Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Yong-Ling Zhu per fornire lo synaptophysin-pHluorin2x costrutto e Dr. James E. Rothman per fornire VAMP2-phluorin. Ringraziamo Dr. Susan Cheng e Virginia Crocker di NINDS microscopia elettronica Facility per loro guida e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo programma di ricerca intramurale in USA e una sovvenzione dal programma iniziativa ricerca KRIBB (coreano Biomedical Scientist Fellowship Program), Korea Research Institute di Bioscienze e biotecnologie, Repubblica di Corea.

Nota: il seguente protocollo descrive i metodi di formazione immagine di pHluorin e metodi EM utilizzati in neuroni hippocampal coltivati. pHluorin monitor delle vescicole sinaptiche proteine l'assorbimento nelle cellule viventi ed EM rileva l'assorbimento delle vescicole sinaptiche e cambiamenti ultrastrutturali.
 cura degli animali e procedura seguite linee guida NIH e sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali NIH.
 1. pHluorin Imaging <ol><li>cultura Neurone ippocampale <ol><li>preparare ippocampo Buffer (HB) combinando 4 NaHCO 3 e 5 mM HEPES e regolare a pH 7,3 con 5 M NaOH. Fare il terreno di coltura mescolando neurobasal medi, 2% B27, 0,5 mM L-Glutammina e 1% di penicillina-streptomicina. Inoltre, preparare una miscela di tampone HB con 20% di siero bovino fetale (FBS HB/20%). 
		Nota: Il presente protocollo coltura si basa su Sankaranarayanan, et al. 29 e Wu et al. 24</li> <li>decapitare i cuccioli del mouse tra postnatale giorno 0 al giorno 2 in terreno di coltura ed estrarre il cervello nella 4 ° C HB/20% FBS. Rimuovere il tronco cerebrale ed il talamo per esporre ippocampi. Sezionare ippocampi, dopo esporla tramite rimozione del tronco cerebrale e nel talamo e trasferire al fresco 4 ° C HB/20% FBS. 
		Nota: In genere, la resa è circa 4 x 10 5 cellule/mL per un cucciolo (due ippocampi). Pulire le membrane aderente con una pinzetta o forbici, poi il trasferimento a fresco 4 ° C HB/20% FBS. Srotolare la circonvoluzione dentata e isolare il subiculum tagliando con le forbici, poi trasferimento a fresco 4 ° C HB/20% FBS.</li>
		<li>Dividere ogni ippocampo, dal taglio dall'inizio alla fine, a circa 10 fette e trasferirli in un tubo conico in polipropilene 15ml.</li>
		<li>Dopo che permette al tessuto di stabilirsi, lavare con 10 mL di HB/20% FB e poi lavare tre volte con 10ml di HB.</li>
		<li>Preparare la soluzione di digestione di 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 7mm Na2HPO 4 e 25 mM HEPES e regolare il pH a 7,2 con NaOH M 5. Rimuovere il surnatante da ippocampi. Aggiungere 2 mL di soluzione di digestione 10 mg di tripsina e 1 mg di DNasi e filtrare attraverso una membrana da 0,22 µm sterile direttamente sul pellet campione.</li>
		<li>Incubare ippocampi per 5 min a 37 ° C, quindi lavate due volte con 10 mL di HB/20% FB e poi lavare una volta con 10 mL di HB.</li>
		<li>Dissociare le cellule con 6 mg di MgSO 4 &#8729; 7 H 2 O e 1 mg di dnasi a 2 mL HB e filtro sterile sul ippocampi a pellet attraverso un filtro da 0,22 µm sterile. Delicatamente dissociare le cellule mediante triturazione attenzione, avendo cura di evitare di introdurre bolle d'aria. Consentire le particelle di tessuto a stabilirsi per 2 min e poi lentamente trasferire il surnatante in un'altra provetta.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL HB/20% FBS alla sospensione cellulare e centrifuga o 10 min a 4 ° C e 1000 giri/min. Scartare il surnatante e risospendere in terreno di coltura.</li>
		<li>Piastra 60.000 cellule sospese nel 150 µ l di coltura su un vetrino coprioggetti 25 mm diametro di poli-D-lisina rivestito, senza fuoriuscita fuori il vetrino coprioggetti. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldato 2 h dopo il placcaggio. Le lamelle sono mantenute in coltura piastre da 6 pozzetti o Petri sterili.</li>
		<li>Cellule di mantenere a 37 ° C in un 5% CO 2 umidificati incubatore in terreno di coltura per 14-21 giorni prima della registrazione. Durante la crescita di cultura, cambiare la metà superiore del mezzo due volte a settimana.</li>
	</ol></li> <li>Transfezione <ol><li>6-7 giorni dopo il placcaggio, transfect synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) o VAMP2-pHluorin in neuroni ippocampali. Per SpH, utilizzare un promotore del citomegalovirus (CMV), inserito in un di vettore pcDNA3 30. Per VAMP2-pHluorin, utilizzare un promotore CMV inserito in un vettore di pCI 31.</li>
