Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

우리 감사 박사 용 링 Zhu synaptophysin pHluorin2x 구조, 및 박사 제임스 E. 로스 VAMP2 phluorin를 제공 하기 위한 제공. 우리가 그들의 기술 지원 및 도움말에 대 한 박사 수잔 쳉과 버지니아 크 로커 NINDS 전자 현미경 시설의 감사합니다. 이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 미국 및 생명 공학 연구소 연구 이니셔티브 프로그램 (한국 생명 과학자 친목 프로그램), 한국 연구 학회에서에서 부여에 선 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생명 과학, 생명 공학, 한국

참고: 다음 프로토콜 pHluorin 이미징 방법 및 교양 hippocampal 신경. pHluorin 모니터 시 냅 스 소포 단백질 통풍 관에 살아있는 세포에 사용 되는 EM 방법에 설명 하 고 그들 시 냅 스 소포의 감지 및 ultrastructural 변경.
 동물 보호 및 절차 NIH 지침을 따라와 NIH 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
 1. pHluorin 이미징 <ol><li>Hippocampal 신경 문화 <ol><li>준비 해 마 버퍼 (HB) 4mm NaHCO 3 및 5 mM HEPES 결합 하 여 5 M NaOH로 pH 7.3에 조정. 보통 2 %B27, 0.5 m m L-글루타민 및 1% 페니실린 스 neurobasal를 혼합 하 여 문화 매체를 확인 합니다. 또한, HB 버퍼 20%의 혼합물 준비 소 태아 혈 청 (HB/20% FBS). 
		참고:이 자란 프로토콜 기반 Sankaranarayanan, 외. 29 고 우 외. 24</li> <li>출생 후 0 하루에 하루 2 문화 매체로 사이 마우스 강아지 목을 벨 및 4 ° C HB/20% FBS에 두뇌를 추출. 노출은 된 시상 및 brainstem를 제거 합니다. 후, 시상 및 brainstem의 제거에 의해 노출 된, 밖으로 해 부 고 신선한 4 ° c HB/20% FBS. 
		참고: 일반적으로, 비중은 약 4 x 10 1 강아지 (두 된) 5 셀/mL입니다. 핀셋 이나가 위를 사용 하 여 접착 막 떨어져 청소 그 후에 신선한 4 ° C HB/20% FBS 전송 가 이랑 풀가 위, 절단 하 여는 subiculum 분리 그리고 신선한 4 ° c HB/20% FBS 전송.</li>
		<li>끝에 약 10 조각으로 절단 하 여 각 해 마를 분할 하 고 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
		<li>허용한 후에 정착 조직, HB/20% FBS의 10 mL로 씻어 하 고 다음 세 번의 HB 10 mL로 씻어.</li>
		<li>137 mM NaCl, KCl 5mm, 7mm Na2HPO 4, 25mm HEPES의 소화 솔루션을 준비 하 고 5 M NaOH로 pH 7.2에 조정. 상쾌한 고 된에서 제거. 소화 솔루션의 2 개 mL를 trypsin의 10 mg와 DNase의 1 밀리 그램을 추가 하 고 샘플 펠 릿에 직접 살 균 0.22 μ m 멤브레인 통해 필터링.</li>
		<li>된 37 ° C에서 5 분 동안 품 어 다음 HB/20% FBS의 10 mL로 두 번 세척 하 고 다음 한 번 HB의 10 mL로 씻어.</li>
		<li>해리 MgSO 4의 6 mg와 셀 &#8729; 7 H 2 O 및 2 mL HB에는 된 살 균 필터를 1mg DNase의 메 마른 0.22 μ m 필터를 통해 작은. 부드럽게 주의 분쇄 하 여 세포를 분리, 돌보는 동안 공기 도입 방지 하기 거품. 2 분 동안 정착 조직 입자를 허용 하 고 다음 천천히 다른 튜브에는 상쾌한 전송.</li>
		<li>추가 3 mL HB/20% FBS 세포 현 탁 액, 그리고 원심 분리기 또는 4 ° C에서와 1000 rpm 10 분. 삭제는 상쾌한 고 문화 매체에서 resuspend.</li>
		<li>플레이트 60000 세포는 coverslip에서 유출 없이 폴 리-D-리 코팅 25 m m 직경 coverslip에 150 µ L 문화 매체에. 도금 후 미리 데워 진된 문화 매체 2 h의 2 개 mL를 추가 합니다. Coverslips 6-잘 자란 또는 멸 균 페 트리 디쉬에 유지 됩니다.</li>
		<li>5%에서 37 ° C에서 유지 세포 CO 2 14-21 일 녹화 전에 대 한 문화 매체에 인큐베이터 습도. 동안 문화 성장 매체의 상반신 일주일에 두 번 변경.</li>
	</ol></li> <li>Transfection <ol><li>도금, 후 6-7 일 synaptophysin-pHluorin 2 X transfect (SpH) 또는 hippocampal 신경으로 VAMP2-pHluorin. SpH, 세포 (CMV) 발기인, 30 pcDNA3 벡터 삽입을 사용 합니다. VAMP2-pHluorin를 사용 하 여 pCI 벡터 31에 삽입 CMV 발기인.</li>
		<li>1 µ g의 플라스 미드를 사용 하 여 대상 세포에 지질 여 두 벡터 transfect. 혈 청 부족, 프로토콜 단계 1.1.1에서 문화 매체를 사용 하 여 있는 transfection에 대 한. 독성을 줄이기 위해 transfection 후 매체 2 h 변경. 
