Questo protocollo è un modo semplice per generare i profili di ubiquitina e modifiche post-trascizionali simili all'ubiquitina identificando e semiquantificando specifiche proteine identificate. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'uso di lentivirus per creare una linea di espressione cellulare stabile entro una settimana e l'uso di due tag per purificare specificamente le proteine. In effetti, questo tipo di modifiche post-tras traslizionali sono coinvolte nella maggior parte delle funzioni biologiche, e alterazioni di questo meccanismo si trovano nella maggior parte delle malattie.
Pertanto, l'identificazione di queste alterazioni può servire come prognostica e/o diagnosi e, naturalmente, come bersaglio molecolare. L'ubiquitina è una delle proteine più conservate nelle cellule eucariotiche e questo essenziale per la loro sopravvivenza. Pertanto, questo tipo di metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi modello eucariotico, dai mammiferi al lievito.
Tuttavia, il nostro sistema lentivirale è limitato allo studio delle cellule. Poiché l'intera procedura è piuttosto lunga con tempi di incubazione a volte lunghi, è possibile farlo in due giorni invece di uno. L'eluato delle perline di nichel può essere congelato a meno 20 e prima di aggiungere le perline bandiera.
Questo protocollo contiene molti passaggi tra i quali alcuni sono fondamentali per garantire il successo finale della purificazione, e quindi l'accurata istituzione del profilo di modifica post-traslazione. La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Mirna Swayden e Aurelie Dobric, due dottorandi del laboratorio. Per iniziare, aggiungere 0,5 volte 10 alla sesta delle cellule HEK 293T in una piastra a sei porri con due millilitri per pozzo di DMEM con 10%FBS per seminare e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità del 100%.
Il giorno dopo, si ottiene una confluenza dal 50 al 70%. Cotrasfezionare le cellule con un mix di un microgrammo di ubiquitina pCCL-6HF o pCCL-GFP, un microgrammo di PBS VG e un microgrammo di vettori delta helper utilizzando un reagente di trasfezione e un protocollo per la produzione di lentivirus. Dopo sei ore di trasfezione, cambiare il mezzo in uno nuovo corrispondente al mezzo delle cellule da trasdurre.
Sementire le cellule da trasdurre in una piastra a sei porri con i loro mezzi di coltura standard al fine di ottenere dal 10 al 20% di confluenza il giorno dopo. 24 ore dopo la trasfezione, recuperare il mezzo contenente particelle lentivirali e filtrare utilizzando filtri da 0,45 micron. Sostituire il mezzo delle cellule da trasdurre con il mezzo filtrato contenente lentivirus.
Incubare le cellule con lentivirus per 24-72 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, quindi cambiare il mezzo con uno fresco e standard. Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio fluorescente invertito per valutare l'efficienza della trasduzione. Se non viene rilevata fluorescenza, attendere altri due o tre giorni.
Se il controllo GFP è positivo con fluorescenza verde, far crescere tutte le cellule fino ad avere abbastanza per eseguire un controllo di espressione di 6-His-FLAG ubiquitin-like per immunofluorescenza, come mostrato qui, e western blot utilizzando anticorpi anti-FLAG. Dopo aver fatto crescere le cellule in piatti di 15 centimetri, lavare i piatti di coltura almeno una volta con soluzione salina tamponata da fosfati a temperatura ambiente. Per iniziare lalisi cellulare, aggiungere due millilitri di tampone uno in ogni piatto di 15 centimetri a temperatura ambiente.
Utilizzare un raschietto cellulare per recuperare tutti i lisati in tubi di centrifuga conica da 50 millilitri. Sonicare i liscimi tre volte per 30 secondi, separati da una pausa di un minuto. Centrifugare i lysati sonicati a 15.000 volte g per 15 minuti.
Trasferire il supernatante su un nuovo tubo attraverso un colino a celle da 40 micron. È molto importante filtrare i lire dopo la sonicazione e la centrifugazione. Non farlo può comportare la copurificazione di molte proteine non specifiche, aumentando così lo sfondo e riducendo fortemente le dimensioni del profilo PTM.
Trasferire una quantità uguale di proteine tra 50 e 100 milligrammi ai nuovi tubi Falcon. Aggiungere perline di NTA agli ioni di nichel in ogni tubo con la quantità di due microlitri di perline per un milligrammo di proteine. Posizionare i tubi su un rotatore per ruotare a 30 giri/min per 2 ore e mezza a temperatura ambiente.
Quindi pellettare le perline a 500 volte g per cinque minuti. Lavare le perline con un millilitro di tampone uno e trasferire i campioni in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Metti il tubo sul ghiaccio.