		<li>Transfect entrambi vector di elemento portante del lipido in cellule bersaglio, usando 1 µ g del plasmide. Utilizzare il terreno di coltura dal passaggio di protocollo 1.1.1, che manca del siero, per la transfezione. Modificare il mezzo 2 h dopo la trasfezione per ridurre la tossicità. 
		Nota: In caso di bassa espressione di SpH nel boutons, aumentare la concentrazione di DNA 2 µ g o il tempo di incubazione con il vettore del lipido, a meno che le cellule sono malsane. In genere, 4-10 celle (0,006-0,008%) dei neuroni transfected.</li>
	</ol></li> <li>Microscopia <ol><li>preparare soluzione salina normale è composto da 119 mM NaCl, 2mm CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), glucosio di 30 mM, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione CNQX) e 0,05 mM acido DL-2-ammino-5-phosphonovaleric (AP5). Prendere un vetrino coprioggetto dalla piastra di terreno di coltura e posto su una camera di imaging che permette una stimolazione di campo, con lubrificante e sigillante per evitare perdite. Evitare di lasciare che il vetro asciutto durante il trasferimento di un vetrino coprioggetto dalla piastra alla camera immediatamente aggiungendo 750 µ l di soluzione salina normale. 
		Nota: CNQX e AP5 sono stati utilizzati per bloccare l'attività post-sinaptica, che ha il potenziale per attività ricorrente. Prima di mettere una camera su un microscopio a fluorescenza invertito, è possibile utilizzare tessuto di pulizia per confermare che la camera non ci siano perdite. Colatura lento causa i cambiamenti di messa a fuoco durante la registrazione dalla miscelazione di normale soluzione salina e immersione olio, che si traduce in cambiamenti nell'indice di rifrazione.</li>
		<li>Stimolazione e registrazione d'immersione in olio (apertura numerica 1,4) <ol><li>immagine su un microscopio invertito widefield con un 60 X lente con una lampada ad alogenuri metallici. Visualizzare pHluorin con un filtro impostato per un picco di eccitazione di 480 nm, uno specchio di passaggio lungo 490 nm, un filtro di emissione di 500-550 nm e un otturatore manuale flip. Catturare immagini ogni 100 ms, con 2 x 2 binning, utilizzando una telecamera di elettrone moltiplicando Charge Coupled dispositivo (EMCCD). 
			Nota: Molte funzionalità dovrebbe essere considerata per raggiungere le giuste condizioni per evitare il photobleaching, compreso l'intervallo di acquisizione immagine e filtrare e binning, che sono dipendenti da attrezzature. Nel caso di imaging confocale, laser potenza e tempo di esposizione dovrebbe essere considerato per evitare photobleaching. L'installazione è stata determinata dopo aver registrato almeno 3 min senza stimolo e la registrazione è stata effettuata per almeno 10 s senza stimolo per cercare photobleaching.</li>
			<li>Scegliere una zona con un'alta densità dei boutons per facilitare l'analisi in ogni esperimento. Identificare cellule trasfettate dal loro segnale di fluorescenza verde, con enfasi sui modelli di espressione rotonda o ovale nelle bouton ed espressione continua tra boutons.</li>
			<li>Induce endocitosi di stimolazione di campo utilizzando un 1 impulso ms, 20 mA potenziale d'azione (AP) fornito da uno stimolatore di impulso e trasportato attraverso un elettrodo di platino all'interno dell'unità di isolamento di stimolo. Attività fluorescenza della battuta nel corso della stimolazione e durante il recupero delle cellule. 
			Nota: Nel caso di cellule morte, espressione era più forte di vita boutons e ha mostrato un modello irregolare tra boutons.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Analisi dell'immagine <ol><li>Per analizzare l'intensità di fluorescenza in una singola bouton, impostato su una regione di interesse (ROI) come un 1,5 x 1,5 µm quadrati; la dimensione di una bouton è all'interno di circa 1,5 µm. uso le tracce prima della stimolazione per controllare photobleaching e sottrarre come sfondo.</li>
		<li>Normalizza fluorescenza cambiare (ΔF) con l'equazione: <img alt="Equation" height="11" src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" width="172" /> dove F max e F 0 si riferiscono al massimo incremento dopo stimolazione e fluorescenza della linea di base, rispettivamente. Misurare endocitosi tassi come il tasso di decadimento durante i primi 4-10 s dopo il punto massimo di fluorescenza di pHluorin. Ottenere la costante di tempo (τ) dell'endocitosi inserendo il deperimento di fluorescenza di pHluorin dall'aumento del picco alla linea di base con una funzione mono-esponenziale.</li>
