenti individuali delle cellule epiteliali durante l&#39;estrusione cella utilizzando un microscopio confocale Disco Spinning Abbiamo scoperto che l&#39;intero processo di estrusione cellulare per apoptosi dall&#39;epidermide di sviluppo di larve di pesce zebra dura circa 20 minuti 3. Qui mostriamo come impostare un time-lapse esperimento di imaging per raccogliere una serie di piani z attraverso un singolo strato dell&#39;epidermide zebrafish di visualizzare il processo di estrusione. Abbiamo scoperto che widefield tipici microscopi a fluorescenza causa photobleaching significativa dei filamenti di actina e non consentono per l&#39;imaging Timelapse. Pertanto, per ottimizzare la nostra risoluzione e prevenire photobleaching, usiamo un microscopio confocale a disco rotante. Di seguito viene descritto come impostare l&#39;esperimento utilizzando il software IQ Andor con un microscopio Nikon, anche se i principi discussi possono essere applicati a microscopio simili set-up. <ol><li> In primo luogo, accendere la Argon (per l&#39;eccitazione del BPA a 488 nm) e HeNe (per l&#39;eccitazione del RFP a 561nm) laser, microscopio, macchina fotografica e lampada epifluorescente. </li><li> All&#39;interno della IQ Andor software (versione 1.10.1), creare un protocollo di serie temporali contenente le lunghezze d&#39;onda si vuole l&#39;immagine, la frequenza degli intervalli tra cattura immagine e il numero di volte la cattura deve essere ripetuto. </li><li> Posizionare delicatamente il piatto MatTek contenente il campione sul palco microscopio e utilizzare un obiettivo 20x con luce trasmessa di concentrarsi sulle larve. </li><li> Spostare il 40X obiettivo immersione in acqua (NA 0,8) nella posizione corretta. Usando questo obiettivo, possiamo pellicola circa 20-25 cellule per campo, che ci permette di seguire comportamenti cellulari durante l&#39;estrusione, mentre anche la risoluzione sub-cellulari dinamiche di actina. Nota: Il montaggio stesso e le strategie di imaging può essere applicata a microscopi diritti, anche se un obiettivo 40X immersione in acqua con una distanza di lavoro deve essere utilizzato. </li><li> Con attenzione una goccia d&#39;acqua sulla parte superiore dell&#39;obiettivo 40x e rapidamente posto il piatto MatTek in cima. None: Zeiss soluzione immersione Immersol può essere utilizzato anche se l&#39;evaporazione dell&#39;acqua è un problema. </li><li> Identificare il campione usando fase o illuminazione DIC e quindi utilizzare epifluorescenza 488 nm di concentrarsi specificamente sulle epidermide GFP positive. </li><li> Passare alla modalità di scansione confocale. Regolare l&#39;intensità del laser e tempo di esposizione per ciascuno dei canali (488nm e 561nm) di conseguenza. Fare attenzione a bilanciare la potenza del laser e il tempo di esposizione per il rilevamento ottimale del segnale e per prevenire qualsiasi photobleaching o tossicità. </li><li> Per identificare le cellule estrusione, utilizzare epifluorescenza per visualizzare la GFP etichettato epidermide e di identificare un gruppo di cellule in un modello classico rosetta, costituita da un insieme di cellule che circonda una piccola cella rotonda al centro. Utilizzando la modalità di scansione confocale, ci dovrebbe essere anche un accumulo di actina RFP marcato visibili come un anello intorno alla piccola cella rotonda in mezzo, un segno distintivo di estrusione in cella. Dopo aver identificato una cellula estrusione, impostare rapidamente il microscopio per acquisire 4D (XYZ-Time) set di dati confocale. </li><li> Impostare i punti superiore e inferiore all&#39;interno del piano z per visualizzare un singolo strato dell&#39;epidermide, tra cui la cellula estrusione, e selezionare il passo. Per time-lapse imaging, impostare gli intervalli per l&#39;acquisizione delle immagini e numero di ripetizioni. Per esempio, noi di solito acquisire una serie z-spanning 5-10μm, con una dimensione di 1 micron passo, ogni 1-2 minuti per 30 minuti. </li><li> Per visualizzare i dati, di solito fanno le proiezioni in 3-D della serie z e salvare il set di dati come file di filmato che è compatibile con Quick Time (Apple). In questo modo, possiamo visualizzare la contrazione del ring actina e comportamenti epiteliali che si verificano intorno alla cellula di morire nel corso del tempo. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schematica di estrusione cellulare per apoptosi. Filamenti di actina sono mostrati in rosso, le cellule GFP positive epidermiche sono verdi. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Flusso di lavoro sperimentale. A. Schema del flusso di lavoro per l&#39;esperimento. B. Espressione di RFP-UtrCH nell&#39;epidermide di un CK 4dpf: GFP zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Immagini fisse (z-proiezioni) da un time-lapse movie che segue dal vivo le dinamiche dell&#39;actina durante il processo di estrusione delle cellule epiteliali. Le frecce indicano l&#39;anello di actina formate da cellule vicine che si contrae e si chiude nel corso di 2 minuti.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Benessere degli animali Assurance Tutte le procedure eseguite in questo protocollo con il pesce zebra, Danio rerio, sono stati approvati dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Università di Utah (Assurance benessere degli animali # 10-07017).

