Questo studio è stato sostenuto dalla Swedish Research Council (www.vr.se) concede a ARC (2014-6466 e la Fondazione svedese per la ricerca strategica (www.stratresearch.se) ad arco (ICA14-0060). Chalmers University of Technology ha fornito sostegno finanziario per MKME durante questo lavoro. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

questo protocollo è descritto nella Figura 1 e include l'isolamento di gDNA, digestione con enzimi di restrizione per essere in grado di quantificare il numero di ribonucleotidi, trattamento con alcali per idrolizzare fosfodiesterico di ribonucleotidi inglobato il gDNA, la fosforilazione delle estremità gratuito a 5 minuti-OH, ssDNA legatura delle schede, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR prima sequenziamento.
 1. adattatori e indice primer <ol><li>ARC49 ottenere, oligonucleotidi ARC140, ARC76/77, adattatore e ARC78-ARC107 primer di indice (Vedi tabella 1). 
	Nota: Oligonucleotidi devono essere purificato di HPLC. ARC76/77 sono ordinati come duplex.</li>
	<li>Soluzioni di riserva preparare 100 µM di ogni oligonucleotide in tampone Tris-EDTA (TE) (Vedi la Tabella materiali) e conservare a -20 ° C.</li>
	<li>Preparare 10 µM soluzioni di ARC67/77 e 2 µM di primer ARC49 e indice diluendo in tampone di eluizione (EB; si veda la Tabella materiali). Conservare a-20 ° C.</li>
</ol> 2. Crescita e raccolta di cellule <ol><li>cellule HeLa crescere in 70 mL Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale in un matraccio di Spinner 250 mL a 37 ° C.</li>
	<li>Contare il numero di cellule e raccogliere 5 x 10 6 cellule in un tubo da 50 mL, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare le cellule con 20 mL 1X PBS, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Congelare i pellet a-20 ° C o continuare con la purificazione del DNA.</li>
</ol> 3. Purificazione del DNA e la quantificazione <ol><li>purificare gDNA mediante estrazione del fenolo-cloroformio come descritto di seguito.
	<ol><li>Risospendere le cellule in 2 mL di tampone di lisi (Vedi la Tabella materiali) ed incubare per 30 min a 42 ° C su un blocco di riscaldamento. 
		Attenzione: Il buffer di lisi contiene componenti pericolosi. Soluzione di SDS è irritante, proteinasi K sensibilizzanti, irritanti e tossici. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
		<li>Dividere il campione in due provette da 2 mL e aggiungere 1 volume (V) di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1). 
		Attenzione: Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico è tossico, mutageno, corrosivi e pericolosi per gli ambienti acquatici. Utilizzare in una cappa, indossare indumenti protettivi e guanti e gettare nei rifiuti speciali fenolo-cloroformio.</li>
		<li>Mix di inversione per 30-60 s e centrifugare per 5 min 15.000 x g a temperatura ambiente. 
		Nota: Non non vortice DNA per evitare di introdurre le rotture del filo casuale, che falserebbero i risultati.</li>
		<li>Trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di 2 mL ed aggiungere 1 V di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1).</li>
		<li>Mix di inversione e centrifugare per 5 min a 15.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire la fase acquosa superiore per tubo un nuovo 2 mL e aggiungere 20 µ l NaCl (5 M) e isopropanolo freddo di 1 V. 
		Attenzione: Isopropanolo è infiammabile, irritante e tossico. Conservarlo in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
		<li>Mix di inversione e incubare per almeno 1 h a -20 ° C.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min 15.000 x g, 4 ° C e scartare surnatante.</li>
		<li>Pellet di DNA di lavaggio con etanolo 70% freddo 200 µ l, centrifugare per 20 min a 15.000 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante. 
		Attenzione: etanolo al 70% è infiammabile e irritante. Tenere la soluzione di lavoro a-20 ° C, altrimenti negozio in ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
		<li>Asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20-25 min.</li>
		<li>Pellet di DNA sciogliere in 100 µ l TE buffer e piscina i campioni in uno tubo.</li>
	</ol></li> <li>Concentrazione di DNA quantitate utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore &#39; s specifiche (Vedi la Tabella materiali). 
	Nota: Utilizzare un reagente di quantificazione di dsDNA, perché spettrofotometrica quantificazione di DNA può essere influenzata da fenolo residua.</li>
	<li>Store DNA a-20 ° C o continuare con il trattamento di HincII.</li>
</ol> 4. Trattamento HincII e idrolisi alcalina mix <ol><li>Digest 1 µ g di DNA in una reazione contenente 5 µ l di tampone 10x 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e privo di nucleasi H 2 O ad un volume finale di 50 µ l. 
	Nota: Per ottenere le condizioni ottimali per la legatura, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR, esso può essere necessario aumentare la quantità di DNA input se si prevede che il DNA contiene un numero molto basso di ribonucleotidi. Allo stesso modo, può essere necessario diminuire l'ingresso del DNA se il numero di ribonucleotidi è molto alto.</li>
	<li>Incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>HincII purificare trattati DNA con perline paramagnetici. 
	Nota: Tenere il tubo coperchi aprire nei passaggi seguenti per non disturbare il pellet aprendo i tubi.
	<ol><li>Aggiungere 1,8 V di perline paramagnetici a ogni campione, mescolare accuratamente pipettando e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Utilizzare un rack magnetico per pellet le perline per 5 min, poi rimuovere ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 150 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s quindi rimuovere e scartare il supernatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 200 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s, quindi rimuovere e scartare il surnatante. 
		Nota: Etanolo residuo può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l. Le goccioline possono essere filate giù brevemente in anticipo.</li>
		<li>a secco i campioni a temperatura ambiente per circa 15-20 min. 
		Nota: L'ora esatta dipende dal volume di perline e la forma del pellet, pertanto i pellet devono essere controllati visivamente.</li>
		<li>Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire pellet in 45 µ l EB, mix pipettando attentamente.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti poi a pellet le perline sul rack magnetico e utilizzare 45 µ l di DNA purificato nel passaggio 4.4.</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 5 µ l di KOH (3 M) o KCl (3 M) per il creazione di un volume totale di 50 µ l di DNA. 
	Attenzione: 3 soluzione di KOH M è corrosivo. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
	Forno <li>Incubare per 2 ore a 55 ° C in un'ibridazione seguita da 5 min su Ice. 
	Nota: Si raccomanda di eseguire il trattamento di KOH in un forno piuttosto che un blocco di riscaldamento per mantenere un riscaldamento uniforme del tubo ed evitare la condensa presso il coperchio.</li>
	<li>DNA precipitare aggiungendo 10 µ l di sodio acetato (3 M, pH = 5.2) e 125 µ l etanolo 100% freddo. Incubare in ghiaccio per 5 min. 
