Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation CARRIERA Award (0953583) e l&#39;Istituto Nazionale di Salute NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

In questo protocollo, un oligonucleotide (RBMB1) è stato marcato a suo 5&#39;-end con un colorante reporter CF640R e ha la sequenza: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 &#39;. Domini di auto-complementari, che guidano la formazione della struttura tornante, sono in grassetto. Il secondo oligonucleotide (RBMB2) è stato marcato a 3&#39;-end con un quencher Iowa Nero RQ-Sp e ha la sequenza: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 &#39;. 1 Preparazione di RBMBs <ol><li> Eseguire una rotazione rapida delle provette contenenti le RBMB1 e RBMB2 oligonucleotidi, per garantire l&#39;oligonucleotide essiccato è al fondo della provetta e risospendere in DNasi e acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 100 mM. Ad esempio, un campione di 10 nmole di oligonucleotide deve essere risospeso in 100 ml di acqua. </li><li> Measure l&#39;esatta concentrazione di campioni RBMB1 e RBMB2 azionari mediante spettroscopia UV-vis. <ol><li> Mescolare 3 ml di campione RBMB con 117 microlitri DPBS (senza calcio e magnesio) in una provetta. </li><li> Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l&#39;assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile. </li><li> Calcolare la concentrazione archivio dei campioni RBMB basato su l&#39;assorbanza a 260 nm (o 650 nm per RBMB1), usando l&#39;equazione: Archivio Concentrazione (M) = A 260 * fattore di diluizione coefficiente / di estinzione dove A 260 è l&#39;assorbanza a 260 nm e il fattore di diluizione è 40. Nota: Il coefficiente di estinzione per la RBMB può essere trovato sul foglio delle specifiche fornite dal costruttore oligonucleotide. Il coefficiente di estinzione di CF640R a 650 nm è 103.000. </li></ol></li><li> Mescolare 20 ml di 100 mM RBMB1, 30 ml di 100 mM RBMB2, 6 ml 10x; Tampone fosfato (10x tampone fosfato: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mm KH 2 PO 4, 140 mm NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 microlitri DNasi e acqua RNase-free. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. Nota: Questo è in genere sufficiente per circa 50 studi. </li><li> Preparare una colonna cromatografia liquida con 75 prep grado Superdex di togliere qualunque oligonucleotidi RBMB2 non ibridizzate. Utilizzare un 8 ml (0,7 x 20 cm) colonna di cromatografia liquida con un volume ~ 4 ml letto per purificare il piccolo volume di sonde misti. </li><li> Lavare ed equilibrare il Superdex con ~ 50 ml di tampone fosfato 1x utilizzando una pompa a siringa in esecuzione in un flusso a una portata di 0,6 ml / min. Prima di tutto il liquido entra letto il volume, fermare la pompa a siringa, staccarlo, e lasciare che il liquido restante passare attraverso la colonna per gravità. </li><li> Caricare la miscela RBMB (60 microlitri) sulla colonna cromatografica. <ol><li> Dopo che il campione RBMB ha completamenteentrato nel letto, aggiungere lentamente altri 250 ml di tampone fosfato 1x all&#39;inizio del letto per assicurare che tutto il campione è completamente inserito sulla colonna. </li><li> Riempire la colonna al bordo con tampone fosfato 1x. Chiudere la parte superiore, e avviare la pompa a siringa - siringa deve essere riempito con ~ 50 ml di PBS 1x e correre ad una velocità di flusso di 0,6 ml / min. </li><li> Una volta che il RBMB avvicina al fondo della colonna - campione RBMB in genere può essere facilmente visualizzato per il colore del colorante incorporato nella sonda - raccogliere il deflusso a 2 gocce per provetta da microcentrifuga (1,5 ml). Smettere di raccolta del campione di una volta che il colore all&#39;interno dei tubi microcentrifuga diventa chiaro. </li></ol></li><li> Unire le provette contenenti il ​​campione RBMB colorata - tipicamente 5-6 tubi - e caricare in un dispositivo di filtro centrifugo (10.000 MW cutoff). Centrifugare il campione a 10.000 RCF per 20 minuti o fino a quando il volume desiderato. Nota: Queste velocità e tempi in genereprodurre un volume finale di ~ 30 microlitri. </li><li> Misurare la concentrazione esatta del campione RBMB purificato mediante spettroscopia UV-Vis. <ol><li> Prendere 3 ml di campione RBMB concentrata e mescolare con 117 microlitri