		참고: 낮은 표현의 SpH는 boutons에서,의 경우 증가 지질 캐리어와 2 µ g 또는 보육 시간 DNA 농도 세포 건강 하지 않는. 일반적으로, 4-10 셀 (0.006 0.008%)의 transfected 했다.</li>
	</ol></li> <li>가벼운 현미경 <ol><li>119 mM NaCl, 2mm CaCl 2, 2.5 m m KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), 포도 당 30 m m, 2 m m MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0.01 m m의 준비 정상적인 염 분 솔루션 구성 CNQX), 그리고 0.05 mM DL-2-아미노-5-phosphonovaleric 산 (AP5). 배양 접시와 장소에서 coverslip 필드 자극, 윤활제 및 실 란 트를 사용 하 여 누수를 피하기 위해 허용 하는 이미징 챔버를 가져가 라. 유리 접시에서 챔버는 coverslip의 전송 중 즉시 750 µ L 정상적인 염 분 솔루션을 추가 하 여 건조 시키는 피하십시오. 
		참고: CNQX와 AP5 재발 활동에 대 한 잠재력이 postsynaptic 활동을 차단 하 사용 되었다. 거꾸로 형광 현미경에는 챔버를 배치 하기 전에 청소 티슈를 사용 하 여 챔버 누설 하지 않는 것인지. 굴절 인덱스에 변화 귀착되는 일반 식 염 수와 침수 오일의 혼합 하 여 녹음 하는 동안 포커스 변경 하면 느린 새.</li>
		<li>금속 할로겐 램프와 자극 및 기록 <ol>60 X 거꾸로 widefield 현미경에 <li>이미지 (1.4 숫자 조리개) 기름 침수 렌즈. 480의 여기 피크에 대 한 설정 필터 pHluorin 시각화 nm, 490 nm 긴 패스 거울, 500-550 nm 방출 필터와 수동 플립 셔터. 이미지 마다 100 ms, 2 x 2 비 닝와 전자 멀티 충전 결합 장치 (EMCCD) 카메라를 사용 하 여 캡처. 
			참고: 여러 기능 고려해 야 이미지 캡처 간격을 포함 하 여 photobleaching을 피하기 위해 적절 한 상태를 달성 하 고 필터링 하 고 범주화는 장비에 의존. 공초점 이미지의 경우 레이저 전원 및 노출 시간을 photobleaching을 피하기 위해 고려해 야 합니다. 자극 없이 3 분 이상 녹화 후 설치 결정 했다 고 녹음 적어도 10 수행한 photobleaching를 확인 하는 자극 없이 s.</li>
			<li>각 실험에 분석의 용이성을 위해 boutons의 높은 밀도와 영역을 선택합니다. Bouton과 boutons 사이 연속 식에 원형 또는 타원형 식 패턴에 중점을 두고 그들의 녹색 형광 신호에 의해 transfected 세포를 식별.</li>
			<li>1를 사용 하 여 필드 자극에 의해 유발 endocytosis ms 펄스, 20 mA 활동 전위 (AP) 펄스 자극에서 공급 하 고 자극 격리 단위 내의 백 금 전극을 통해 전달. 자극의 및 셀 복구 하는 동안에 걸쳐 형광 활동 이미지. 