	Attenzione: etanolo al 100% è infiammabile e irritante. Archiviare in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
	<li>Pellet gDNA mediante centrifugazione a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	Pellet <li>Wash DNA con 250 µ l freddo 70% EtOH, centrifugare a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante. 
	Nota: Per rimuovere le goccioline, il tubo può essere filato giù brevemente nuovamente e surnatante può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l.</li>
	<li>Asciugare il pellet in un tubo aperto per circa 5-10 minuti fino a quando tutto il liquido visibile evaporato.</li>
	<li>Si dissolve pellet di DNA lasciate in 20 µ l EB per 30 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 5. fosforilazione fine a 5 minuti <ol><li>preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo controesistente di 2,5 µ l 10 x 2,5 µ l ATP (10 mM), 1 della chinasi di polinucleotide T4 di 3 ´-fosfatasi-minus µ l (10 U) e tampone di reazione della chinasi di polinucleotide T4.</li>
	<li>Trasferire 19 µ l di ogni DNA del campione in una nuova provetta da 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Cool DNA campioni su ghiaccio e aggiungere 6 µ l della miscela di reazione per ogni campione.</li>
	<li>Miscele di reazione Incubare a 37 ° C per 30 min e fermata la reazione incubando i campioni a 65 ° C per 20 min.</li>
	<li>Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 1.8 V di perline paramagnetici ma eluire in 14 µ l EB.</li>
</ol> 6. ssDNA legatura <ol><li>preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo composto da 0,5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x tampone di reazione ligasi T4 RNA, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25 µ l 50% PEG 8000. Mix ben pipettando. 
	Attenzione: CoCl 3 (NH 3) 6 è cancerogeno, sensibilizzanti e pericolosi per l'ambiente acquatico. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
	<li>Trasferire 13 µ l di DNA purificato da 5.5 un passo ad un nuovo tubo di 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 36 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando e spin giù brevemente.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l (10 U) di T4 RNA ligasi ad ogni reazione, Miscelare pipettando e spin giù brevemente.</li>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente nella notte scura.</li>
</ol> 7. Sintesi secondo-filo <ol><li>purificare legato del DNA come descritto al punto 4.3, ma utilizzare 0,8 V di perline paramagnetici, pellet le perline per 10 min ed eluire in 20 µ l EB. 
	Nota: A causa della maggiore viscosità della miscela di reazione di legatura, il primo passo d'appallottolamento è prolungato.</li>
	<li>Trasferire 20 µ l di campione di DNA in una nuova provetta PCR 200 µ l. Ripetere il passaggio di purificazione mediante 0,8 V di paramagnetici perline seguendo il produttore &#39; s specifiche ed eluire in 14 µ l EB.</li>
	<li>Preparare il mix di reazione per ogni campione in anticipo che consiste di 2 µ l di tampone di reazione 10 di polimerasi del DNA del x T7, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTP (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>µ L trasferimento 12,8 purificato del DNA ad un nuovo tubo di 200 µ l, denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 6,8 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando, rallentare brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerasi in ogni reazione ed incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetiche ed eluire in 11 µ l EB.</li>
</ol> 8. L'amplificazione di PCR e la quantificazione di biblioteca tubo di <ol><li>preparare il mix di reazione per ogni campione in un nuovo 200 µ l in anticipo costituito da 7,5 µ l ARC49 (2 µM), 7,5 µ l indice primer (2 µM, unico per ogni campione) e 25 µ l 2 x avviamento a caldo miscela pronta.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di campione di DNA per ogni reazione. Amplificare la libreria utilizzando le seguenti condizioni: denaturare a 95 ° C per 45 s, seguiti da 18 cicli di 98 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s, terminando con un allungamento finale a 72 ° C per 2 min. Hold campioni al 4 ° C dopo amplificazione.</li>
	<li>Purificare librerie come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici ed eluire in 20 µ l di tampone TE.</li>
	<li>Quantitate librerie utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA, secondo il produttore &#39; s specifiche (Vedi la Tabella materiali).</li>
	<li>Conservare i campioni a-20 ° C o continuare con analisi biblioteca.</li>
</ol> 9. Analisi della libreria e Pooling <ol><li>determinano la qualità di ogni libreria e stimare la dimensione del frammento media utilizzando un sistema di elettroforesi digitale. 
	Nota: La dimensione del frammento medio è valutato stimando dove l'area sotto la curva dell'elettroferogramma è dimezzato, trascurando le cime da marcatori. Risultati rappresentativi di profili adatti biblioteca dopo trattamento KOH o KCl sono riportati nella Figura 2A.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione (nM) delle librerie come: 
	/(p*650) (c/10 3)] * 10 9 dove c è la concentrazione della libreria in ng / µ l e p è la dimensione del frammento medio in bp, come valutato in 9.1.</li>
	<li>Piscina molare quantità uguali di fino a 24 biblioteche amplificati con gli iniettori di indice diverso per il sequenziamento. Aggiungere buffer di TE ad un volume finale di 25 µ l e alla concentrazione di 10 nM. 
	Nota: A seconda del numero di librerie per eseguire il pooling, la quantità di DNA da ogni libreria è regolato. Se sono stati rilevati dimeri dell'iniettore nel passaggio 9.1 come un picco distinto di circa 130 bp, il volume finale della piscina biblioteca può superare 25 µ l, perché la fase di purificazione viene ripetuta come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici, e DNA è eluito in 25 µ l TE buf Fer.
	<ol><li>Determinare la concentrazione di piscina biblioteca nuova utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore &#39; s specifiche e la media dimensione di picco come descritto sopra. Procedere al sequenziamento e analisi dei dati (articoli 10 e 11).</li>
	</ol></li></ol> 10. Sequenziamento <ol><li>eseguire sequenziamento accoppiato-fine 75-base su librerie pool 12.</li></ol>
 11. analisi dei dati <ol><li>Trim tutte le letture per rimuovere sequenze adattatore, filtrare per qualità e leggere lunghezza. 
	Nota: Questo può essere fatto utilizzando cutadapt 1.2.1 20 con il comando ' cutadapt -f fastq - incontro-lettura-i caratteri jolly - tranquillo -m 15 - q 10 - un NNNNNNN &#60; FILE &#62;', dove NNNNNNN viene sostituito con la sequenza effettiva adattatore e &#60; FILE &#62; è sostituito con il nome del file fastq.</li>
	<li>Rimuovere accoppiamenti di letture che sono stati eliminati nel passaggio precedente utilizzando script personalizzati.</li>
	<li>Allineare Mate 1 dei restanti paia ad un indice contenente la sequenza di tutti gli oligonucleotidi utilizzati per la preparazione di biblioteca (ad es., utilizzando Bowtie 0.12.8 21 e la riga di comando Opzioni - m1-v2). Scarta tutte le coppie con successo allineamenti.</li>