DPBS in una provetta. </li><li> Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l&#39;assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile. </li><li> Calcolare la concentrazione magazzino del RBMB ibridato in base l&#39;assorbanza a 650 nm, usando l&#39;equazione: Archivio Concentrazione (M) = A 650 * fattore di diluizione / coefficiente di estinzione dove A 650 è l&#39;assorbanza a 650 nm, il fattore di diluizione è 40. Nota: Il coefficiente di estinzione per CF640R a 650nm è 103.000 e il coefficiente di estinzione per Iowa nero RQ è ~ 20.000. I coefficienti di estinzione sono additivi e non sono sensibili alla ibridazione. Pertanto, l&#39;esempio stock RBMB ha un coefficiente di estinzione combinata di ufficio intornoy 123.000 a 650 nm. </li></ol></li><li> Etichettare la provetta in modo appropriato con il nome e la concentrazione e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ol> 2 Preparazione di Poly-D-lisina rivestito 8-ben Chambered coprioggetti <ol><li> Preparare una soluzione di 0,2 mg / ml di poli-D-lisina sciogliendo 5 mg di poli-D-lisina (polvere liofilizzata, g irradiati) in 25 ml di acqua sterile in un ambiente sterile. </li><li> Aggiungere 200 microlitri della / ml di soluzione di poli-D-lisina 0,2 mg a ciascun pozzetto di una coprioggetti 8 pozzetti a camera, in un ambiente sterile. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 16-18 ore nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aspirare il poli-D-lisina e lavare la ben 3 volte con acqua distillata sterile. Nota: Le diapositive camera rivestiti possono essere conservati a 4 ° C. </li></ol> 3 Sonda di consegna Nota: Il sistema cellulare utilizzato deve contenere un costrutto gene integrato che esprime l&#39;RNA con almeno 4 sequenziale binding siti per il RBMB nella regione 3&#39;-non tradotta (UTR). Le sequenze bersaglio dovrebbero essere complementari al loop del RBMB. E &#39;consigliabile che come controllo negativo, la stessa linea cellulare è progettato per esprimere lo stesso costrutto genico, ma senza le ripetizioni in tandem. In questo protocollo, una linea cellulare di fibrosarcoma umano HT1080, è stato progettato per esprimere la GFP RNA con ripetizioni 96-tandem della sequenza bersaglio RBMB nel 3&#39;-UTR. La linea cellulare di controllo è stato progettato per esprimere la GFP wild-type RNA. <ol><li> Cellule piastra in un pallone T25 al 40-50% di confluenza un giorno prima della consegna della sonda. Coltivare le cellule con i media DMEM supplementato con 1% pen / strep e siero fetale bovino al 10% (FBS) e incubare a 37 ° C con il 5% di CO 2. </li><li> Il giorno seguente, accendere la microporator e impostare i parametri microporation a 950 V, 2 impulsi, 25 msec. Nota: Questi parametri sono stati ottimizzati per le cellule HT1080, ma sono cellule di tipo dipendente e possono essere adjusted per altri tipi di cellule, come descritto nelle istruzioni del produttore. </li><li> Riempire il tubo microporation con 4 ml di tampone elettrolitica e posizionarlo sulla stazione microporation. </li><li> Estrarre il campione magazzino di RBMB purificato e sbrinarlo. Diluire diversi microlitri di una concentrazione finale di 12 mM con 1x tampone fosfato. 1 ml è necessario per ogni microporation. </li><li> Pipettare 1 ml di terreno di coltura con FBS ma senza antibiotici in una provetta. Nota: Questo sarà utilizzato per sospendere le cellule immediatamente dopo microporation e può essere annullata, in prossimità del dispositivo microporation, per il momento. L&#39;inclusione degli antibiotici nella cultura dei media diminuirà la vitalità cellulare dopo microporation. </li><li> Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalle cellule HT1080 ingegnerizzate (60-80% confluenti), lavare le cellule con 1 ml di Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -Free una volta, e incubare con 1 ml di tripsina per 1-2 min. </li><li> Arrestare il trypsinization con l&#39;aggiunta di 1 ml di mezzi DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10%, senza antibiotici e rosso fenolo, e trasferire le cellule in due da 1,5 ml provette da microcentrifuga. </li><li> Centrifugare le cellule in provetta a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante, risospendere e combinare il pellet di cellule in un volume finale di 1 ml DPBS. </li><li> Prendere 