Lavare due volte con un millilitro di tampone ghiacciato due contenente imidazolo dieci millimolare. Per le proteine legate all'elute, aggiungere 600 microlitri di tampone due contenenti imidazolo 250 millimolare e ruotare per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver pellettato le perline mediante centrifugazione a 500 volte g per un minuto, trasferire il supernatante in un nuovo tubo pre-raffreddato da 1,5 millilitri e aggiungere 50 microlitri di perline coniugate anticorpali anti-FLAG M2.
Ruotare a 30 giri/min per 2 ore e mezza a quattro gradi Celsius. Quindi lavare due volte con 500 microlitri di tampone due, quindi due volte con 500 microlitri di tampone tre. Per l'eluizione finale, aggiungere 100 microlitri di tampone tre contenenti un peptide FLAG a 0,01 microgrammi per microlitro e ruotare a quattro gradi Celsius per 1 1/2 ore.
Dopo la centrifugazione a 500 volte g per un minuto, trasferire il supernatante su un nuovo tubo pre-raffreddato. Prendi 10 microlitri da caricare su SDS-PAGE ed esegui una colorazione argentata del gel per controllare la qualità di purificazione. Se la purificazione ha un bell'aspetto, analizzare il 90% lasciato da LC-MS.
Per eseguire la normalizzazione, utilizzare le formule per normalizzare i valori tra cellule trattate con farmaci e cellule non trattate per ubiquitina e GFP. Per rimuovere lo sfondo, sottrarre valori nel campione di controllo GFP dai valori nei campioni di ubiquitina, per ottenere valori specifici per ogni proteina identificata in entrambe le condizioni. Per ottenere la variazione dell'ubiquitinazione, ottenere un punteggio compreso tra meno 100 e più 100 per variazioni positive e negative delle PTT indotte da un farmaco.
La differenza tra i valori specifici dei campioni trattati e non trattati è divisa per la somma di tutti i valori, inclusi quelli nel controllo, e moltiplicata per 100. Variazioni inferiori a meno 50, che rappresentano la repressione del PTM, o superiori a 50, che rappresentano l'induzione di PTM, sono considerate significative. Utilizzare questa formula per ottenere un valore di confidenza compreso tra zero e 100%I valori superiori a 50 sono in genere considerati sicuri.
Per ottenere una distribuzione più bella dei valori di induzione e repressione e per considerare sia i parametri di variazione che di confidenza, utilizzare questa formula per moltiplicare i valori di varianza e confidenza. In questo studio, la trasduzione di cellule di mammifero in coltura è stata ottenuta per creare gfp e 6-istidina FLAG ubiquitina esprimere cellule. L'efficacia della trasduzione lentivirale è stata controllata per la prima volta osservando la fluorescenza della GFP delle cellule trasdutte dalla GFP.
L'espressione di FLAG-ubiquitina è stata fatta mediante colorazione immunofluorescenza utilizzando un anticorpo anti-FLAG, che mostra la percentuale di cellule trasdutte. Al fine di controllare il livello di espressione dell'esogenia FLAG-ubiquitina, i lisati delle cellule trasdotta sono stati analizzati da SDS-PAGE seguiti da macchia occidentale con anticorpo anti-FLAG. Dopo la purificazione delle proteine ubiquitinate, il 10% dell'eluizione finale è stato utilizzato per controllare la quantità e l'integrità del materiale purificato da SDS-PAGE e la colorazione in argento del gel.
La sottrazione del campione GFP di fondo ha identificato 364 proteine significativamente ubiquitinate con un punteggio superiore al 50%È stata eseguita un'analisi di arricchimento gene set di queste proteine ubiquitinate al fine di evidenziare i processi biologici in cui sono state coinvolte. Potenziali reti interagenti formate da alterazioni dell'ubiquitinazione indotte da gemcitabina. Ciò ha portato all'identificazione di reti funzionali interagenti fortemente influenzate dall'aumento o dalla diminuzione dell'ubiquitinazione delle proteine coinvolte.
È stato anche confermato che l'ubiquitinazione del PCNA è aumentata dopo il trattamento con gemcitabina. È molto importante evitare il trasferimento di alcune perline dopo entrambe le fasi di eluizione, poiché potrebbe comportare un aumento significativo dello sfondo. Questa procedura genererà specifiche modifiche post-traslazionali che, confrontando condizioni diverse, consentiranno l'identificazione di modifiche specifiche.
Il primo passo successivo sarà convalidare almeno le alterazioni di interesse basate su approcci biochimici. Abbiamo sviluppato questo metodo per esplorare le modifiche post-trasduzionali basate sull'ubiquitina al fine di identificare nuovi modi e meccanismi delle cellule tumorali pancreatiche. Da quando questo protocollo e altri sviluppati in tutto il mondo sono stati utilizzati con successo per decifrare diversi processi biologici.
I lentivirus devono essere utilizzati almeno in laboratorio BL-2. La guanidina è un forte agente denaturante e deve essere utilizzata con attenzione. Il sonicatore può anche essere dannoso per le orecchie e deve essere utilizzato seguendo le raccomandazioni.