	<li>Allineare coppie rimanenti al genoma di riferimento organismo utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni - v2 -X 10000..--meglio.</li>
	<li>Mappa legge che spaziano tra la molecola mitocondriale inizio e fine allineando Mate 1 di tutte le coppie non allineate (utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni - v2).</li>
	<li>Determinare il conteggio delle 5 ´-estremità per tutti gli allineamenti di fine singolo o coppia. Spostare la posizione di questi da una base a Monte sulla posizione dove erano l'idrolizzato ribonucleotidi.</li>
	<li>Esportazione dati dal file di bowtie formato in un formato di file di bedgraph utilizzando script personalizzati per la visualizzazione in comune browser genoma. Normalizzare le letture per ogni ciocca per letture al milione.</li>
	<li>Utilizzando i conteggi e la posizione del file di bedgraph, fare riferimento la sequenza del genoma di organismo per determinare l'identità di incorporated ribonucleotidi. 
	Nota: Per il genoma mitocondriale umano si legge dalle regioni 16.200-300 e 5.747-5.847 per ogni filo dovrebbe essere esclusi dal momento che queste regioni contengono molti 5 ´-estremità libere non correlate all'incorporazione del ribonucleotide di DNA polimerasi γ.</li>
	<li>Dividere il totale letture, non tra cui letture a undici siti HincII, con il numero medio di letture al sito HincII per ottenere il numero di ribonucleotidi per rottura del singolo filo, (cioè il numero di ribonucleotidi per molecola mitocondriale).</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui presentiamo una tecnica per contemporaneamente mappare e quantificare ribonucleotidi in gDNA e mtDNA in particolare, la semplice introduzione di fenditura del DNA in siti specifici di sequenza del genoma come un'aggiunta al protocollo stabilito HydEn-seq. Mentre questo studio si concentra sul mtDNA umano, originariamente il metodo HydEn-seq è stato sviluppato in Saccharomyces cerevisiae, che illustrano la traduzione del metodo a altri organismi12,16.
Per ottenere risultati affidabili ottenuti da questo approccio, si devono sottolineare alcuni passaggi critici: (A) dato che schede di sequenziamento legare a tutti i disponibili a 5 minuti-end, è fondamentale lavorare con DNA altamente intatto. DNA deve essere isolato e biblioteche dovrebbero essere effettuate preferibilmente immediatamente dopo isolamento del DNA o il DNA può essere conservato a-20 ° C. Non si consiglia di conservare il DNA in frigo per un lungo periodo o di congelare e scongelare ripetutamente. (B) per generare librerie adatte con questo metodo, è fondamentale eseguire il trattamento di KOH del DNA in un forno di incubazione, piuttosto che un blocco di riscaldamento, garantendo il riscaldamento omogeneo dell'intero campione e idrolisi quantitativa. (C) Inoltre, è fondamentale per controllare la qualità delle librerie prima di pooling e sequenziamento. Il DNA devono essere quantificati e analizzati utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzata per garantire un'adeguata quantità di DNA, delle biblioteche confermare dimensioni frammento appropriato e controllare i dimeri dell'iniettore.
Per un'analisi di dati significativi, è anche importante notare che il valore informativo di questo metodo dipende da controlli appropriati per valutare sfondo conteggi e pregiudizi sequenza o filo. Abbiamo regolarmente raggiungere un'efficienza di mappatura in campioni di KCl di quasi il 70% quando solo digerire con l'endonucleasi specifiche di sequenza (Figura 2B, pannelli a sinistra). Inoltre, è importante confermare che il trattamento di endonucleasi non colpisce il totale rilevamento di ribonucleotidi incorporati confrontando HincII trattati e non trattati di campioni (Figura 3B). In questi esperimenti, abbiamo usato HincII per introdurre tagli specifici del sito, anche se potrebbero essere utilizzati anche altri enzimi di restrizione ad alta fedeltà.
Il protocollo potrebbe essere adattato per studiare altri tipi di lesioni del DNA che possono essere elaborati a 5 ´-fosfato o a 5 minuti-OH finisce. La precisione dei risultati dipende la specificità dell'elaborazione e richiede controlli adeguati (ad es., wild-type o non trattati) per la verifica. Inoltre, quando si adatta questo metodo ad altre applicazioni o per l'utilizzo con altri organismi, si dovrebbe considerare che il metodo nel suo attuale setup richiede circa 1 µ g di DNA che viene elaborato in una raccolta. Poiché il numero delle estremità è dipenda dal numero di ribonucleotidi incorporati, che varia a seconda dell'organismo o mutante, campioni tra cui un numero inferiore di ribonucleotidi richiederebbe più di input del DNA per generare un numero sufficiente di estremità nella costruzione della libreria successivi. Allo stesso modo, se i campioni di DNA hanno un numero molto più elevato di ribonucleotidi, sarebbe anche necessario usando il DNA meno input per ottenere condizioni ottimali per la legatura, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR. È interessante nota che la costruzione della libreria come descritto in questo protocollo generato anche dati che riguardano il genoma nucleare (come visualizzato in Figura 2D) e solo l'analisi dei dati si è concentrata sul mtDNA. Ciò illustra che più grandi genomi con frequenze ribonucleotide moderatamente inferiori sono anche catturati da questo metodo.
Quando si considera questo metodo, si devono tener conto di alcune limitazioni: Sebbene questo metodo dovrebbe, in teoria, essere applicabile a qualsiasi organismo, un genoma di riferimento adeguato è necessario per l'allineamento di letture. Inoltre, i risultati ottenuti dal nostro protocollo rappresentano le letture da un gran numero di cellule. Modelli di incorporazione ribonucleotide specifici di un sottoinsieme delle cellule non possono essere identificati da questo approccio. Se ribonucleotidi sono mappati in genomi più grandi con un numero molto basso di ribonucleotidi, e può essere difficile discriminare ribonucleotidi da Nick casuale e pertanto sono necessari controlli appropriati.
Il metodo che descriviamo qui, estende le tecniche disponibili in vivo come HydEn-Seq16, ribosio-Seq17, Pu-Seq18o emRiboSeq19. Questi approcci approfittare della sensibilità dei ribonucleotidi incorporato per alcaline o trattamento di RNasi H2, rispettivamente, che impiegano sequenziamento di nuova generazione per identificare ribonucleotidi genoma, che permette loro mappatura e il confronto delle relativa incorporazione. Fendendo la sequenza di DNA in modo specifico, come descritto in precedenza, oltre a idrolisi alcalina presso ribonucleotidi incorporati, le letture per ribonucleotidi possono essere normalizzate in quei siti di clivaggio, permettendo non solo l'identificazione e la mappatura del ribonucleotidi, ma anche la loro quantificazione per ogni molecola di DNA. L'applicazione della nostra tecnica nel contesto di malattie legate alla replicazione del DNA, riparazione del DNA e TLS potrebbe fornire una più profonda comprensione del ruolo di ribonucleotidi in base dei meccanismi molecolari e l'integrità genomica in generale.

