Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Wir danken Dr. Yong-Ling Zhu für Synaptophysin-pHluorin2x Konstrukt, und Dr. James E. Rothman für die Bereitstellung von VAMP2-Phluorin. Wir danken Dr. Susan Cheng und Virginia Crocker NINDS Elektronenmikroskopie Anlage für ihre technische Unterstützung und Hilfe. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall Intramural Research Program in den USA und einen Zuschuss aus dem KRIBB Initiative Forschungsprogramm (Koreanisch biomedizinische Wissenschaftler Fellowship Program), Korea Research Institute of unterstützt. Biowissenschaften und Biotechnologie, Republik Korea.

Hinweis: das folgende Protokoll beschreibt die pHluorin bildgebenden Verfahren und EM Methoden in kultivierten hippocampal Neuronen. pHluorin Monitore synaptischen Vesikel Protein Aufnahme in lebenden Zellen und EM erkennt Aufnahme von synaptischen Vesikel und Ultrastrukturforschung Änderungen.
 Tierpflege und Verfahren NIH Richtlinien befolgt und waren von der NIH Tier Pflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.
 1. pHluorin Imaging <ol><li>Hippocampal Neuronen Kultur <ol><li>Prepare Hippocampus Puffer (HB) durch die Kombination von 4 mM Nahco3 3 und 5 mM HEPES und pH 7.3 mit 5 M NaOH einstellen. Machen Sie das Kulturmedium durch Mischen Neurobasal Mittel, 2 % B27, 0,5 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Darüber hinaus bereiten Sie eine Mischung von HB Puffer mit 20 % fötalen Rinderserum (HB/20% FBS). 
		Hinweis: Diese Kultivierung Protokoll basiert auf Sankaranarayanan, Et al. 29 und Wu Et al. 24</li> <li>Maus Welpen zwischen postnatale Tag 0, Tag 2 in Kulturmedium zu enthaupten, und entpacken Sie das Gehirn in 4 ° C HB/20% FBS. Entfernen Sie den Hirnstamm und Thalamus, die Hippocampi verfügbar zu machen. Sezieren, die Hippocampi nach durch Entfernung der Hirnstamm und Thalamus, Freilegung und transfer zum frischen 4 ° C HB/20% FBS. 
		Hinweis: In der Regel ergibt sich eine ca. 4 x 10 5 Zellen/mL für einen Welpen (zwei Hippocampi). Reinigen Sie die anhaftenden Membranen mit Schere oder Pinzette, dann übertragen auf frischen 4 ° C HB/20% FBS. Entrollen dentate Gyrus und das Subiculum durch Schneiden mit der Schere zu isolieren, dann transfer zum frischen 4 ° C HB/20% FBS.</li>
		<li>Jeder Hippocampus, durch Schneiden von Anfang bis Ende in etwa 10 Scheiben teilen und übertragen Sie sie auf eine 15 mL Polypropylen konischem Rohr.</li>
		<li>Nach Abzug des Gewebes zu begleichen, mit 10 mL HB/20% FBS waschen und waschen dann dreimal mit 10 mL HB.</li>
		<li>Aufschlusslösung von 137 mM NaCl, KCl 5 mM und 7 mM Na2HPO 4 25 mM HEPES vorzubereiten und auf pH 7,2 mit 5 M NaOH einstellen. Die Hippocampi entfernen Sie überstand. 2 mL der Aufschlusslösung 10 mg Trypsin und 1 mg DNase hinzu, und Filtern Sie durch eine sterile 0,22 µm Membran direkt auf die Probe-Pellet.</li>
		<li>Hippokampi für 5 min bei 37 ° C inkubieren dann zweimal mit 10 mL HB/20% FBS waschen und waschen dann einmal mit 10 mL der HB.</li>
		<li>Distanzieren die Zellen mit 6 mg MgSO 4 &#8729; 7 H 2 O und 1 mg zu 2 mL HB und Sterilfilter auf die Hippocampi DNase pellet durch einen sterilen 0,22 µm-Filter. Distanzieren Sie sanft die Zellen durch vorsichtig verreiben und kümmert sich um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Gewebe-Partikel für 2 min vereinbaren lassen, und übertragen Sie dann langsam den Überstand auf eine andere Röhre.</li>