	</ol></li></ol> 2. Microscopia elettronica <ol><li>preparare una poli-D-lisina 6-pozzetti piatto rivestito di applicazione 1,5 mL di soluzione di poli-D-lisina filtrato sterile 0,01% ad ogni pozzetto per 1 h a temperatura ambiente, poi lavare tre volte con acqua sterilizzata. Sezionare, cultura e mantenere i neuroni hippocampal come punti 1.1.1, 1.1.2 e 1.1.3, rispettivamente.</li>
	<li>Preparare una soluzione di stimolazione elevata K + con HRP come 31,5 mM NaCl, 2mm CaCl 2, 90 mM KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), glucosio di 30 mM, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 e 5 mg/mL HRP, quindi regolare il pH 7.4 con 5 M NaOH.
	Soluzione di stimolazione K + <ol><li>stimolare la cultura del neurone ippocampale con 1,5 mL alto a temperatura ambiente (denominato K +) tramite l'aggiunta di 1,5 mL per ciascun pozzetto per 90 s. In condizione di riposa (denominata R), applicare la stessa concentrazione di 5 mg/mL HRP per 90 s, ma con normale soluzione salina. Per l'esempio di recupero, applicare la soluzione di stimolazione elevata K + come con l'esempio K +, poi rapidamente lavare e sostituire con normale soluzione salina e incubare per 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Fissazione e colorazione <ol><li>preparare tampone cacodilato Na di 0.1 M utilizzando 21,4 g/L Na cacodylate a pH 7,4. Fissare le cellule con glutaraldeide al 4% in tampone cacodilato di 0.1 M Na per almeno 1 h a temperatura ambiente. Lavare tre volte con tampone cacodilato Na di 0.1 M per 7 minuti ciascuno,.</li>
		<li>Soluzione di preparare diaminobenzidina (DAB), composto da 0,5 mg/mL di tamponare con 0,3% H 2 O 2 ddH 2 O, ed il filtro con un filtro di 0,22 µm. Applicare 1,5 mL di soluzione DAB per 30 min a 37 ° C. lavare tre volte con tampone cacodilato Na di 0.1 M per 7 minuti ciascuno,. 
		Attenzione: DAB è un tossico e sospetto cancerogeno. Si prega di utilizzare guanti e camici da laboratorio. 
		Nota: Etichettatura con DAB si verifica a causa della sua ossidazione di H 2 O 2, come catalizzata da HRP. Piccoli aumenti nel risultato di componenti in un segnale aumentato nel campione. Aumento della concentrazione di HRP accelera l'effetto del catalizzatore. Sufficientemente grandi concentrazioni di H 2 O 2 consentono debilitante reazioni secondarie con HRP, inibendo l'effetto dell'etichettatura 32. In questo lavoro, le concentrazioni di questo sistema di etichettatura sono stati scelti in base alla ricerca attualmente disponibili 33 , 34.</li>
		<li>Incubare i neuroni con 1,5 mL di 1% OsO 4 in tampone cacodilato Na di 0.1 M per 1 h a 4 ° C, come la fissazione della posta. Lavare tre volte con 1,5 mL di tampone cacodilato Na di 0.1 M per 7 minuti ciascuno,. 
		Attenzione: A causa della tossicità e la reattività di OsO 4, mantenendo il campione sul ghiaccio in una cappa chimica è preferibile in molti casi utilizzando un frigo per l'incubazione.</li>
		<li>Preparare 0.1 M tampone acetato di sodio con 13,61 g/L sodio acetato e 11,43 mL/L acido acetico glaciale a pH 5.0. Lavare tre volte con tampone di acetato 1,5 mL 0,1 M a pH 5.0 per 7 minuti ciascuno e incubare con acetato di uranile 1,5 mL 1% in tampone acetato 0,1 M a pH 5.0 per 1 h a 4 ° C. Wash tre volte con tampone di acetato 0,1 M 1,5 mL per 7 minuti ciascuno,.</li>
	</ol></li> <li>Epossidica embedding <ol><li>disidratare la cultura del neurone con lavaggi di singolo 1,5 mL di etanolo 50%, 70% e 90%, 7 min in ciascuno e poi 3 lavaggi di 1,5 mL di etanolo al 100% per 7 minuti ciascuno, in una cappa aspirante.</li>
		<li>Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin), resina di anidride di 160 mL/L dodecenyl succinico (DDSA), 340 mL/L metil-5-Norbornene-2,3-dicarbossilico anidride acetica (NMA) e 15 mL/L 2, 4,6-tris (dimethylaminomethyl) fenolo (DMP-30) per creare la resina epossidica resina. Mix accuratamente, quindi memorizzare sotto vuoto per eliminare le bolle d'aria. 
		Nota: È fondamentale per rimuovere le bolle d'aria nella resina, soprattutto quelli inferiori visibili ad occhio nudo, perché possono causare cavità nella resina durante il sezionamento.</li>
		<li>Si infiltra nell'esempio sostituendo l'etanolo con 50% resina epossidica resina in etanolo per 30 min a temperatura ambiente in un agitatore, poi 70% resina epossidica in etanolo per 30 min a temperatura ambiente in un agitatore.</li>