Il protocollo qui descritto viene illustrato un metodo semplice e diretto per visualizzare il processo di estrusione in un tessuto vivo epiteliale. Questo tipo di esperimento ci permette di esaminare sottigliezze delle dinamiche di actina in precedenza non apprezzati nelle analisi del tessuto fisso, e quindi, integra comuni metodi di immunofluorescenza. Possiamo usare questo protocollo in associazione con inibitori chimici o mutanti genetici per analizzare meglio il processo di estrusione e stati patologici studio assoc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagente </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Serbatoi Crossing </td><td> Strumento </td><td> Thoren Aquatic Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La pompa Pipettare </td><td> Strumento </td><td> Bel Art Prodotti </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipetta Pasteur </td><td> Strumento </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microiniezione Mold </td><td> Strumento </td><td> Adaptive Scienza Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Piastra 100x15mm </td><td> Strumento </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipetta Puller </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> Modello P97 </td><td></td></tr><tr><td> Capillari in vetro borosilicato con filamento </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, ID 0,78 millimetri, lunghezza 10 centimetri </td></tr><tr><td> Conservazione elettrodi Jar </td><td> Strumento </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% nel DPBS </td></tr><tr><td> Pressione controllata Microinjector e Micromanipolatore </td><td> Strumento </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Dish 35x10mm </td><td> Strumento </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml in DH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12 centimetri Pin Holder </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserisci Pins </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26007-02 e-03 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto di vetro Cultura basso con 1,5 coprioggetti </td><td> Strumento </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt agarosio </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescente microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio confocale Disco </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> Ti Eclipse </td><td> Dotato di un disco che gira la testa Yokagawa </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Macchina fotografica </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron pixel quadrati </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Mantenimento dell&#39;omeostasi dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate senza interrompere la funzione di barriera. I nostri studi hanno trovato che le cellule morenti inviare segnali ai loro vicini di formare e vivere contratto un anello di actina e miosina che lo espelle fuori dal foglio epiteliali durante la chiusura eventuali lacune che potrebbero avere provocato dalla sua uscita, un processo chiamato estrusione in cella 1. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrive un metodo per indurre e estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale. Per visualizzare estrusione, abbiamo iniettare una sonda rossa proteina fluorescente etichettato per la F-actina in una cella di embrioni di zebrafish fase transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde a livello epidermico e indurre apoptosi mediante l&#39;aggiunta di G418 di larve. Utilizziamo quindi time-lapse imaging su un microscopio confocale a disco rotante per osservare dinamiche di actina e dei comportamenti delle cellule epiteliali durante il processo di estrusione cellulare per apoptosi. Questo approccio ci permette di indagare il processo di estrusione a vivere epiteli e fornirà una via per studiare stati di malattia causata dalla mancata eliminazione di cellule apoptotiche.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Utah. Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Ricerca

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.