			참고: 죽은 세포의 경우 식 생활 boutons 보다 강한와 boutons 사이 누 덕 누 덕 패턴을 보였다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>이미지 분석 <ol><li>단일 bouton의 형광 강도 분석, 설정까지 한 지역의 관심 (ROI) 1.5 x 1.5 µ m 평방; bouton는 크기가 약 1.5 µ m. 사용 흔적 자극 photobleaching에 대 한 확인을 배경으로 빼기 전에 내.</li>
		<li>Normalize 형광 변화 (δ) 방정식: <img alt="Equation" height="11" src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" width="172" /> 어디 최대 F와 F 0 참조 최대한 증가 자극 후 그리고 초기 형광, 각각. 측정 endocytosis 요금 감퇴의 속도으로 첫 번째 동안 4-10 s pHluorin 형광의 최대 시점 이후. 모노 지 수 기능으로 기준선에 피크 증가에서 pHluorin 형광 붕괴를 피팅 하 여 endocytosis의 시간 상수 (τ)를 취득.</li>
	</ol></li></ol> 2. 전자 현미경 <ol><li>준비 폴 리 D Lysine을 실 온에서 1 h에 대 한 각 영역 0.01% 살 균 필터링 폴 리-D-리 솔루션의 1.5 mL를 적용 다음 소독된 물으로 세 번 세척 하 여 6 잘 플레이트 코팅. 해 부, 문화, 및 각각 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 단계에서 hippocampal 신경 유지.</li>
	<li>준비 HRP 31.5 m NaCl, 2mm CaCl 2, 90 m KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), 포도 당 30 m m, m m로 높은 K + 자극 솔루션 2 mM MgCl 2, 0.01 m CNQX m, 0.05 m m AP5, 및 5 mg/mL HRP, pH 7.4 5 m에 조정 NaOH.
	90 (라고도 K +) 각 음을 1.5 mL의 추가 의해 실 온에서 <ol><li>Stimulate 1.5 mL 높은 hippocampal 신경 문화권 K + 자극 솔루션 s. 휴식 상태 (R 라고도 함)에 적용 5 mg/mL HRP 90의 동일한 농도 s, 하지만 정상적인 염 분 해결책. 복구 샘플 K + 예제와 마찬가지로 높은 K + 자극 솔루션 적용 다음 빠르게 세척 및 정상적인 염 분 고 10 분에 대 한 품 어</li>
	</ol></li> <li>고정 및 얼룩 <ol><li>pH 7.4에서 21.4 g/L Na cacodylate를 사용 하 여 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼를 준비. 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼 실내 온도에 적어도 1 시간에에서 4%도 함께 셀을 수정 합니다. 3 시간 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼와 세척.</li>
		<li>준비 Diaminobenzidine (한 덩어리) 솔루션, 0.5 mg/mL의 구성 0.3% H 2 O 2 ddH 2 O, 및 0.22 μ m 필터와 필터를 줘 봐. 3 시간 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼와 37 ° C. 세척에서 30 분 동안 1.5 mL DAB 솔루션 적용. 
		주의: 소량 의심과 독성 발암 물질 이다. 장갑 및 실험실 외 투를 사용 하시기 바랍니다. 
		참고: DAB로 의해 발생 합니다 그것의 산화로 인해 H 2 O 2, HRP에 의해 촉매로. 샘플에서 증가 신호 구성 결과의 작은 증가 합니다. HRP의 농도 증가 속도 촉매의 효과. H 2 O 2의 큰 농도 허용 측 반응, HRP와 쇠 약 32 라벨의 효과 억제 합니다. 이 작품에서는,이 라벨 시스템의 농도 현재 사용할 수 있는 연구 33 , 34에 따라 선정 됐다.</li>
		<li>1.5 mL의 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼 고정 게시물 4 ° C에서 1 시간에에서 1% OsO 4와 뉴런을 품 어. 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼의 1.5 mL로 세 번 세척. 