		<li>Add 3 mL HB/20% FBS Zellsuspension, und Zentrifuge oder 10 min bei 4 ° C und 1.000 u/min. Den Überstand verwerfen und in Kulturmedium Aufschwemmen.</li>
		<li>Platte 60.000 Zellen in 150 µL Nährmedium auf einem Poly-D-Lysin beschichtet 25 mm Durchmesser Deckgläschen, ohne Überlauf aus dem Deckglas ausgesetzt. Fügen Sie 2 mL vorgewärmten Kulturmedium 2 h nach Beschichtung. Deckgläsern in Kultivierung 6-Well-Platten oder sterile Petrischalen gepflegt werden.</li>
		<li>Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer 5 % CO 2 befeuchteten Inkubator in Kulturmedium für 14-21 Tage vor der Aufnahme. Die obere Hälfte des Mediums ändern während des Wachstums Kultur zweimal pro Woche.</li>
	</ol></li> <li>Transfection <ol><li>6-7 Tage nach der Beschichtung, transfizieren Synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) oder VAMP2-pHluorin in hippocampal Neuronen. Verwenden Sie für SpH Cytomegalovirus (CMV) Förderer, eingefügt in eine pcDNA3-Vektor- 30. Für VAMP2-pHluorin, verwenden Sie einen CMV-Promotor in einem PCI-Vektor 31 eingefügt.</li>
		<li>Transfect entweder Vektors durch Lipid-Träger in Zielzellen, mit 1 µg Plasmid. Verwenden Sie Kulturmedium von Protokoll Schritt 1.1.1, die Serum fehlt, für die Transfektion. Ändern des Mediums 2 h nach Transfektion Toxizität reduzieren. 
		Hinweis: Bei geringer Expression von SpH in der Boutons, erhöhen Sie die DNA-Konzentration 2 µg oder die Inkubationszeit mit der Lipid-Träger, wenn die Zellen ungesund sind. In der Regel 4-10 Zellen (0,006-0,008 %) von Neuronen wurden transfiziert.</li>
	</ol></li> <li>Lichtmikroskopie <ol><li>normale Kochsalzlösung vorbereiten, bestehend aus 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0,01 mM) CNQX) und 0,05 mM DL-2-amino-5-Phosphonovaleric Säure (AP5). Nehmen Sie ein Deckglas aus dem Kulturmedium Platte und auf eine bildgebende Kammer, die Feld-Stimulation, mit Schmier- und Dichtungsmittel um Leckagen zu vermeiden kann. Lassen Sie das Glas während des Transfers von einem Deckgläschen aus der Platte in die Kammer trocknen durch Zugabe von sofort 750 µL normale Kochsalzlösung. 
		Hinweis: CNQX und AP5 wurden zur postsynaptischen Aktivität zu blockieren, die das Potenzial für wiederkehrende Aktivität hat. Vor eine Kammer auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop Reinigungstuch um zu bestätigen, dass die Kammer nicht leckt, verwenden. Langsam undicht Fokusänderungen während der Aufnahme durch das Mischen von normalen Kochsalzlösung und Immersion Öl, führt zu Veränderungen in der Brechungsindex Ursachen.</li>
		<li>Stimulation und Aufnahme <ol><li>Bild auf eine invertierte Weitfeld-Mikroskop mit einer 60 X (1.4 numerische Apertur) Ölimmersion Objektiv mit einem Metalldampflampen. Visualisieren von pHluorin mit einem Filtersatz für eine Erregung Peak von 480 nm, 490 nm langen Pass Spiegel, einen 500-550 nm Emission Filter und ein manueller Flip Shutter. Die Aufnahmen alle 100 ms, mit 2 x 2 binning, mit einem Elektron Multiplikation kostenlos gekoppelten Gerät (EMCCD) Kamera. 