In una cellula eucariotica, la concentrazione di ribonucleotidi (rNTPs) è molto superiore alla concentrazione di deossinucleotidi (dNTPs)1. Polimerasi del DNA di discriminano ribonucleotidi, ma questa discriminazione non è perfetta e, di conseguenza, ribonucleotidi invece di deossinucleotidi possono essere incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA. Ribonucleotidi possono essere i più comuni nucleotidi non canonico incorporati nel genoma2. La maggior parte di questi ribonucleotidi vengono rimosse durante la maturazione del frammento di Okazaki di riparazione per escissione iniziati ribonucleotide RNasi H2 (RER) o da 1 topoisomerasi (rivisto in riferimento3). Ribonucleotidi non possono essere rimosso soggiorno stabilmente incorporati nel DNA2,4 e possono influenzare in modi sia nocivi che benefici (rivisto in ha commentato5). Oltre ad essere in grado di agire come segnali positivi, ad esempio nell'accoppiamento tipo passare in Schizosaccharomyces pombe6 e marcatura filo del DNA nascente durante la mancata corrispondenza di riparazione (MMR)7,8, ribonucleotidi influenzano la struttura9 e stabilità del DNA circostante a causa del gruppo di idrossile 2 di loro ribosio10, con conseguente instabilità di stress e genoma replicativa11. L'abbondanza di ribonucleotidi in DNA genomic (gDNA) e la loro rilevanza nella replica e meccanismi di riparazione, nonché le implicazioni per la stabilità del genoma, dare motivo per indagare il loro avvenimento preciso e la frequenza in maniera genoma.
Attività di RNasi H2 non è stato trovato in mitocondri umani e ribonucleotidi pertanto vengono rimossi in modo non efficiente in DNA mitocondriale (mtDNA). Parecchie vie sono coinvolti nella fornitura di nucleotidi di mitocondri umani e per studiare se le dispersioni nella piscina del nucleotide mitocondriale causano un elevato numero di ribonucleotidi nel mtDNA umano, abbiamo sviluppato un protocollo per mappare e quantificare questi ribonucleotidi nel mtDNA umano isolato da fibroblasti, cellule HeLa e paziente cella linee12.
Maggior parte degli approcci in vitro (rivisto in ha commentato13) per determinare la selettività di polimerasi del DNA contro rNTPs sono basata su esperimenti inserimento o primer ribonucleotide singola estensione dove rNTPs concorrenti sono inclusi nella reazione mescolare, consentendo l'identificazione o la quantificazione relativa di incorporazione ribonucleotide in breve modelli di DNA. Approcci quantitativi su brevi sequenze possono non riflettere piscine dNTP e rNTP presso le concentrazioni cellulari e pertanto fornire approfondimenti selettività della polimerasi, ma sono di limitata importanza per quanto riguarda interi genomi. È stato dimostrato che la quantità relativa di ribonucleotidi incorporato durante la replica di un modello di DNA più lungo, ad esempio un plasmide, possa essere fruita su un gel di sequenziamento utilizzando dNTP radioattivo e d'idrolizzazione il DNA in un ambiente alcalino14. Inoltre, è stato analizzato gDNA il Southern blot dopo idrolisi alcalina, consentendo filo specifico sondaggio e determinazione dei tassi di assoluta del ribonucleotide incorporazione in vivo15. Questi approcci consentono un confronto relativo della frequenza di incorporazione ma non consegnare spaccato la posizione o l'identità dei ribonucleotidi incorporati. Approcci più recenti per analizzare il contenuto del ribonucleotide gDNA in vivo, come HydEn-Seq16, ribosio-Seq17, Pu-Seq18o emRiboSeq19, approfitta dei ribonucleotidi incorporati sensibilità a alcalini o trattamento di RNasi H2, rispettivamente e impiegano il sequenziamento di nuova generazione per identificare ribonucleotidi genoma. Questi metodi non forniscono spaccato la frequenza assoluta incorporazione della ribonucleotidi rilevati. Aggiungendo il passo di scissione enzimatica specifica sequenza del protocollo HydEn-seq, il metodo che qui descritto convenientemente estende le informazioni acquisite da un approccio di sequenziamento, consentendo la mappatura simultanea e quantificazione di embedded ribonucleotidi12. Questo metodo è applicabile a qualsiasi organismo dato che estratti di DNA altamente intatti possono essere generati e un genoma di riferimento adeguati è disponibile. Il metodo potrebbe essere adattato per quantificare e determinare la posizione di qualsiasi lesione che può essere digerita da una nucleasi e lascia un 5 ´-fosfato o un fine 5 ´-OH.
Per mappare e quantificare ribonucleotidi in DNA genomic, il metodo combina la scissione di un'endonucleasi specifiche di sequenza e idrolisi alcalina generando 5 ´-fosfato finisce in siti in cui si trova la sequenza di riconoscimento specifico per l'endonucleasi e a 5 minuti- OH finisce alle posizioni dove si trovavano ribonucleotidi. Poiché le estremità libere generate successivamente sono legate con adattatori e sequenziati mediante sequenziamento di nuova generazione, è di importanza utilizzare DNA altamente intatto ed evitare la frammentazione casuale durante la preparazione del DNA estrazione e biblioteca. Valutare queste letture normalizzate per la legge presso i siti di fenditura dell'endonucleasi permette una quantificazione simultanea e la mappatura dei ribonucleotidi rilevati. A 5 minuti-estremità libere vengono rilevate in esperimenti di controllo dove l'idrolisi alcalina del DNA viene sostituito dal trattamento con KCl. I dati acquisiti forniscono approfondimenti ribonucleotide posizione e quantità e permette analisi rispetto alla frequenza di contenuto e incorporazione del ribonucleotide.