		<li>Interruttore la resina epossidica resina soluzione con resina epossidica di 100% e incubare per 10 min a 50 scambi di eseguire due ° C. dell'epossiresina 100% fresco con incubazioni per 1 h a 50 ° C. Aggiungi fresco 100% resina epossidica resina e lasciar per indurire a 50 ° C durante la notte e poi a 60 & n. 17 6; C per oltre 36 h a indurire.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere ogni campione da muti-pozzetti con un gioielliere &#39; sega a mano s. Selezionare le regioni di interesse, dense concentrazioni di cellule, utilizzando un microscopio ottico invertito e poi tagliare blocchi nm 70-80 per il sezionamento di microtomo. Montare la regione di taglio nel mandrino microtomo e caricare il microtomo. Posizionare il mandrino nel microtomo e montare una lama di diamante con il bordo parallelo alla superficie del blocco. Raccogliere le sezioni di spessore nm 70-80 direttamente sulle griglie individuali.</li>
	<li>Sciogliere acetato di uranile in acqua per una soluzione di 1% in peso e sciogliere separatamente citrato di piombo in acqua per una soluzione al 3% in peso. Colorante di contrasto le sezioni da immersione con acetato di uranile acquosa 1% per 15 min e poi 3% acquosa piombo citrato per 5 min migliorare il contrasto dei campioni.</li>
	<li>Formazione immagine EM <ol><li>esaminare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione e registrare le immagini con una fotocamera digitale CCD ad un ingrandimento primario di 10.000-20, 000 X 3.</li>
	</ol></li> <li>Statistiche <ol><li>eseguire un t-test per identificare differenze significative confrontando la media e l'errore standard di misura (s.e.m.) tra il controllo e i campioni sperimentali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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L., Puchkov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin/AP-2+mediate+synaptic+vesicle+reformation+from+endosome-like+vacuoles+but+are+not+essential+for+membrane+retrieval+at+central+synapses.">Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses.</a> Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).</li><li>Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamin+1-,+dynamin+3-+and+clathrin-independent+pathway+of+synaptic+vesicle+recycling+mediated+by+bulk+endocytosis.">A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis.</a> eLife. 2014 (3), e01621 (2014).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+recycling+of+synaptic+vesicle+membrane+during+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+transmitter+and+synaptic+vesicles+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).</li><li>Watanabe, S., Rost, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li><li>Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+has+a+molecular+scaffolding,+not+propulsive,+role+in+presynaptic+function.">Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pathways+of+synaptic+vesicle+retrieval+revealed+by+single-vesicle+imaging.">Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging.</a> Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., Garc&#237;a-C&#225;novas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+peroxidase+by+hydrogen+peroxide+and+its+protection+by+a+reductant+agent.">Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent.</a> Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).</li><li>De&#225;k, F., Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptobrevin+is+essential+for+fast+synaptic-vesicle+endocytosis.">Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling.">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li><li>Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+spread+and+confinement+of+newly+exocytosed+synaptic+vesicle+proteins.">Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins.</a> Nat Commun. 6, 8392 (2015).</li><li>Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity-dependent+bulk+endocytosis+with+the+genetically-encoded+reporter+VAMP4-pHluorin.">Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin.</a> J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).</li><li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin.">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li><li>Wisse, E., Braet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+Photodamage+in+Live-Cell+Microscopy.">Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>S&#248;ndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui dimostriamo due metodi per il monitoraggio di endocitosi delle vescicole sinaptiche. Nel primo metodo, abbiamo monitorato pHluorin fuse con una proteina della vescicola sinaptica nei neuroni trasfettati e successivamente elettricamente stimolata. In secondo luogo, abbiamo usato la formazione immagine EM dell'assorbimento HRP come indotto da KCl. Abbiamo usato diversi stimoli per due motivi. In primo luogo, applicazione di potassio induce la depolarizzazione di tutti i neuroni nella cultura. Questo facilita l'esame EM...