			Hinweis: Einige Features sollte als erreichen die richtigen Bedingungen Immunofluoreszenz, einschließlich das Bild Erfassungsintervall zu vermeiden und Filtern und binning, welche Ausrüstung abhängig. Bei konfokale Bildgebung berücksichtigen die Laser Power und Belichtung Zeit Immunofluoreszenz zu vermeiden. Das Setup war entschlossen, nach der Aufnahme mindestens 3 min ohne Reiz und die Aufnahme erfolgte für mindestens 10 s ohne Reiz für Immunofluoreszenz überprüfen.</li>
			<li>Wählen Sie einen Bereich mit einer hohen Dichte von Boutons zur Erleichterung der Analyse in jedem Experiment. Transfizierte Zellen zu identifizieren, durch ihre grüne Fluoreszenzsignal, mit Schwerpunkt auf runden oder ovalen Expressionsmuster in der Bouton und kontinuierlichen Ausdruck zwischen Boutons.</li>
			<li>Induzieren Endozytose durch Feld Stimulation mit einer 1 ms Pulse, 20 mA Aktionspotential (AP) aus einem Puls-Stimulator versorgt und durch eine Platin-Elektrode innerhalb der Reiz-Isolierung-Einheit geliefert. Fluoreszenz-Aktivität im Verlauf der Stimulation und während der Zelle Wiederherstellung Bild. 
			Hinweis: Im Falle von abgestorbenen Zellen, Ausdruck war stärker als lebende Boutons und zeigte ein lückenhaftes Muster zwischen Boutons.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Bildanalyse <ol><li>Für die Analyse der Fluoreszenzintensität in einem einzigen Bouton, festgelegt, eine Region von Interesse (ROI) als ein 1,5 x 1,5 µm quadratisch; die Größe des ein Bouton befindet sich etwa 1,5 µm. Gebrauchsspuren vor Stimulation für Immunofluoreszenz zu überprüfen und subtrahieren als Hintergrund.</li>
		<li>"Normalisieren" Fluoreszenz ändern (ΔF) mit der Gleichung: <img alt="Equation" height="11" src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" width="172" /> wo F max und F 0 beziehen sich auf maximale Erhöhung nach Stimulation und Grundlinie Fluoreszenz, beziehungsweise. Messen Sie Endozytose Preise als die Rate des Zerfalls während der ersten 4-10 s nach dem maximalen Punkt der pHluorin Fluoreszenz. Erhalten die Zeitkonstante (τ) der Endozytose durch den Einbau des pHluorin Fluoreszenz Zerfalls aus der Erhöhung der Gipfel an der Grundlinie mit einem Mono-Exponentialfunktion.</li>
	</ol></li></ol> 2. Elektronenmikroskopie <ol><li>bereiten ein Poly-D-Lysin beschichtet 6-Well-Platte durch Anwendung von 1,5 mL 0,01 % steril filtriert Poly-D-Lysin-Lösung in jede Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur, dann dreimal mit sterilisierten Wasser waschen. Sezieren, Kultur und hippocampale Neuronen wie in den Schritten 1.1.1, 1.1.2 und 1.1.3, bzw. zu erhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie eine hohe K +-Stimulation-Lösung mit HRP als 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 und 5 mg/mL HRP, dann passen Sie auf pH 7.4 mit 5 M NaOH.
	<ol><li>Stimulieren die hippocampal Neuronen-Kultur mit 1,5 mL hohe K + Stimulation Lösung bei Raumtemperatur (bezeichnet als K +) durch Zugabe von 1,5 mL in jede Vertiefung für 90 s. Im ruhenden Zustand (R genannt), gelten die gleiche Konzentration von 5 mg/mL HRP für 90 s, aber mit normalen Kochsalzlösung. Für die Wiederherstellung Probe gelten hohe K + Stimulation Lösung wie bei der K +-Probe, dann schnell waschen und mit normalen Kochsalzlösung ersetzen und inkubieren 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Fixierung und Färbung <ol><li>0,1 M Na Cacodylate Puffer mit 21,4 g/L Na Cacodylate bei pH 7.4 vorbereiten. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na Cacodylate Puffer für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Waschen dreimal mit 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min.</li>
		<li>Bereiten Diaminobenzidine (DAB) Lösung, bestehend aus 0,5 mg/mL des DAB mit 0,3 % H 2 O 2 in DdH 2 O und Filter mit einem 0,22 µm-Filter. Wenden Sie 1,5 mL DAB Lösung für 30 min bei 37 ° c zu waschen dreimal mit 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min. 