10 ml della sospensione cellulare ben miscelato e contare le cellule. </li><li> Pipettare le cellule su e giù diverse volte per assicurarsi che siano ben distribuiti e trasferire 300.000 cellule con DPBS in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e spin giù a 200 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 11 microlitri tampone di risospensione e pipettare su e giù diverse volte per garantire che le cellule sono ben disperse. Essere sicuri di non generare eventuali bolle d&#39;aria. Nota: Le bolle d&#39;aria provocano una scintilla durante microporation e compromettere consegna RBMB e la morte cellulare. </li><li> Aggiungere 1 ml di RBMB diluito (12 mM) e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. Anche in questo caso fare attenzione a non generare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Aspirare 10 ml di miscela RBMB-cellule, utilizzando la pipetta microporation, e inserire la pipetta nella provetta microporation. Premere il pulsante di avvio per avviare il microporation. Nota: Non ci dovrebbero essere bolle d&#39;aria visibili nella punta. </li><li> Quando lo schermo del microporator mostra completamento, rimuovere la pipetta dalla stazione, espellere la miscela di 10 ml nella provetta che è stato preparato in precedenza, con 1 ml di terreno di coltura con FBS, ma senza antibiotici. Mescolare delicatamente oscillare il tubo da lato a lato diverse volte. </li><li> Spin le cellule a 200 xg per 5 min e lavare le cellule altre due volte, in 1 ml di rosso fenolo terreno di coltura gratuito con FBS, ma senza antibiotici, per rimuovere eventuali RBMBs che non sono stati consegnati nelle cellule. Risospendere con 400 microlitri fenolo terreno di coltura rosso gratuito con FBS, ma senzaantibiotici. </li><li> Piastra le cellule microporated nel poli-D-lisina rivestite coprioggetti 8-bene camerata a 200 ml per pozzetto o alla confluenza desiderata. </li><li> Opzionale: Se è auspicabile immagine nucleo, aggiungere Hoescht 33342 alle cellule ad una concentrazione finale di 0,01 mg / ml. </li><li> Posizionare i coprioggetti camerata in un incubatore di coltura cellulare. Incubare le cellule per 1-2 ore prima di imaging, in modo che le cellule hanno il tempo sufficiente per sistemarsi sulla superficie coprioggetti. Nota: Imaging può essere eseguita appena 30 minuti post-microporation. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Accendere il sistema all&#39;inizio dell&#39;incubazione vivo fase cellula ed equilibrare esso fino a raggiungere 37 ° C, 5% di CO 2, e 75% di umidità. </li><li> Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza e microscopio e aprire il software Metamorph. Nota: altri software simili per il controllo del microscopio e acquisizione delle immagini può anche essere usato. </li><li> Applicare olio Immersol alobiettivo. </li><li> Trasferire il coprioggetti camerata con le cellule microporated al sistema top di incubazione dal vivo palco cellulare. Incubare il sistema superiore palco fino a quando la temperatura e CO 2 livelli sono stabilizzati. </li><li> Aprire la scheda Acquisisci, nel software Metamorph. Fare clic sul pulsante Show Live per trovare il campo, regolare la messa a fuoco in luce bianca e fare clic sul pulsante Stop dal vivo. </li><li> Nella scheda Acquisisci, fare clic e aprire il pulsante di scelta rapida acquisizione ruscello, e impostare i parametri di acquisizione filmato desiderati. Acquisire 150 fotogrammi usando il filtro Cy5 / CF640R e salvare le immagini sul disco rigido. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke e il dottor Ling Huang sono impiegati da IDT che offre oligonucleotidi per la vendita simile ad alcuni dei composti descritti nel manoscritto. IDT è, tuttavia, non è una società quotata in borsa e che personalmente non possiede azioni / equity in IDT.

La capacità di immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi utilizzando un microscopio a grande campo convenzionale richiede un segnale luminoso e fotostabile fluorescente per essere associate a ogni trascrizione di RNA e di uno sfondo fluorescente a basso proveniente da sonde fluorescenti non legati. In questo metodo, un segnale fluorescente è ottenuto ibridando multipla (fino a 96) sonde fluorescenti basato oligonucleotidi, cioè RBMBs, su ciascun trascritto di RNA. Tuttavia, solo qu...