Neurotrasmettitori sono memorizzati in vescicole sinaptiche e distribuiti dalla esocitosi. La membrana della vescicola sinaptica e la proteina sono quindi interiorizzati dal endocytosis e riutilizzati nel prossimo turno di esocitosi. Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono importante per il mantenimento piscine delle vescicole sinaptiche e rimuove vescicole sporgente dalla membrana plasmatica. PHluorin la proteina fluorescente verde sensibili al pH, che è spenta in circostanze acide e dequenched a pH neutro, è stato utilizzato per misurare il tempo di endocitosi corsi in diretta le cellule1,2,3. La proteina di pHluorin è in genere associata al lato lumenal di proteine delle vescicole sinaptiche, come lo synaptophysin o VAMP2/sinaptobrevina. A riposo, pHluorin è spenta in lumen pH 5,5 delle vescicole sinaptiche. Fusione della vescicola alla membrana plasmatica espone il lume vescicolare alla soluzione extracellulare dove il pH è ~ 7.3, conseguente aumento nella fluorescenza pHluorin. Dopo l'esocitosi, l'aumento della fluorescenza decade, a causa di endocitosi delle proteine delle vescicole sinaptiche, seguita da ri-acidificazione vescicola all'interno di tali vescicole recuperate. Anche se il decadimento riflette sia endocitosi e ri-acidificazione vescicolare, essa riflette principalmente endocitosi, perché ri-acidificazione è più veloce di endocitosi nella maggior parte delle condizioni1,4. La costante di tempo di ri-acidificazione è 3-4 s o meno5,6, che è generalmente più veloce di 10 s o superiore richiesto per endocitosi delle vescicole4,5. Se sono necessari esperimenti per distinguere endocitosi da ri-acidificazione, acidi dissetante esperimenti utilizzando la soluzione di (MES) acida 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) con un pH di 5.5 possono essere utilizzati per determinare se vengono recuperate proteine delle vescicole sinaptiche dalla membrana del plasma tramite endocitosi1,3,4. Così, l'aumento di intensità di fluorescenza pHluorin riflette un equilibrio di exo - ed endocitosi e la diminuzione dopo stimolazione del nervo in particolare riflette endocitosi.
pHluorin formazione immagine può essere usata non solo per misurare il corso di tempo dell'endocitosi, ma anche la dimensione della vescicola sinaptica piscine7,8, e la probabilità di rilascio evocato e spontaneo versione9. Molti fattori e proteine coinvolte nella regolazione di endocitosi, quali calcio, le proteine solubili NSF-attachment proteina recettore (rullante), factor(BDNF) neurotrophic cervello-derivato e della calcineurina sono stati identificati usando pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Inoltre, il rilascio di neurotrasmettitore potrebbe essere rilevata nei neuroni non solo primari ma in cellule di neuroblastoma con TIRFM17. Recentemente, pHTomato, dsRed, mOrange e varianti di pHluorin sono stati sviluppati per il monitoraggio di registrazioni simultanee di fattori multipli in una singola sinapsi18,19. Ad esempio, pHTomato è stato fuso con lo synaptophysin e utilizzato con un indicatore di calcio codificato geneticamente (GCaMP5K) per monitorare la fusione della vescicola presinaptica e afflusso di Ca2 + nel compartimento postsinaptico20. Di conseguenza, pHluorin associata a proteine sinaptiche fornisce un metodo utile per analizzare la relazione fra endocitosi ed esocitosi.
EM è un altro metodo comunemente usato per lo studio di endocitosi, grazie all'elevata risoluzione spaziale che mostra i cambiamenti ultrastrutturali durante endocitosi. Due aree generali sono la capacità di visualizzare cambiamenti patologici all'interno di cellule neuronali21 e tenere traccia della vescicola proteine22. In particolare, l'osservazione dell'assorbimento delle vescicole sinaptiche, curvatura di membrana rivestite di clatrina nella zona periattiva ed endosomal strutture sono possibili con EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mentre EM comporta potenziali artefatti, come fissativo-indotto malformazioni, che possono pregiudicare la endocitosi, e analisi dei dati è laboriosa, che la risoluzione fornisce un'opportunità interessante per visualizzare la struttura cellulare. Potenziali problemi di fissativo e la limitazione a risoluzione temporale EM può essere superati da alta pressione congelamento, fornendo un metodo veloce e non chimici di stabilizzare le delicate strutture presenti durante endocitosi27.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine LTX with Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td></tr><tr><td>neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504-044</td><td>Gradient for neuronal differentiation</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td>Gradient for neuronal culture</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td><td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td></tr><tr><td>Trypsin XI from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td></tr><tr><td>pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td>model 2100</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>Slotted bath with field stimulation</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>stimulus isolation unit</td><td>Warner Instruments</td><td>SIU102</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>lubricant</td><td>Dow corning</td><td>111</td><td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td></tr><tr><td>AP5</td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Metal halide light source for pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon3</td><td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td></tr><tr><td>Inverted microscopy</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Software for imaging acquisition and analysis</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Software for imaging analysis and data presentation</td></tr><tr><td>imaging chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC21B</td><td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td></tr><tr><td>poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase(HRP)</td><td>Sigma</td><td>P6782</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td></tr><tr><td>Na cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine(DAB)</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16365</td><td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td></tr><tr><td>CCD digital camera</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>Electron microscopy, capturing images</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Leica microsystems</td><td>16707235</td><td>Electron microscopy, grid staining</td></tr></tbody></table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