		Achtung: DAB ist eine giftige und Verdacht Karzinogen. Bitte benutzen Sie Handschuhe und Kittel. 
		Hinweis: Etikettierung mit DAB durch die Oxidation von H 2 O 2, tritt, wie von HRP katalysiert. Kleine Erhöhungen in den Komponenten ergeben ein erhöhtes Signal in der Probe. Erhöhung der Konzentration von HRP beschleunigt die Wirkung des Katalysators. Ausreichend hohe Konzentrationen von H 2 O 2 ermöglichen schwächenden Nebenreaktionen mit HRP, hemmen die Wirkung der Beschriftung 32. In dieser Arbeit wurden die Konzentrationen von dieser Kennzeichnung System basierend auf derzeit verfügbaren Forschung 33 , 34 ausgewählt.</li>
		<li>Brüten die Neuronen mit 1,5 mL 1 % OsO 4 in 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 1 h bei 4 ° C als Fixierung post. Waschen dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min. 
		Achtung: Aufgrund der Toxizität und Reaktivität von OsO 4, der im Beispiel auf Eis in einem chemischen Haube zu halten empfiehlt sich in vielen Fällen mit einem Kühlschrank für die Inkubation.</li>
		<li>Vorbereiten 0,1 M Natrium-Acetat-Puffer mit 13,61 g/L Natrium Acetat und 11,43 mL/L Eisessig bei pH 5,0. Drei Mal mit 1,5 mL 0,1 M Acetat-Puffer bei pH 5,0 für 7 min waschen und inkubieren Sie mit 1,5 mL 1 % Uranyl Acetat in 0,1 M Acetat-Puffer bei pH 5,0 für 1 h bei 4 ° C. Wash dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Acetat-Puffer für 7 min.</li>
	</ol></li> <li>Epoxidharz einbetten <ol><li>entwässern die Neuron-Kultur mit einzelnen 1,5 mL Waschungen von 50 %, 70 % und 90 % Ethanol, für 7 min in jedem und dann 3 wäscht von 1,5 mL 100 % Ethanol für 7 min in einer Dampfhaube.</li>
		<li>Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) Epoxydharz, 160 mL/L Dodecenyl Bernsteinsäure Anhydrid (DDSA), 340 mL/L Methyl-5-Norbornen-2,3-Dicarboxylic-Anhydrid (NMA) und 15 mL/L 2,4,6-Tris (Dimethylaminomethyl) Phenol (DMP-30) erstelle ich das Epoxidharz Harz. Mischung gründlich, dann speichern unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. 