L&#39;espressione e la regolazione dei trascritti di RNA è un processo complesso e dinamico che è in gran parte responsabile del controllo del comportamento delle cellule e del destino. Anche se l&#39;importanza di RNA in funzione delle cellule dettare è noto da qualche tempo, è spesso difficile tracciare chiare connessioni tra le due, in quanto la maggior parte degli strumenti di analisi di RNA non hanno la risoluzione spaziale e temporale necessaria per acquisire importanti eventi normativi quali la trascrizione scoppio, RNA traffico, e l&#39;elaborazione di RNA localizzata. Questo ha portato l&#39;avvento di diverse tecniche che consentono singoli trascritti di RNA per essere visualizzati in cellule viventi in tempo reale 1. Forse, il più importante di queste tecniche utilizza una proteina di fusione GFP-MS2 di RNA che è stato progettato per contenere ripetizioni in tandem del sito di legame MS2 nel 3&#39;-UTR 2,3 bersaglio. Portando più molecole di GFP in stretta vicinanza, le singole trascritti di RNA appaiono macchie fluorescenti luminositramite microscopia a fluorescenza. Il sistema di GFP-MS2 ha fornito una visibilità senza precedenti sul comportamento RNA, inclusi visualizzazione diretta e misure di trascrizione scoppio 4,5, il rilevamento di localizzazione sub-cellulare unico e lavorazione 6-9, e in tempo reale l&#39;imaging del trasporto dell&#39;RNA 10. Tuttavia, nonostante l&#39;enorme potenziale del sistema GFP-MS2, proteine ​​di fusione GFP-MS2 non legate possono creare un segnale di alta sfondo fluorescente che limita la versatilità e la gamma dinamica di questa tecnica. Diversi approcci sono stati sviluppati per limitare questo segnale di fondo, tra cui compartimentazione subcellulare di non legato GFP-MS2 10, proteina frammento complementazione 11, e proteine ​​leganti RNA alternativi e obiettivi 12. Tuttavia, tutti questi approcci rimangono sensibili alla espressione relativa e totale del bersaglio RNA e proteina di fusione GFP-MS2. Come unlternative ai sistemi GFP-MS2, fari molecolari sono stati utilizzati anche per rilevare trascritti di RNA ingegnerizzati con ripetizioni in tandem del sito di legame complementare nel 3&#39;-UTR 13,14. Beacon molecolari sono sonde oligonucleotidiche-hairpin formando contrassegnate ad una estremità con un quencher e all&#39;altra estremità con un reporter fluorescente. Quando non è vincolata a bersaglio RNA reporter fluorescente e quencher rimanere nelle immediate vicinanze, con un conseguente stato di bassa fluorescente. Dopo l&#39;ibridazione, il reporter fluorescente e quencher sono costrette a parte e fluorescenza viene ripristinato. Simile al sistema GFP-MS2, il legame di molteplici fari molecolari su un singolo risultato di RNA trascritto in un punto luminoso fluorescente che può essere identificato mediante microscopia a fluorescenza; tuttavia, la fluorescenza di fondo dovrebbe essere molto inferiore, a causa della configurazione spento di fari molecolari legati. Sfortunatamente, nonostante il meccanismo di attivazione intelligente che è integrata mdisegno faro olecular, ora vi è una crescente evidenza che non ibridizzate fari molecolari non rimangono nella conformazione tornante quando introdotto in cellule viventi. Di conseguenza, generano un segnale falso-positivo che riduce significativamente il rapporto segnale-bassa. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo recentemente sviluppato una nuova sonda sintetica per l&#39;imaging RNA nelle cellule viventi, raziometriche fari bimolecolari (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs sono composti da due filamenti di oligonucleotidi 2&#39;-O-metil che formano una struttura ibrida con le caratteristiche di entrambe breve hairpin RNA (shRNA) e fari molecolari. Il meccanismo di loop e l&#39;attivazione di fluorescenza è simile al segnale molecolare, mentre il lungo dominio a doppio filamento con una sporgenza 3&#39;-UU è più caratteristico di shRNA. Le caratteristiche shRNA sono progettate per guidare l&#39;esportazione nucleare, che abbiamo trovato aumenti di vita intracellulare per&gt; 24 ore, con il minimo degrado osservabile, eimpedisce non specifico apertura del loop. Come risultato RBMBs presentano uno sfondo segnale-significativamente superiore beacon molecolari. Va notato che RBMBs non possono essere preparati utilizzando oligonucleotidi di DNA, dal momento che le sonde basate sul DNA non possiedono le stesse capacità di esportazione nucleare come sonde di RNA. Strutturalmente, il ciclo RBMB è in genere progettato per essere tra 15 e 21 basi lungo, per creare un equilibrio tra specificità e selettività su RNA ibridazione. Il gambo corto che si forma dai due domini di auto-complementare di solito è progettato per essere 4 basi. Se si seleziona uno stelo più lungo, il tasso di ibridazione tra loop RBMB e RNA bersaglio è rallentato in modo significativo 17,18. Viceversa, quando è selezionata una sequenza più corta radice la