<table><tbody><tr><td>10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>dissolve 1 tablet in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to a final volume of 1 L</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-Triphosphate (ATP, 10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td>dilute with EB to 2 mM</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>diltue with nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td>referred to as EB</td></tr><tr><td>CleanPCR paramagnetic beads</td><td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dilute with EB to 2 mM</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Side</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.5% analytical grade</td><td>Solveco</td><td>1395</td><td>dilute with milliQ water to 70%</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(NH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td><td>dissolve in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 10&amp;nbsp;M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.</td></tr><tr><td>HincII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0103S</td><td>supplied with NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>Hybridiser HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &amp;micro;g/mL), 1% SDS</td></tr><tr><td>Micro tube 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Multiply&amp;nbsp;&amp;micro;StripPro 0.2 mL tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Phenol &amp;ndash; chloroform &amp;ndash; isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td><td>dissolve in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 3&amp;nbsp;M solution, sterile filter</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>VWR</td><td>26668.296</td><td>dissolve in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 3&amp;nbsp;M solution, sterile filter</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td></tr><tr><td>Refrigerated Centrifuge 4K15</td><td>Sigma Laboratory Centrifuges</td><td>No. 10740</td><td></td></tr><tr><td>SDS Solution, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td>dissolve in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5&amp;nbsp;M solution, sterile filter</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase (3&#039; phosphatase minus)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>supplied with PEG 8000 (50%)</td></tr><tr><td>T7 DNA Polymerase (unmodified)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td>supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>5387000013</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna

Gli approcci di stimare il numero di ribonucleotidi presenti in un genoma stabiliti sono limitati per la quantificazione di ribonucleotidi incorporati utilizzando brevi frammenti sintetici di DNA o plasmidi come modelli e quindi estrapolare i risultati a tutta la genoma. In alternativa, si può stimare il numero di ribonucleotidi presenti in un genoma usando gel alcalino o Southern blot. Approcci più recenti in vivo impiegano sequenziamento di nuova generazione che consente la mappatura del genoma di ribonucleotidi, fornendo la posizione e l'identità di ribonucleotidi incorporati. Tuttavia, non consentono la quantificazione del numero di ribonucleotidi, che sono incorporati in un genoma. Qui descriviamo come contemporaneamente mappare e quantificare il numero di ribonucleotidi, che sono incorporati in umano mitocondriale del DNA in vivo mediante sequenziamento di nuova generazione. Usiamo il DNA altamente intatto e introdurre sequenza specifico doppio filamento interruzioni di digerirlo con un'endonucleasi, successivamente idrolizzazione ribonucleotidi incorporati con alcali. Le estremità generate sono legate con adattatori e queste estremità sono in sequenza su una macchina di sequenziamento di nuova generazione. Il numero assoluto di ribonucleotidi può essere calcolato come il numero di letture all'esterno del sito di riconoscimento per il numero medio di letture presso il sito di riconoscimento per l'endonucleasi specifiche di sequenza. Questo protocollo può anche essere utilizzato per mappare e quantificare gratis nicks nel DNA e permette l'adattamento mappare altri lesioni del DNA che possono essere elaborati a 5 ´-OH estremità o estremità 5 ´-fosfato. Inoltre, questo metodo può essere applicato a qualsiasi organismo, dato che un genoma di riferimento adeguati è disponibile. Questo protocollo fornisce pertanto un importante strumento per studiare la replicazione del DNA, a 5 minuti-fine elaborazione, danno del DNA e riparazione del DNA.