		Hinweis: Es ist wichtig, im Harz, insbesondere kleiner als mit dem bloßen Auge sichtbaren Luftblasen zu entfernen, da sie Hohlräume im Harz während schneiden verursachen können.</li>
		<li>Infiltrat die Probe durch das Ersetzen des Ethanols mit 50 % Epoxy Harz in Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker, dann 70 % Epoxid-Harz in Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.</li>
		<li>Schalter das Epoxid Harz Lösung mit 100 % Epoxidharz und inkubieren Sie für 10 min bei 50 ° c führen zwei Börsen frische 100 % Epoxidharz mit Inkubationen für 1 h bei 50 ° c hinzufügen frischen 100 % Epoxy Harz und lassen Sie Sie bei 50 ° C über Nacht und dann bei 60 & #17 verhärten 6; C für mehr als 36 h aushärten.</li>
	</ol></li> <li>Entfernen Sie jede Probe aus der Muti-Well-Platte mit einem Juwelier &#39; s Handsäge. Wählen Sie Regionen von Interesse, hohe Konzentration an Zellen, mit Hilfe einer invertierten Lichtmikroskop und schneiden dann 70 bis 80 nm Blöcke für durch Mikrotom schneiden. Montieren Sie die geschnittenen Region im Mikrotom Futter und laden Sie das Mikrotom. Positionieren Sie das Futter im Mikrotom und montieren ein Diamant Messer mit der Kante parallel zur Oberfläche des Blocks. Abschnitte von 70 bis 80 nm dicke direkt auf einzelne Netze sammeln.</li>
	<li>Lösen sich Uranyl Acetat in Wasser für eine 1 % ige Lösung von Gewicht und separat lösen Blei Citrat in Wasser für eine 3 % ige Lösung von Gewicht. Counterstain in den Abschnitten durch Überflutung mit 1 % wässrige Uranyl Acetat für 15 min und dann 3 % wässrige Blei Citrat für 5 min um den Kontrast der Proben zu verbessern.</li>
	<li>EM Bildgebung <ol><li>untersuchen die Abschnitte mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop und Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Digitalkamera bei einer primären Vergrößerung von 10.000-20, 000 X 3.</li>
	</ol></li> <li>Statistik <ol><li>führen einen t-Test auf signifikante Unterschiede identifizieren durch den Vergleich der Mittelwert und Standardfehler der Messung (SEM) zwischen Steuerung und experimentellen Proben.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+recycling+of+synaptic+vesicle+membrane+during+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+transmitter+and+synaptic+vesicles+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).</li><li>Watanabe, S., Rost, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li><li>Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+has+a+molecular+scaffolding,+not+propulsive,+role+in+presynaptic+function.">Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pathways+of+synaptic+vesicle+retrieval+revealed+by+single-vesicle+imaging.">Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging.</a> Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., Garc&#237;a-C&#225;novas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+peroxidase+by+hydrogen+peroxide+and+its+protection+by+a+reductant+agent.">Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent.</a> Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).</li><li>De&#225;k, F., Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptobrevin+is+essential+for+fast+synaptic-vesicle+endocytosis.">Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+presynaptic+function.">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li><li>Wienisch, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+proteins+exocytosed+and+subsequently+retrieved+by+compensatory+endocytosis+are+nonidentical.">Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical.</a> Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling.">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li><li>Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+spread+and+confinement+of+newly+exocytosed+synaptic+vesicle+proteins.">Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins.</a> Nat Commun. 6, 8392 (2015).</li><li>Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity-dependent+bulk+endocytosis+with+the+genetically-encoded+reporter+VAMP4-pHluorin.">Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin.</a> J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).</li><li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin.">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li><li>Wisse, E., Braet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+Photodamage+in+Live-Cell+Microscopy.">Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>S&#248;ndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier zeigen wir Ihnen zwei Methoden zur Überwachung der synaptischen Vesikel Endozytose. Bei der ersten Methode überwacht wir pHluorin mit einem synaptischen Vesikel Protein in transfizierten Neuronen verschmolzen und anschließend elektrisch stimuliert. Zweitens haben wir EM Bildgebung der HRP-Aufnahme, wie von KCl induziert. Wir haben verschiedene Reize aus zwei Gründen. Zunächst hohe Kalium-Anwendung induziert Depolarisation aller Neuronen in der Kultur. Dies erleichtert EM Prüfung, angesichts der Tatsache, dass ...