Durante endocitosi, fusione delle vescicole sinaptiche sono Estratto alle terminazioni nervose, permettendo per riciclo delle vescicole e quindi il mantenimento della trasmissione sinaptica durante la cottura ripetuto del nervo. Alterata endocitosi in condizioni patologiche conduce alle diminuzioni in funzioni sinaptiche di forza e cervello. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per misurare la endocitosi delle vescicole sinaptiche alla sinapsi ippocampo mammifera in coltura neuronale. Abbiamo monitorato endocitosi proteine delle vescicole sinaptiche fondendo una proteina di membrana vescicolare sinaptica, compreso lo synaptophysin e VAMP2/sinaptobrevina, sul lato di lumenal vescicolare, con pHluorin, una proteina fluorescente verde di pH sensibili che aumenta la sua aumenta l'intensità di fluorescenza come il pH. Durante l'esocitosi, vescicolare lumen pH aumenta, mentre durante il lume vescicolare endocitosi pH è ri-acidificato. Così, un aumento dell'intensità di fluorescenza pHluorin indica fusione, mentre una diminuzione indica endocitosi della proteina marcata delle vescicole sinaptiche. Oltre a utilizzare il metodo di imaging pHluorin per registrare endocitosi, abbiamo monitorato endocitosi membrana vescicolare da misure di microscopia elettronica (EM) del rafano perossidasi (HRP) assorbimento dalle vescicole. Infine, abbiamo monitorato la formazione dei pozzi di membrana terminale del nervo in tempi diversi dopo la depolarizzazione indotta da potassio alta. Il corso di formazione di pozzo di assorbimento e membrana HRP tempo indica il corso di tempo dell'endocitosi.

Utilizzando il metodo di elemento portante del lipido, SpH è stato espresso nei neuroni dell'ippocampo, che consenta l'identificazione dei boutons (Figura 1a). La stimolazione elettrica delle cellule indotto esocitosi e un corrispondente aumento in intensità di fluorescenza. L'aumento della fluorescenza (ΔF) è stato interrotto terminando lo stimolo (Figura 1b). L'aumento della fluorescenza è stata seguita da una lenta diminu...

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Video: Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Neuroscienze

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons 

<a href='https://app.jove.com/v/55862/measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons'>Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the analysis of synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons through horseradish peroxidase labeling and electron microscopy.

Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the ...

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ippocampale

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati utilizzando sonde fluorescenti

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

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Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

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Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

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