Illustrando la metodologia descritti sopra, rappresentante i dati sono stati generati l'analisi del DNA mitocondriale umano da HeLa cellule12. Figura 2B Mostra il riepilogate letture affatto HincII siti in pesanti (HS) e filo di luce (LS) del mtDNA umano dopo il trattamento di KCl (pannelli a sinistra). Circa 70% di tutti i rilevati 5 ´-End localizzare i siti di taglio, che dimostrano l'alta efficienza della digestione HincII. Trattamento di librerie con KOH per idrolizzare il DNA ribonucleotidi incorporati riduce il numero di letture HincII siti per circa il 40% (Figura 2B, pannelli di destra). Questo è previsto dal momento che un numero elevato di 5 ´-estremità vengono generato presso i siti di incorporazione ribonucleotide ed è indicativo di una sufficiente qualità di biblioteca. Figura 2 illustra la localizzazione e la frequenza di 5 minuti-estremità (verde) dopo letture e trattamento di KCl generati da HydEn-seq (magenta) dopo il trattamento di KOH, rilevazione sia gratuita a 5 minuti-estremità e generato in ribonucleotidi da idrolisi alcalina. A 5 minuti-estremità libere e ribonucleotidi localizzazione al HS del mtDNA umano vengono mostrati nel pannello di sinistra e quelli eseguendo la localizzazione del LS sono mostrati nel pannello di destra. Ai numeri relativi di crude letture presso ribonucleotidi (Figura 2D, pannello superiore) o siti di HincII (pannello inferiore) in HS e LS di mtDNA mostrano, rispettivamente, una copertura più forte 14-fold o 31-fold del LS rispetto il HS, mentre una simile polarizzazione non è stata osservata per DNA nucleare. Questa polarizzazione di filo può essere spiegata con la netta differenza nella composizione di base dei due fili e illustra l'importanza della normalizzazione per letture a HincII siti.
Normalizzando la lettura conta a HincII dà una misura quantitativa del numero di ribonucleotidi al genoma mitocondriale (Figura 3A). Come illustrato in Figura 3B, le letture dopo trattamento di KOH per ogni ribonucleotide normalizzato per la composizione di sequenza di ogni filo Visualizza un rapporto diverso da 1, che indica una distribuzione non casuale di letture suggerendo un ribonucleotide distinti modello e una libreria alta qualità. Tale rapporto viene influenzato dalla digestione precedente con HincII, verificare la specificità di clivaggio dell'enzima. Normalizzare le letture presso i siti di ribonucleotidi incorporati ai siti di clivaggio HincII, come pure ai contenuti del nucleotide del genoma, genera una misura quantitativa di quanti di ogni ribonucleotide sono incorporati per 1.000 basi complementari ( Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
Figura 1: schematico per DNA lavorazione e preparazione di biblioteca. (1) intero genomic DNA viene scisso dalla HincII per la normalizzazione nella successiva quantificazione di ribonucleotidi, generando estremità smussata in siti HincII (freccia nera). (2) il DNA è trattato con KOH per idrolizzare presso siti ribonucleotide, portando a 2, 3 ´-ciclico fosfato (Pentagono rosso) a 3 ´-estremità e gratuito a 5 minuti-OH. (3) a 5 minuti-OH estremità sono fosforilate da T4 polinucleotide chinasi 3 ´-fosfatasi-minus. (4) tutte a 5 minuti-estremità che trasportano un gruppo fosfato sono legate per il oligonucleotide ARC140 di ligasi T4 RNA. (5) il secondo filo è sintetizzato utilizzando T7 polimerasi del DNA e il ARC76-77 oligonucleotidi contenenti sequenze casuali di6 N. (6) la biblioteca è amplificata da una polimerasi di DNA ad alta fedeltà utilizzando ARC49 e uno dei ARC78 di ARC107 primer di indice contenente un codice a barre univoco per multiplexing. (7) a 5 minuti-estremità si trovano tramite sequenziamento accoppiato-fine. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
Figura 2: validazione del metodo. (A) rappresentante elettroferogrammi generato utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzata per determinare la qualità del generato librerie trattate con segnale KOH o KCl. (B) riassunti in siti HincII pesanti (HS) e filo di luce (LS) mtDNA umano dopo KCl (pannelli a sinistra) o trattamento di KOH (pannelli di destra). Circos (C) figura di 5 ´-estremità libere (verde) e da HydEn-Seq (a 5 minuti-estremità libere e ribonucleotidi, magenta) in HS (pannello di sinistra) e mtDNA umano LS (pannello di destra). Picchi sono normalizzate per milioni letture e il picco massimo è regolato per il numero massimo di letture della biblioteca HydEn-seq. (D) riassunti raw legge alla ribonucleotidi (pannello superiore) e HincII siti (pannello inferiore) in pesante (H) e filo di luce (L) nel mtDNA umano (Mito.) o in senso inverso (RV) o avanti (FW) strand in nucleare (Nuc). DNA. Figure B, C e D sono adattate dal riferimento12. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
Figura 3: rappresentante risultati. (A), il relativo numero di ribonucleotidi normalizzata a letture HincII siti per le librerie KOH trattati sul pesante (H) o filo di luce (L). (B) rapporto di identità ribonucleotide alla composizione del genoma mtDNA per KOH trattati (KOH) e HincII spaccati con KOH trattati (HincII + KOH) librerie sul pesante (H) o filo di luce (L) del mtDNA. (C) frequenza Ribonucleotide normalizzato a 1.000 basi complementari per HincII e KOH trattati librerie sul pesante (H) o filo di luce (L) del mtDNA. Figure sono adattati dal riferimento12. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome</td>
			<td colspan="4">Sequenza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