Neurotransmitter im synaptischen Vesikeln gespeichert und durch Exozytose freigesetzt. Die synaptischen Vesikel Membran Protein sind dann durch Endozytose internalisiert und in die nächste Runde der Exozytose wiederverwendet. Endozytose von synaptischen Vesikel ist wichtig für die Aufrechterhaltung der synaptischen Vesikel Pools und entfernt überstehende Vesikel aus der Plasmamembran. Die pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein-pHluorin, die unter sauren Bedingungen abgeschreckt und dequenched im pH-neutralen, wurde zur Endozytose Zeitmessung Kurse in Zellen1,2,3live. Das pHluorin-Protein ist in der Regel der lumenal Seite der synaptischen Vesikel Proteine, wie Synaptophysin oder VAMP2/Synaptobrevin beigefügt. Im Ruhezustand wird pHluorin in 5,5 pH-Lumen der synaptischen Vesikel abgeschreckt. Fusion der Vesikel an die Plasmamembran macht das vesikuläre Lumen, die extrazelluläre Lösung, wenn der pH-Wert ~ 7.3 beträgt, was zu einem Anstieg in pHluorin Fluoreszenz. Nach Exozytose zerfällt die erhöhte Fluoreszenz durch Endozytose von synaptischen Vesikel Proteine gefolgt von Vesikel Re Versauerung innerhalb dieser wiederhergestellten Vesikel. Obwohl der Zerfall Endozytose und vesikuläre Re Versauerung reflektiert, spiegelt es meist Endozytose, weil Re Versauerung schneller als Endozytose in den meisten Bedingungen1,4. Die Zeitkonstante der Re Versauerung ist 3-4 s oder weniger5,6, die in der Regel als die 10 schneller s oder mehr erforderlich für Vesikel Endozytose4,5. Wenn Experimente erforderlich sind, um erneute Übersäuerung Endozytose unterscheiden, können Säure abschrecken Experimente mit 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES)-Lösung (25 mM) mit einem pH-Wert von 5,5 verwendet werden, um festzustellen, ob die synaptischen Vesikel Proteine abgerufen werden von der Plasmamembran über Endozytose1,3,4. So der pHluorin Fluoreszenz Intensität Anstieg spiegelt ein ausgewogenes Verhältnis von Exo und Endozytose, und die Abnahme nach Nervenstimulation speziell spiegelt Endozytose.
pHluorin Bildgebung verwendet werden, nicht nur um den zeitlichen Verlauf der Endozytose, sondern auch die Größe der synaptischen Vesikel Becken7,8zu messen, und die Wahrscheinlichkeit der evozierten Freisetzung und spontan release9. Viele Faktoren und Proteinen, die bei der Regulierung der Endozytose, wie Kalzium, lösliche NSF-Anlage Protein (SNARE) Rezeptorproteine, Brain-derived neurotrophen factor(BDNF) und Calcineurin wurden mit pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Darüber hinaus Freisetzung von Neurotransmitter nachgewiesen werden konnte, nicht nur primäre Neuronen sondern Neuroblastom-Zellen mit TIRFM17. Vor kurzem wurden pHluorin Varianten, DsRed, mOrange und pHTomato entwickelt, für die Überwachung der gleichzeitige Aufnahmen von mehreren Faktoren in eine einzige Synapse18,19. Beispielsweise wurde pHTomato mit Synaptophysin verschmolzen und mit einem genetisch codierte Kalzium-Anzeige (GCaMP5K) zum Überwachen von präsynaptischen Vesikel Fusion und Ca2 + Zustrom in die postsynaptischen Fach20verwendet. Daher bietet pHluorin angeschlossen an synaptischen Proteine eine nützliche Methode zur Analyse der Beziehung zwischen Endozytose und Exozytose.