		주의: 독성 및 OsO 4의 반응성 화학 후드에 얼음 샘플을 유지 보다는 많은 경우에는 보육에 대 한 냉장고를 사용 하 여.</li>
		<li>준비 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 13.61 g/L 나트륨 아세테이트와 11.43 mL/L 빙 초 산 pH 5.0에서 함께. 1.5 mL 0.1 M 아세테이트 버퍼 pH 7 분 5.0로 세 번 세척 및 pH 5.0 4에서 1 h에서 0.1 M 아세테이트 버퍼에 1.5 mL 1 %uranyl 아세테이트와 품 어 ° C. 씻어 3 시간 7 분 1.5 mL 0.1 M 아세테이트 버퍼.</li>
	</ol></li> <li>에폭시 포함 <ol><li>각 7 분 50%, 70% 및 90% 에탄올의 단일 1.5 mL 세척으로 신경 문화 탈수 하 고 다음 3 1.5 mL 100% 에탄올 증기 두건에서 각각 7 분의 세척.</li>
		<li>믹스 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) 만들 에폭시 에폭시 수 지, 160 mL/L dodecenyl 호박 무수 물 (DDSA), 우리 모두의 340 mL/L 메 틸-5-Norbornene-2, 3-Dicarboxylic 무수 물 (NMA), 그리고 15 mL/L 2,4,6-트리 스 (dimethylaminomethyl) 페 놀 (DMP-30) 수 지입니다. 믹스 철저 하 게, 공기 방울을 제거 하는 진공에서 다음 저장. 
		참고: 그것은 특히 그 보다는 육안에 보이는 작은 수 지에서 기포를 제거 하는 중요 한 그들은 단면 중 수 지에 구멍을 일으킬 수 있기 때문.</li>
		<li>70% 에폭시 수 지 통에 실 온에서 30 분 동안 에탄올에 다음 50% 에폭시와 에탄올을 대체 하 여 샘플 통에 실 온에서 30 분 동안 에탄올에 수 지 침투.</li>
		<li>스위치 에폭시 솔루션 100% 에폭시 수 지와 수 지와 1 h 50 ° C. 추가 신선한 100% 에폭시에 대 한 외피와 신선한 100% 에폭시 수 지의 50 ° C. 수행 2 교류에서 10 분 동안 품 어 수 지 고 50 ° C 하룻밤 사이에 그리고 60 & # 17에서 보안을 강화 하 6; 보안을 강화 하 여 36 h에 대 한 C.</li>
	</ol></li> <li>Muti-잘 접시에서 보석으로 각 샘플을 제거 &#39; s 톱. 관심, 셀, 거꾸로 가벼운 현미경을 사용 하 여 다음 잘라 톰에 의해 단면에 대 한 70 ~ 80 nm 블록의 조밀한 농도 영역을 선택 합니다. 로드는 톰을 톰 척에 컷된 영역을 탑재 합니다. 톰에 물림 쇠를 놓고 블록의 표면에 평행한 가장자리 다이아몬드 칼을 탑재 합니다. 직접 개별 격자에 70 ~ 80 nm 두께의 섹션을 수집.</li>
	<li>무게, 1%의 솔루션에 대 한 물으로 uranyl 아세테이트를 녹이 고 별도로 무게 3% 솔루션 물으로 리드 시트르산을 디졸브. 15 분 동안 1% 수성 uranyl 아세테이트와 다음 샘플의 명암을 개선 하기 위해 5 분 동안 3% 수성 리드 시트르산 침수에 의해 섹션 counterstain.</li>
	<li>EM 이미징 <ol><li>전송 전자 현미경으로 섹션 및 10000-20, 000 X 3의 기본 확대 CCD 디지털 카메라와 함께 이미지를 기록 검사.</li>
	</ol></li> <li>통계 <ol><li>t 수행-제어 및 실험 샘플 사이의 평균 및 측정 (s.e.m.)의 표준 오차를 비교 하 여 상당한 차이 식별 하기 위해 테스트.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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L., Puchkov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin/AP-2+mediate+synaptic+vesicle+reformation+from+endosome-like+vacuoles+but+are+not+essential+for+membrane+retrieval+at+central+synapses.">Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses.</a> Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).</li><li>Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamin+1-,+dynamin+3-+and+clathrin-independent+pathway+of+synaptic+vesicle+recycling+mediated+by+bulk+endocytosis.">A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis.</a> eLife. 2014 (3), e01621 (2014).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li><li>Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. 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A., Garc&#237;a-C&#225;novas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+peroxidase+by+hydrogen+peroxide+and+its+protection+by+a+reductant+agent.">Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent.</a> Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).</li><li>De&#225;k, F., Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptobrevin+is+essential+for+fast+synaptic-vesicle+endocytosis.">Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+presynaptic+function.">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li><li>Wienisch, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+proteins+exocytosed+and+subsequently+retrieved+by+compensatory+endocytosis+are+nonidentical.">Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical.</a> Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling.">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li><li>Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+spread+and+confinement+of+newly+exocytosed+synaptic+vesicle+proteins.">Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins.</a> Nat Commun. 6, 8392 (2015).</li><li>Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity-dependent+bulk+endocytosis+with+the+genetically-encoded+reporter+VAMP4-pHluorin.">Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin.</a> J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).</li><li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin.">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li><li>Wisse, E., Braet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+Photodamage+in+Live-Cell+Microscopy.">Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>S&#248;ndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 시 냅 스 소포 endocytosis를 모니터링 하기 위한 두 가지 방법을 보여 줍니다. 첫 번째 방법에서 우리 pHluorin transfected 신경에 시 냅 스 소포 단백질 융합 하 고 그 후 전기 자극을 모니터링. KCl에 의해 유도 된 둘째, 우리 EM 이미징 HRP 통풍 관의 사용. 우리는 두 가지 이유로 다른 자극을 사용. 첫째, 높은 칼륨 응용 문화에 모든 뉴런의 도발은 유도. 이 우리의 EM 방법론은 비 자극과 자극 뉴?...