Tabella 1: oligonucleotidi. Sono elencati gli oligonucleotidi utilizzati per HydEn-segg. Grassetto indica l'indicizzazione. * indica un legame fosforotioato. ARC140 contiene un gruppo amminico a 5 minuti invece di un gruppo di 5 ´-OH, in combinazione con un linker di C6. Questa modifica riduce la formazione di ARC140 concatemeri durante la legatura.

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Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Qui descriviamo un metodo suscettibile di quantificare contemporaneamente e ribonucleotidi Mappa del genoma nel DNA altamente intatto alla risoluzione del singolo-nucleotide, che unisce la scissione enzimatica del DNA genomico con la sua idrolisi alcalina e successivi 5 ´-fine sequenziamento.

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Views.  University of Gothenburg. Qui descriviamo un metodo suscettibile di quantificare contemporaneamente e ribonucleotidi Mappa del genoma nel DNA altamente intatto alla risoluzione del singolo-nucleotide, che unisce la scissione enzimatica del DNA genomico con la sua idrolisi alcalina e successivi 5 ´-fine sequenziamento.

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Ricerca

Genetica

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Biologia

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the others contain 5&#39; monophosphate generated post-transcriptionally (processed transcripts). To discriminate between the two types of transcripts, several strategies have been developed, and most of them depend on presence/absence of 5&#39; triphosphate. However, the triphosphate at primary 5&#39; termini is unstable, and it hinders a clear discrimination of the two types of transcripts. To systematically differentiate and map the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion, we have developed a circular RT-PCR (cRT-PCR)-based strategy by combining cRT-PCR, RNA 5&#39; polyphoshpatase treatment, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), and Northern blot. As an improvement, this strategy includes an RNA normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate.
In this protocol, the enriched mitochondrial RNA is pre-treated by RNA 5&#39; polyphosphatase, which converts 5&#39; triphsophate to monophosphate. After circularization and reverse transcription, the two cDNAs derived from 5&#39; polyphosphatase-treated and non-treated RNAs are normalized by maize 26S mature rRNA, which has a processed 5&#39; end and is insensitive to 5&#39; polyphosphatase. After normalization, the primary and processed transcripts are discriminated by comparing cRT-PCR and RT-qPCR products obtained from the treated and non-treated RNAs. The transcript termini are determined by cloning and sequencing of the cRT-PCR products, and then verified by Northern blot.
By using this strategy, most steady-state transcripts in maize mitochondrion have been determined. Due to the complicated transcript pattern of some mitochondrial genes, a few steady-state transcripts were not differentiated and/or mapped, though they were detected in a Northern blot. We are not sure whether this strategy is suitable to discriminate and map the steady-state transcripts in other plant mitochondria or in plastids.

We present a circular RT-PCR-based strategy by combining circular RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5&#39; polyphosphatase-treatment, and Northern blot. This protocol includes a normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate, and it is suitable for discriminating and mapping the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion.

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autore in primo piano: Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Biochimica

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

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Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

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Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

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