Le entità leganti sumo rendono possibile l'isolamento delle proteine sumoilate endogene in vivo. Questo è piuttosto impegnativo a causa della presenza di proteasi attiva specifica del SUMO e delle basse frazioni di proteine SUMOilate in vivo. L'isolamento del proteoma SUMOilato utilizzando entità leganti SUMO è vantaggioso in quanto rinvia un aumento dell'affinità complessiva per i substrati SUMO.
Ciò è dovuto al fatto che i SUBE sono comuni nelle proteine che comprendono ripetizioni tandem di SIM riconoscendo così specificamente le molecole di SUMO su proteine modificate. L'uso di entità legante SUMO per l'isolamento e la caratterizzazione del proteoma SUMOilato nel cancro al fegato è un metodo veloce e sensibile. Fornisce informazioni passate sul ruolo piuttosto sconosciuto della via DI SUMOylation nel cancro al fegato in un potenziale approccio terapeutico.
Le entità leganti SUMO possono essere utilizzate per isolare e caratterizzare il proteoma SUMOilato in altri tessuti oltre al fegato, sia da esemplari umani che da modelli animali, nonché in diversi modelli cellulari. Sebbene questa tecnica sia facile da eseguire, è necessario prestare attenzione quando si analizzano più campioni allo stesso tipo. cubo più fresco ai diversi passaggi coinvolti.
Pertanto, si consiglia un attento livellamento dei tubi prima di iniziare questo esperimento. La dimostrazione visiva dell'uso di entità leganti SUMO facilita la rivoluzione di questo protocollo soprattutto a causa delle difficoltà di movimentazione dei bit e della perdita di materiale durante il protocollo. Le cellule di epatoma umano sono state precedentemente preparate placcando le cellule in piastre P100 ad una densità da 1,2 a 1,5 milioni di cellule per piatto e mantenerle in mezzi di crescita standard a 37 gradi Celsius.
Quando è pronto per l'uso delle cellule, aspirare il supporto dalle piastre e lavarle con cinque millimetri di PBS sterile. Mettere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi integrati secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi utilizzare un raschietto per raschiare delicatamente le cellule dal fondo della piastra nel mezzo di lisi.
In alternativa, raccogliere le cellule mediante tripsicinazione e aggiungere un millilitro di tripside-EDTA alla piastra assicurandosi che le cellule siano coperte. Mettere il piatto in un incubatore celsius di 37 gradi per cinque minuti per consentire loro di staccarsi dalla piastra, quindi aggiungere due millilitri di mezzo di crescita preri riscaldato per fermare la tripsicinazione. Centrifugare le cellule a 150 volte G per 10 minuti e aspirare il supernatante.
Quindi lavare le cellule con PBS e centrifugare per altri 10 minuti. Aspirare il supernatante e aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi. Centrifugare le cellule di liscimma a 15000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire i supernatanti in un tubo fresco e scartare il pellet.
Quando è pronto per l'uso dei fegati di topo raccolti, omogeneizzare 75 milligrammi di frammenti congelati freschi o spezzati in un millilitro di tampone di lisi ghiacciata. Eseguire l'omogeneizzatore secondo le indicazioni del manoscritto. Dopo l'omogeneizzazione dei tessuti, centrifugare i campioni a 15000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Trasferire il supernatante in un tubo fresco e scartare il pellet. Preparare le perle di glutatione aggiungendo un millilitro di acqua deionizzata a 70 milligrammi di perline e ricostituendole durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo il gonfiore, lavare le perline tre volte con 10 millilitri di acqua deionizzata o PBS, centrifugando a 300 volte G per cinque minuti dopo ogni lavaggio.
Dopo i lavaggi, rimescolare le perline in un millilitro di PBS per ottenere un liquame del 50% per ciascun campione a 100 microgrammi di GST-SUBE o controllo GST a 100 microlitri del liquame di glutatione e 500 microlitri di PBS. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per almeno due ore durante la rotazione, quindi recuperare le perline mediante centrifugazione a 300 volte G per cinque minuti e riprendarle in PBS. Prendere il 10% del lysate cellulare precedentemente preparato e diluirlo in un volume uguale di tampone di ebollizione 3X.
Aggiungere 450 microlitri del lisato chiarificato a 100 microlitri del liquame di glutatione. Incubare il lisato con le perline a quattro gradi Celsius per almeno due ore mentre si ruota lentamente. Dopo l'incubazione, girare le perline a 300 volte G per cinque minuti e raccogliere il supernatante per l'analisi.
Trasferire il 10% del volume totale in un tubo separato e aggiungere un volume uguale di tampone di ebollizione 3X. Lavare il campione rimanente tre volte aggiungendo un millilitro di PBS ghiacciato con 05%Tween 20 e facendolo girare verso il basso a 300 volte G e quattro gradi Celsius per un minuto. Aspirare con cura il supernatante assicurandosi che non rimanga liquido.
Quindi elutare il campione con 15 microlitri di tampone di ebollizione 3X e 15 microlitri di tampone di lisi. Esegui un'analisi western delle macchie secondo le indicazioni del manoscritto. Se si esegue la spettrometria di massa, desalt i peptidi utilizzando microcolonne C18 a punta di stadio e riprenosi in acido formico dello 0,1% prima dell'analisi.
Caricare i campioni su un sistema LC-MS e analizzarli in triplice copia. Procedere con l'identificazione delle proteine e il calcolo dell'abbondanza utilizzando il software associato. Eseguire analisi statistiche in base alle indicazioni manoscritte.
Questo protocollo è stato utilizzato per isolare le proteine SUMOilate nei topi con carenza di glicina N-metiltransferasi che causa lo sviluppo spontaneo del cancro al fegato e dei loro compagni di cucciolata di tipo selvatico. La colorazione Ponceau Staining è stata eseguita sulle frazioni di input, flow-through e BOUND dal test pull-down SUBEs. L'analisi western della macchia di LKB1 catturata con IRE mostra che i livelli di SUMOilazione LKB1 sono aumentati nei tumori del fegato.
Le cellule epatoma umane e le cellule epiteliali epatiche non trasformate sono state utilizzate per studiare la capacità della trappola SUMO di interagire con proteine naturalmente sumoilate. In primo luogo, la colorazione convenzionale delle proteine è stata utilizzata per visualizzare il materiale totale catturato con i SUBE. Poi la spettrometria di massa ha mostrato che 742 proteine sono state arricchite nel campione di SOTTOE delle cellule di epatoma e 577 sono state arricchite nel campione di SOTTOE a cellule epiteliali epatiche non trasformate.
Quando si eseguono esperimenti con IME, è importante mantenere cellule e tessuti sul ghiaccio e aggiungere millilitri specifici al tampone di lysis al fine di mantenere la purezza del SUMOilato. Dopo la visualizzazione del proteoma SUMOylated con IME, possiamo trovare la caratterizzazione usando l'analisi western blot o la spettrometria di massa. L'applicazione delle SOTTOE per isolare e caratterizzare il proteoma SUMOilato nei tessuti del cancro al fegato e nelle cellule dell'epatoma sta spianando la strada all'esplorazione del ruolo delle modifiche post-traslazionali del SUMO nel cancro al fegato che possono fornire un potenziale meccanismo terapeutico.