temperatura di fusione è spesso troppo bassa per sostenere la struttura stem-loop a 37 ° C, portando ad un elevato segnale di fondo. La specificità del RBMB è anche rossouced come la lunghezza dello stelo si accorcia. Poiché la sequenza del RBMB stem-loop possono anche influenzare le prestazioni RBMB, deve essere attentamente selezionati 19. In particolare, le sequenze di loop ideale dovrebbe avere il minimo struttura secondaria, ibridare a sequenze di RNA con una minima struttura secondaria, evitare siti di legame della proteina, ed evitare fuori-obiettivo vincolante. Le previsioni di entrambi RBMB e struttura secondaria dell&#39;RNA possono essere ottenuti utilizzando software come mfold 20. Complementari siti off-target possono identificato utilizzando un nucleotide base locale Assegnazione Search Tool (BLAST). Tuttavia, a causa delle incongruenze nei previsioni del modello e la difficoltà di identificare i siti di proteine ​​di aspettare, la specificità di tutte le RBMBs deve infine essere convalidato sperimentalmente. Se auspicabile, un colorante di riferimento unquenched insensibile allo stato ibridazione può essere aggiunto al RBMB 15. L&#39;aggiunta di un colorante di riferimento può prOvide un marcatore per la consegna della sonda e possono essere usate per l&#39;imaging raziometrico, se sono necessarie misure più accurate di fluorescenza cellulare totale. I coloranti di riferimento permette misurazioni da regolare per le differenze di fondo a causa di cell-to-cell variazioni nella consegna. Tuttavia, quando l&#39;imaging RNA individuo trascrizioni il colorante di riferimento non è necessaria. In particolare, alcuni coloranti di riferimento possono interferire con l&#39;esportazione di RBMBs dal nucleo, portando ad un segnale di fondo leggermente superiore nel nucleo. Se progettato correttamente, RBMBs possono essere usati per immagine trascritti di RNA in cellule viventi individuo singolo, se l&#39;RNA bersaglio è progettato per contenere almeno quattro siti di legame RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs possono essere efficacemente forniti in una vasta gamma di tipi di cellule via microporation, con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare 21, e le misure quantitative di espressione genica possono essereacquisito entro 30 min. Inoltre, la metodologia è abbastanza insensibile a livelli di concentrazione RBMB e RNA bersaglio, dal momento che la fluorescenza da RBMBs non legato viene efficacemente spegne. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per preparare e purificare RBMBs, nonché una procedura generale per la fornitura di RBMBs in cellule vive tramite microporation e l&#39;imaging di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

La crescente consapevolezza che sia la regolazione temporale e spaziale dell&#39;espressione genica può avere conseguenze importanti sulla funzione cellulare ha portato allo sviluppo di tecniche diverse per visualizzare i singoli trascritti di RNA in cellule viventi singoli. Una tecnica promettente che è stato recentemente descritto utilizza una sonda basata oligonucleotide-ottica, raziometrico faro biomolecolare (RBMB), per rilevare trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere almeno quattro ripetizioni in tandem della sequenza bersaglio RBMB nella regione 3&#39;-non tradotta. RBMBs sono specificamente progettati per emettere un segnale fluorescente su ibridazione di RNA complementare, ma per il resto rimangono spente. L&#39;uso di una sonda sintetica in questo approccio consente fotostabile, rossa spostata, e coloranti organici altamente emissive da utilizzare per l&#39;imaging. Il legame di più RBMBs ai ingegnerizzati RNA trascrizioni risultati in macchie di fluorescenza discreti se visto sotto un microscopio a fluorescenza a livello di campo. Di conseguenza, il movimento dei singoli trascritti di RNA può essere facilmente visualizzato in tempo reale prendendo una serie temporale di immagini fluorescenti. Qui si descrive la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna in cellule da microporation e live-cell imaging trascrizioni singoli di RNA.

Poco dopo la microporation delle cellule HT1080 in presenza di RBMBs, singoli trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere più siti di legame RBMB nella loro 3&#39;-UTR appaiono macchie fluorescenti luminosi quando ripreso dal grande campo microscopia a fluorescenza (Figura 2). Mentre i singoli trascritti di RNA con siti di legame da un minimo di quattro RBMB possono essere esposte nelle cellule vive, il più siti nel 3&#39;-UTR vincolante RBMB, il più forte il segnale fluorescente. Inolt...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l&#39;imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Pennsylvania.  Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale. 

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Ricerca

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...