신경 전달 물질 시 냅 스 소포에 저장 되며 exocytosis 발표. 시 냅 스 소포 막과 단백질은 endocytosis에 의해 내 면 그리고 exocytosis의 다음 라운드에서 다시. 시 냅 스 소포 endocytosis 시 냅 스 소포 풀을 유지 관리 하는 것이 중요 하다 고 플라즈마 막에서 튀어나온 소포를 제거 합니다. Endocytosis 시간 과정에 라이브 셀1,,23측정 하는 신랄 한 상황에서 침묵 중립 pH에 dequenched, pH에 민감한 녹색 형광 단백질 pHluorin 사용 되었습니다. PHluorin 단백질 시 냅 스 소포 단백질, synaptophysin 등 VAMP2/synaptobrevin의 lumenal 측에 일반적으로 붙어 있다. 휴식, pHluorin 시 냅 스 소포의 5.5 pH 루멘에 침묵 이다. 원형질 막에 소포 융해 노출 pH가 7.3 ~ extracellular 해결책에 기공을 루멘 pHluorin 형광에 있는 증가 결과로. Exocytosis, 뒤에 그 복구 된 소포 내 기 다시 산성화 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis 인해 증가 형광 자연 붕괴 후 감퇴 반영 endocytosis 기공을 다시 산성화, 비록 그것은 대부분 반영 한다 endocytosis, 다시 산성화 endocytosis 대부분 조건1,4보다 빠릅니다 때문에. 다시 산성화의 시간 상수는 3-4 s 또는 더 적은5,6일반적으로 10 보다 더는 s 이상의 소포 endocytosis4,5에 필요한. 실험 다시 산성화 endocytosis를 구별 하기 위하여 필요한 경우 4-Morpholineethanesulfonic 산 (MES) 솔루션 (25 mM)를 사용 하 여 ph 5.5의 산 성 냉각 실험 시 냅 스 소포 단백질 검색할지 여부를 결정 하 사용할 수 있습니다. endocytosis1,,34를 통해 원형질 막. 따라서, pHluorin 형광 강도 증가 및 endocytosis, 균형을 반영 하 고 신경 자극 후 감소는 endocytosis에 구체적으로 반영 한다.
pHluorin 이미징 뿐만 아니라 endocytosis, 시간 과정 뿐만 아니라 시 냅 스 소포 풀7,8의 크기를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 갖는 릴리스 자발적인 가능성이 릴리스9. 많은 요인과 단백질 endocytosis, 칼슘, 수용 성 NSF 부착 단백질 수용 체 (올 무) 단백질, 두뇌 파생 된 neurotrophic factor(BDNF) calcineurin 등 규제에 관련 된 확인 된 pHluorin 이미징1 를 사용 하 여 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.만 주 신경에서 하지만 TIRFM17신경 세포에서 신경 전달 물질의 릴리스를 검출 될 수 또한. 최근, pHTomato, mOrange, dsRed, pHluorin 변종 단일 시 냅 스18,19에서 여러 요인의 동시 녹음을 모니터링 하기 위한 개발 되었다. 예를 들어 pHTomato 되어 synaptophysin 융합과 연 접 소포 융해와 Ca2 + 유입 postsynaptic 구획20에서 유전자 인코딩된 칼슘 표시기 (GCaMP5K)와 함께 사용. 따라서, pHluorin 시 냅 스 단백질에 부착 된 endocytosis 및 exocytosis 사이의 관계를 분석 하는 유용한 방법을 제공 합니다.
그들은 일반적으로 endocytosis endocytosis 동안 ultrastructural 변화를 보여주는 높은 공간 해상도 인해 공부 하는 데 사용 하는 또 다른 방법은. 2 개의 일반적인 신경 세포21 내 병 적인 변화를 시각화 하 고 소포 단백질22를 추적 하는 기능입니다. 특히, 시 냅 스 소포 통풍 관, 막 곡률의 관찰 periactive 영역에서 clathrin으로 코팅 하 고 endosomal 구조는 그들3,,2324,25 가능 ,26,,2728. EM 정착 액 유도 기형 등의 잠재적인 아티팩트를 포함 하는 동안 endocytosis, 영향을 줄 수 있는 그리고 데이터 분석은 노동 집약, 세포의 구조를 시각화 하는 매력적인 기회를 제공 하는 해상도. 통 문제 및 EM 시간적 해상도 제한 동결, endocytosis27중 섬세 한 구조를 안정화의 빠르고 비 화학 제품 방법을 제공 하는 높은 압력에 의해 극복할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine LTX with Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td></tr><tr><td>neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504-044</td><td>Gradient for neuronal differentiation</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td>Gradient for neuronal culture</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td><td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td></tr><tr><td>Trypsin XI from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td></tr><tr><td>pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td>model 2100</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>Slotted bath with field stimulation</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>stimulus isolation unit</td><td>Warner Instruments</td><td>SIU102</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>lubricant</td><td>Dow corning</td><td>111</td><td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td></tr><tr><td>AP5</td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Metal halide light source for pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon3</td><td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td></tr><tr><td>Inverted microscopy</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Software for imaging acquisition and analysis</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Software for imaging analysis and data presentation</td></tr><tr><td>imaging chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC21B</td><td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td></tr><tr><td>poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase(HRP)</td><td>Sigma</td><td>P6782</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td></tr><tr><td>Na cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine(DAB)</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16365</td><td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td></tr><tr><td>CCD digital camera</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>Electron microscopy, capturing images</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Leica microsystems</td><td>16707235</td><td>Electron microscopy, grid staining</td></tr></tbody></table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

Endocytosis, 동안 융합된 시 냅 스 소포는 신경 단자, 소포 재활용 및 따라서 반복적인 신경 발생 중 시 냅 시스 전송의 유지 보수에 대 한 허용에서 검색 됩니다. 병 적인 조건에서 장애인된 endocytosis 시 냅 스 강도 및 뇌 기능 감소에 지도 한다. 여기, 우리 포유류 hippocampal 신경 문화에서 시 냅 스에서 시 냅 스 소포 endocytosis를 측정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 등 synaptophysin VAMP2/synaptobrevin, pHluorin, 증가 하는 pH에 민감한 녹색 형광 성 단백질으로 기공을 lumenal 측면에서 시 냅 스 기공을 막 단백질을 융합 하 여 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 모니터링의 형광 강도 pH로 증가합니다. Exocytosis, 동안 기공을 루멘 pH 증가, endocytosis 기공을 루멘 동안 pH는 다시 acidified. 따라서, pHluorin 형광 강도의 증가 나타냅니다 퓨전, 반면 감소의 이라는 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 나타냅니다. 기록 endocytosis를 pHluorin 이미징 메서드를 사용 하 여, 우리 소포에 의해 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 통풍 관의 전자 현미경 (EM) 측정 하 여 기공을 막 endocytosis 모니터링. 마지막으로, 우리는 높은 칼륨 유도 도발은 후 다양 한 시간에 신경 터미널 막 구 덩이의 형성을 모니터링합니다. HRP 통풍 관 및 막 구 덩이 형성의 시간 과정 endocytosis의 시간 과정을 나타냅니다.

지질 캐리어 메서드를 사용 하 여, SpH 표현 hippocampal 신경에 있는 boutons (그림 1a)의 식별에 대 한 허용. 셀의 전기 자극 형광 강도 exocytosis, 그리고 증가 유도 한다. 형광 (δ)의 증가 자극 (그림 1b)를 종료 하 여 중단 됐다. 증가 형광 endocytosis 인해 느린 감소에 선행 되었다. VAMP2-pHluorin, 경우 VAMP2 자극4후는 bouton에?...

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K 조회수.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. 시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

비디오: Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

신경과학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons 

<a href='https://app.jove.com/v/55862/measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons'>Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the analysis of synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons through horseradish peroxidase labeling and electron microscopy.

Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the ...