EM ist eine andere Methode, die häufig verwendet, um die Endozytose, aufgrund der hohen räumlichen Auflösung zu studieren, die Ultrastrukturforschung Änderungen während der Endozytose zeigt. Zwei allgemeine Bereiche sind die Fähigkeit zu visualisieren, pathologische Veränderungen in Nervenzellen21 und Vesikel Proteine22zu verfolgen. Insbesondere die Beobachtung der synaptischen Vesikel-Aufnahme, Krümmung der Membran beschichtet durch Clathrin in der Periactive Zone und Endosomal Strukturen sind möglich mit EM3,23,24,25 ,26,27,28. Während EM mögliche Artefakte wie Fixiermittel-induzierte Fehlbildungen umfasst Endozytose beeinflussen können, und Datenanalyse ist sehr arbeitsintensiv, die Auflösung bietet eine attraktive Möglichkeit, Zellstruktur zu visualisieren. Fixativ Probleme und die Begrenzung in EM zeitlicher Auflösung können durch hohen Druck Einfrieren, bietet eine schnelle und nicht-chemischen Methode stabilisieren die filigranen Strukturen bei Endozytose27überwunden werden.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine LTX with Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td></tr><tr><td>neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504-044</td><td>Gradient for neuronal differentiation</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td>Gradient for neuronal culture</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td><td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td></tr><tr><td>Trypsin XI from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td></tr><tr><td>pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td>model 2100</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>Slotted bath with field stimulation</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>stimulus isolation unit</td><td>Warner Instruments</td><td>SIU102</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>lubricant</td><td>Dow corning</td><td>111</td><td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td></tr><tr><td>AP5</td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Metal halide light source for pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon3</td><td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td></tr><tr><td>Inverted microscopy</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Software for imaging acquisition and analysis</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Software for imaging analysis and data presentation</td></tr><tr><td>imaging chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC21B</td><td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td></tr><tr><td>poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase(HRP)</td><td>Sigma</td><td>P6782</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td></tr><tr><td>Na cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine(DAB)</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16365</td><td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td></tr><tr><td>CCD digital camera</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>Electron microscopy, capturing images</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Leica microsystems</td><td>16707235</td><td>Electron microscopy, grid staining</td></tr></tbody></table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

Während der Endozytose sind verschmolzen synaptischen Vesikel Nervenausgänge, zulassend Vesicle recycling und damit die Aufrechterhaltung der synaptischen Übertragung während des Brennens von sich wiederholenden Nerv abrufbar. Beeinträchtigt Endozytose in pathologischen Zuständen führt zu einer Abnahme in der synaptischen Stärke und Gehirn-Funktionen. Hier beschreiben wir Methoden zur Messung der synaptischen Vesikel Endozytose an Säugetieren hippocampal Synapse in neuronalen Kultur. Wir überwachen synaptischen Vesikel Protein Endozytose durch die Verschmelzung einer synaptischen vesikuläre Membranprotein, einschließlich Synaptophysin und VAMP2/Synaptobrevin, mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein, das erhöht die vesikuläre lumenal Seite seiner Fluoreszenzintensität als der pH-Wert erhöht. Während Exozytose vesikuläre Lumen pH-Wert erhöht, während bei Endozytose vesikuläre Lumen pH wieder angesäuert ist. So zeigt eine Steigerung von pHluorin Fluoreszenzintensität Fusion, während eine Abnahme Endozytose des Proteins gekennzeichnet synaptischen Vesikel anzeigt. Neben der Verwendung der pHluorin-imaging-Methode Endozytose aufnehmen, überwacht wir vesikuläre Membran Endozytose durch Elektronenmikroskopie (EM) Messungen der Meerrettich Peroxidase (HRP) Aufnahme von Vesikeln. Schließlich überwacht wir die Bildung von Nerven terminal Membran Gruben zu verschiedenen Zeitpunkten nach hohen Kalium-induzierte Depolarisation. Der zeitlichen Verlauf des HRP-Aufnahme und Membran-Grube-Bildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Endozytose.

Mit der Lipid-Träger-Methode, SpH hippocampal Neuronen, äußerte ermöglicht die Identifizierung des Boutons (Abbildung 1a). Die elektrische Stimulation von Zellen induziert Exozytose und eine entsprechende Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die Zunahme der Fluoreszenz (ΔF) wurde durch die Beendigung des Stimulus (Abbildung 1 b) gestoppt. Die erhöhte Fluoreszenz folgte eine langsame Abnahme durch Endozytose. Bei VAMP2-pHluor...

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Aufrufe.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Serie: Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Neurowissenschaften

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons 

<a href='https://app.jove.com/v/55862/measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons'>Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the analysis of synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons through horseradish peroxidase labeling and electron microscopy.

Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the ...

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

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Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen