Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dalla scienza e la tecnologia Commissione di Shanghai (Grant No. 14411961800) e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No. 81300805).

1. rilevamento di SUMOilazione Rb endogeno alla fase G1 precoce <ol><li>Cell sincronizzazione del ciclo cellulare e di cultura.
	<ol><li>Cellule HEK293 mantenere nel terreno di coltura contenente Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) completate con 1% penna-Strep e 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore.</li>
		<li>Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase G0.
		<ol><li>Conteggio le cellule HEK293 utilizzando un emocitometro e seme ~1.5 x 10 7 cellule in un 15cm piatto con 25 ml di terreno di crescita per 24 h prima del trattamento. Dopo aver raggiunto una confluenza di 70-80%, aspirato il mezzo e lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato salino (PBS) preriscaldata.</li>
			<li>Aggiungere 25 mL DMEM contenente 1% penicillina-streptomicina e incubare le cellule a 37 ° C per 72 h. lavare le cellule fuori la piastra con 3 mL di PBS ghiacciata. Trasferire le cellule in una nuova provetta da 5 mL.</li>
			<li>Soggetto una piccola porzione delle cellule per analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria (punto 1.2); raccolta la maggior parte restante delle cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente e quindi memorizzarli in un congelatore di ultra-bassa temperatura fino all'analisi di Rb sumoilazione.</li>
		</ol></li> <li>Ottenere G1-fase cellule, alla fine del processo di sincronizzazione di G0, rimuovere il DMEM e aggiungere mezzo di sviluppo torna fresco, così permettendo che le cellule HEK293 immettere nuovamente il ciclo cellulare. Quindi, raccogliere le cellule nelle diverse fasi G1 (G1 precoce: 30 min; G1: 2h) per ciclo cellulare analisi e SUMO ulteriore saggio.</li>
		<li>Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase di S, utilizzando il metodo di blocco doppio-timidina.
		Cellule <ol><li>cellule HEK293 crescere a una confluenza di 50% e lavaggio con PBS preriscaldata. Quindi aggiungere il medium di crescita completate con timidina 2,5 mM per 18 h (primo blocco).</li>
			<li>Rimuovere il mezzo contenente timidina e poi lavare le cellule due volte con PBS preriscaldata. Aggiungere il terreno di coltura fresco per 14 h a rilasciare le cellule di.</li>
			<li>Eliminare il terreno con una pipetta e aggiungere mezzo di sviluppo completato con timidina 2,5 mM per un altro 18 h (secondo blocco) prima di condurre un'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.</li>
		</ol></li> <li>Sincronizzazione per la G2/M, piastra ~1.5 × 10 7 HEK293 cellule ad un piatto di 15cm con 25 mL di terreno di crescita per 24 h. Quindi aggiungere nocodazole al mezzo fino ad ottenuta una concentrazione finale di 400 ng/mL. Infine, incubare le cellule per 16 h prima di condurre l'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.</li>
	</ol></li> <li>Analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria.
	<ol><li>Risospendere il HEK293 sincronizzato in PBS e quindi correggere la sospensione cellulare utilizzando ghiacciata etanolo al 70% per 2 h a 4 ° C. si noti che per ridurre al minimo il clustering di cella, aggiungere goccia a goccia la sospensione cellulare per l'etanolo 100% ghiacciata per ottenere una concentrazione finale di etanolo al 70% mentre delicatamente nel Vortex.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g, poi accuratamente scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con PBS. Ripetere il passaggio della centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di PBS contenente 50 µ g/mL dell'acido nucleico macchia ioduro di propidio, 0,1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNasi alle cellule e mescolare bene. Incubare le cellule per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Conservare i campioni a 4 ° C fino all'analisi di citometria a flusso.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitazione della proteina endogena Rb.
	<ol><li>Preparare il HEK293 lisati cellulari.
		<ol><li>Lyse le cellule HEK293 sincronizzate sospendendo delicatamente ri-li, in 1 mL di tampone di lisi ghiacciata radio-immunoprecipitazione assay (RIPA) (tabella 1), che contiene appena aggiunto 20 mM N-Ethylmaleimide, un inibitore di isopeptidase che potrebbe bloccare le proteasi SUMO e stabilizzare SUMO coniugati.</li>
			<li>Ulteriormente omogeneizzare le cellule su ghiaccio lisata omogeneizzazione, sonicazione o semplicemente passando attraverso 10 volte attraverso un ago 21G attaccato su una siringa da 2 mL. Quindi, incubare le cellule in ghiaccio per 5 min. 
			Nota: L'anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS) nel buffer RIPA è fondamentale per la successiva determinazione del Rb-SUMO, come si poteva eliminare il segnale SUMO aspecifiche che è derivato dall'interazione tra la proteina Rb e altro non-covalente SUMO-specie non-Rb.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugare i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. trasferire i surnatanti in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL. 
		Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le proteine possono essere conservate a-80 ° C per almeno 6 mesi.</li>
		<li>Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione del surnatante sopra un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Per i surnatanti sopra, aggiungere 1 µ g di immunoglobulina non specifico del mouse G (IgG) della stessa specie e isotype come l'anticorpo monoclonale di Rb e 20 µ l di impasto un/G-Sepharose della proteina al 50%. Quindi, incubare per 1 h a 4 ° C con rotazione dolce.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C. attentamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL. A ciascuno dei campioni, aggiungere 5 µ l Rb anticorpo primario e 40 µ l di proteina 50% un/G-Sepharose della liquami. Quindi, incubare per una notte a 4 ° C con rotazione dolce.</li>
		<li>Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con cautela il surnatante pipettando. Si noti che al fine di evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.</li>
		<li>Lavare le perle quattro volte con 1 mL di tampone RIPA. Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione li a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e poi scartare i surnatanti.</li>
		<li>Dopo aver rimosso i surnatanti dal lavaggio finale, risospendere le perline in 30 µ l 1 x buffer di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) carico (tabella 1) e mescolare bene.
		<ol><li>Incubare le provette a 100 ° C in un calore bloccano per 10 min. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in provette da 1,5 mL micro-centrifuga.</li>
		</ol></li> <li>Analizza i campioni da 4-20% pendenza SDS-PAGE gel e Western blot oppure conservarli a-20 ° C per un uso successivo.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analisi di 6XHis-etichetta sumoilazione di Rb esogeno in cellule umane <ol><li>cultura e transfezione delle cellule.
	<ol><li>Seme ~ 6 × 10 6 HEK293 cellule in un 10 cm piatto e incubare per 24 h nel mezzo di crescita in condizioni di coltura delle cellule normali di acquisire 75% - 85% di cellule confluenti. Prima di transfezione, rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 6 mL di terreno preriscaldati riduttori del siero (Vedi Tabella materiali) e quindi posizionare i piatti nuovamente dentro l'incubatrice.</li>
		<li>Saggio di SUMOilazione costitutiva per il Rb, aggiungere 15 µ g di 6XHis-etichetta Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmidi Ubc9-C93S in mezzo di riduttore del siero 500 µ l in provette da 1,5 mL micro-centrifuga, rispettivamente.
		<ol><li>Per analizzare la coniugazione di SUMO di tipo selvaggio Rb e suo mutante di SUMOilazione-difettoso, mescolare 10 µ g di entrambi plasmide Rb-WT o Rb-K720R 6XHis-tag insieme con GFP-SUMO1 (10 µ g) in 500 µ l ridotto medio del siero in 1,5 mL micro-centrifuga tubi 13.</li>
		</ol></li> <li>Nel frattempo, in un tubo separato, mescolare 50 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) in 500 µ l ridotto medio del siero e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Completamente combinare i due tubi separati sopra descritti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti Aggiungi la transfezione complessi reagente/plasmide alle cellule e continuano a cultura per 8 h 5% CO 2 e 37 ° C.</li>
		<li>Sostituire medio riduttori del siero con il mezzo di crescita e incubare le cellule in condizioni di normale coltura per 48 ore dopo la trasfezione.</li>
	</ol></li> <li>Nichel affinità pull-down della proteina Rb 6XHis-taggati.
	<ol><li>Lisare le cellule HEK293 transfettate ed estrarre le proteine totali come descritto sezione 1.3.1.</li>
		<li>Centrifuga i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. accuratamente raccogliere i supernatanti e trasferirli tubi puliti. 
		Nota: La proteina può essere congelata a questo punto per più di 6 mesi a -80 ° C.</li>
		<li>Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione dei surnatanti descritto in precedenza per un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Wash 25 µ l di 50% di nichel nitrilotriacetico acidi perle di agarosio (Ni-NTA) con buffer di RIPA due volte in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga per ciascun campione. Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Add 1 M imidazolo per ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di 10 mM. Quindi, aggiungere ciascun campione nella provetta contenente il preparato perline di agarosio Ni-NTA.</li>
		<li>Incubare le perline e i lisati per 2 h a 4 ° C con una leggera rotazione. Ruotate le perline a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con attenzione i sovranatante pipettando. Per evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.</li>
		<li>Lavare le perline con 1 mL di tampone di lavaggio contenenti imidazolo 20mm (tabella 1). Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle di filatura a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e scartare i surnatanti.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 µ l di eluizione tampone imidazolo di contenente 250 mM (tabella 1) per ogni campione e flick per mescolare. Quindi, incubare per 20 min a 4 ° C per eluire le proteine.</li>
		<li>Mescolare ogni campione con tampone di caricamento 6 × SDS-PAGE (tabella 1). Quindi, incubare le provette a 100 ° C in un blocco di calore per 10 min.</li>
		<li>Centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferire i campioni per provette da 1,5 ml micro-centrifuga. I campioni possono essere analizzati mediante Western blot o conservati a-20 ° C per un uso successivo.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>caricare l'immunoprecipitazione o tirare giù i campioni ottenuti dai passaggi precedenti sul gradiente gel di SDS-PAGE 4-20%. Condurre l'elettroforesi a 120 V per 90 min separare le proteine.</li>
	<li>Trasferire le proteine dal gel ad una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro di electroblotting a 300 mA per 90 min a 4 ° C, utilizzando il metodo di trasferimento del serbatoio. Bloccare la membrana PVDF in mattoncino buffer contenente 5% di latte scremato (tabella 1) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con l'anticorpo primario in tampone di diluizione di anticorpo contenente 3% albumina di siero bovino (BSA) (tabella 1) durante la notte a 4 ° C. Per gli anticorpi primari, utilizzare una concentrazione di lavoro 0,5 µ g/ml (anticorpo anti-SUMO1), o una diluizione di 1: 2000 (anticorpi anti-Rb e anti-tubulina), o 1:5,000 (anti-GFP e la anti-sua anticorpo).</li>
	<li>Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 x soluzione fisiologica tamponata con buffer di Tween (TBST) (tabella 1). Incubare la membrana con specie specifici anticorpi secondari coniugati HRP perossidasi di rafano 1:5,000 diluito in tampone di blocco contenente 5% di latte scremato (tabella 1). Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 buffer di x TBST.</li>
	<li>Incubare la membrana con chemiluminescenza (ECL) soluzione di lavoro. Coprire la membrana con involucro di plastica ed esporlo alla pellicola di raggi x a seconda della forza segnale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+within+the+pRb+pathway:+is+there+a+code+of+conduct.">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li><li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function.">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li><li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo per rilevare e analizzare la sumolazione endogeno di Rb in cellule umane. Mentre questo metodo è specificamente incentrato sulla proteina Rb endogena senza qualsiasi alternanza di segnale correlate a SUMO globale, è un importante strumento per lo studio di modificazione di Rb-SUMO in circostanze fisiologiche completamente naturali.
Per raggiungere questo obiettivo, è importante tenere a mente che: 1) anche se SUMO comprende quattro isoforme (SUMO1-4, c...

L'accurato controllo della progressione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche si basa su una fitta rete di regolamentazione, che garantisce che determinati eventi si svolgono in un determinato ordine1,2. Uno dei giocatori chiave in questa rete è la proteina del retinoblastoma (Rb), il primo clonato tumore soppressore1,3. La proteina Rb è pensata per essere un regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare, soprattutto per il G0/G1 a transizione di fase S e tumore crescita4,5. Fallimento di funzione di Rb sia direttamente comporta la malignità intraoculare più comune nei bambini, retinoblastoma, o contribuisce allo sviluppo di molti altri tipi di cancro5. Rb è inoltre impegnato in molte vie cellulari tra cui la differenziazione delle cellule, di rimodellamento della cromatina e apoptosi mitocondrio-mediata3,6,7.
Modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione RB8,9. La fosforilazione è una tale modifica, e solitamente conduce all'inattivazione di Rb. In cellule quiescenti G0, Rb è attiva con un livello basso di fosforilazione. Come cellule progressi attraverso fase G0/G1, Rb è in sequenza iper-fosforilato da una serie di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) e cicline, ad esempio ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, che inattivano Rb ed eliminare la sua capacità di reprimere il ciclo cellulare correlate a gene espressione4,10. RB potrebbe essere modificata anche da piccole modificatore ubiquitina-correlate (SUMO)11,12,13.
SUMO è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente a una varietà di proteine bersaglio. È fondamentale per diversi processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, trascrizione, localizzazione cellulare della proteina e degrado, trasporto ed il DNA riparazione14,15,16, 17 , 18. via di Coniugazione il SUMO è costituito dall'enzima d'attivazione di SUMO E1 dimerica SAE1/UBA2, l'unico enzima di coniugazione E2 Ubc9, multiple E3 ligasi e proteasi specifiche SUMO. Generalmente, il nascente proteine SUMO devono essere elaborati proteoliticamente per generare la forma matura. Il SUMO maturo è attivato dall'eterodimero E1 e quindi trasferita all'enzima E2 Ubc9. Infine, la glicina del C-terminale di SUMO covalenza è coniugata con la lisina di destinazione di un substrato, e questo processo è solitamente nei paraggi E3 ligasi. La proteina SUMO può essere rimosso dal substrato modificato da proteasi specifiche. Uno studio precedente dagli autori di questa carta ha rivelato che la sumoilazione di Rb aumenta suo legame con CDK2, che conduce alla fosforilazione di iper alla fase G1 precoce, un processo che è necessario per il ciclo cellulare progressione13. Inoltre abbiamo dimostrato che la perdita di Rb SUMOylation provoca una proliferazione delle cellule in diminuzione. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la sumoilazione di Rb protegge la proteina Rb da proteasomal fatturato, aumentando così il livello di proteina Rb in cellule19. Di conseguenza, sumolazione svolge un ruolo importante nella funzione di Rb in vari processi cellulari. Per studiare ulteriormente la conseguenza funzionale e rilevanza fisiologica di SUMOilazione Rb, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare lo stato SUMO di Rb in cellule o tessuti di pazienti umani.
Sumoilazione è un processo reversibile, altamente dinamico. Così, è solitamente difficile da rilevare le proteine SUMO-modificate in condizioni completamente endogene. Questo articolo presenta un metodo per rilevare endogeno Rb sumoilazione. Inoltre, viene illustrato come rilevare esogeno Rb sumoilazione di selvaggio-tipo Rb e sua mutazione di SUMO-carenti11. In particolare, Jacobs et al ha descritto un metodo per aumentare la modifica di SUMO di un substrato dato specificamente di Ubc9 fusion-regia SUMOylation (UFDS)20. Basato su questo metodo, questo protocollo viene descritto come analizzare la sumoilazione forzata di Rb e le sue conseguenze funzionali. Dato che centinaia di substrati SUMO è stati descritti precedentemente e più substrati putativi di SUMO sono stati identificati da molte analisi proteomica-based, questo protocollo può essere applicato per analizzare la SUMO-modifica di queste proteine in cellule umane.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Le modificazioni post-traduzionali delle proteine sono fondamentali per la corretta regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. Tra queste modifiche, piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente ai residui di lisina di una varietà di proteine bersaglio per regolare i processi cellulari, come la trascrizione del gene, riparazione del DNA, proteine interazione e degrado, trasporto subcellulare e trasduzione del segnale. L'approccio più comune al rilevamento della proteina sumoilazione si basa sull'espressione e purificazione delle proteine ricombinanti con tag nei batteri, consentendo un in vitro reazione biochimica che è semplice e adatto per l'indirizzamento meccanicistico domande. Tuttavia, a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo, è più difficile rilevare e analizzare la proteina SUMOilazione nelle cellule, soprattutto quando si è in condizioni endogena. Uno studio recente dagli autori di questa carta ha rivelato che la proteina endogena retinoblastoma (Rb), un oncosoppressore che è essenziale per la regolazione negativa della progressione del ciclo cellulare, è specificamente SUMOilate alla fase G1 precoce. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione e l'analisi di SUMOilazione Rb in condizioni sia endogene che esogene in cellule umane. Questo protocollo è appropriato per l'indagine fenotipica e funzionale di SUMO-modificazione del Rb, come pure molte altre proteine SUMO-mirati, in cellule umane.

Per rilevare endogeno Rb sumoilazione durante la progressione del ciclo cellulare, questo studio sincronizzato prima cellule HEK293 in cinque diverse fasi del ciclo cellulare (G0, primi G1, G1, S e G2/M), come descritto nella sezione protocollo di questa carta. La qualità di sincronizzazione è stata confermata usando la macchia di acido nucleico con ioduro di propidio seguito dall'analisi di citometria a flusso (Figura 1). Successivamente, le cellule sono s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.

In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K Views.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.

Video: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Ricerca

Biologia

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...