Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di G.H. e J.H.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi C57BL/6J wild-type.
1. raccolta ovaie fetale o neonatale e preparazione della cromatina profase si diffonde
<ol><li>Per estrarre gli embrioni a 14,5 – 19,5 giorni coitum dell'alberino (dpc) sacrificare le femmine incinte tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC. Nota: Per le ovaie postnatale giorno 1 – 5, passare al punto 1.3. Figura 1 riassume le fasi Profase Meiotica arricchite alle diverse età embrionale e post-natale.</li>
	<li>Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Sezionare il corno uterino materno, separare gli embrioni dalla placenta e trasferire gli embrioni in 35mm di Petri contenente 3 mL di pre-riscaldato 1 x la soluzione salina tampone fosfato (PBS) a 37 ° C. Nota: Un fliptop incubatore a 37 ° C può essere utilizzato per mantenere la temperatura. Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata utilizzabile anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione dell'ovaia.</li>
	<li>Con forbici chirurgiche da 3,5 pollici, sacrificare embrioni o cuccioli tramite decapitazione secondo linee guida IACUC. Posto decapitati embrioni o cuccioli in PBS preriscaldata prima dell'ulteriore dissezione.</li>
	<li>Sezionare un embrione o cucciolo alla volta in una capsula Petri 35mm separato contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Procedere tagliando lungo la linea mediana ventrale della metà posteriore dell'embrione, lungo la metà anteriore sotto le zampe anteriori e direttamente sopra le arti posteriori e la coda come indicato in Figura 2A–B.</li>
	<li>Aprire l'addome utilizzando forbici chirurgiche da 3,5 pollici. Usando il forcipe punta fine spostare o rimuovere il fegato e le anse intestinali, esponendo le ovaie in un nuovo 35mm di Petri contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C (Vedi Guida in Figura 2B). Le ovaie si trovano immediatamente sotto e dietro il rene verso la parete posteriore della cavità peritoneale (Figura 2B–C). Una guida per la differenziazione tra maschio e femmina gonadi è fornita in Figura 2D. Nota: Per condizioni ottimali, rapidamente sezionare le ovaie dopo donna incinta viene sacrificata.</li>
	<li>Rimuovere entrambe le ovaie da ogni feto femminile usando un paio di pinze a punta fine sotto un ambito di dissezione e posto in una vetri da orologio o pozzetti separati di un multi-pozzo piastra da 0,5 a 1,0 mL di PBS preriscaldata e mantengono a 37 ° C.</li>
	<li>Posizionare ogni coppia delle ovaie in 0,5 mL di tampone hypo-estrazione (17mm citrato trisodico biidrato, saccarosio 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibitore della proteasi, pH 8.2) in un vetro da orologio pulito o un piccolo pozzo di una piastra 9, avendo cura di immergere il comp di ovaie completamente. Incubare per almeno 15 min, ma non più di 30 min. Nota: Fare tampone di hypo-estrazione fresco e utilizzare entro 2 ore DTT aggiunta.</li>
	<li>Durante l'incubazione, utilizzando una penna PAP barriera idrofoba, è possibile disegnare due 22x22 mm2 quadrati in un bicchiere pulito 25 x 75 mm2, vetrino da microscopio spessore 1 mm come mostrato in Figura 3A. Nota: Diapositive possono essere preparati prima del tempo.</li>
	<li>45 – 50 µ l di saccarosio di 100 mM su un vetrino pulito e trasferire una coppia delle ovaie per la discesa.</li>
	<li>Utilizzando l'estremità tagliente di due aghi 27 G, prendere in giro le ovaie a pezzi per rilasciare cellule nella soluzione di saccarosio. Con una pinza, rimuovere pezzi grossi dell'ovaia e Pipettare attentamente la soluzione di saccarosio per disperdere le cellule.</li>
	<li>Posto 40 µ l di soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,2% detergente (Vedi Tabella materiali), pH 9.2) in ogni quadrato del vetrino preparato. Con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire la soluzione fissante uniformemente sopra la superficie di scorrimento.</li>
	<li>Pipettare 20 µ l della miscela saccarosio sulla ogni piazza della diapositiva contenente il fissativo. Nota: Questo equivale a usare un paio di ovaie per ogni diapositiva.</li>
	<li>Incubare i vetrini in una camera umida chiusa durante la notte a temperatura ambiente. Nota: L'incubazione overnight possa oscillare intorno ai (12-15 ore) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aprire il coperchio e lasciare i vetrini asciugare completamente.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-PBS 0,4% (Vedi Tabella materiali) per 2 min, lasciare asciugare all'aria e procedere al protocollo immunolabelling (passaggio 6). Nota: È possibile memorizzare le diapositive a-80 ° C per un uso successivo, ma questo varia a seconda della proteina di interesse. Per ottenere risultati ottimali procedere immediatamente al protocollo immunolabelling (passaggio 6).</li>
</ol>2. metafase ho raccolta degli ovociti
<ol><li>Per massimizzare il numero di follicoli antrali isolato da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG, gonadotropina corionica conosciuto anche come equina (eCG)). Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare PMSG, sciogliere bottiglia di 5.000 UI in 100 mL di PBS sterile (5ml U/0.1) Store in aliquote monouso di 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Dopo 44 – 48 h, preparare il supporto di collezione, minimo essenziale medio alfa (MEMα) supplementato con 5% siero bovino fetale (FBS) e 3 mg/mL di sieroalbumina bovina (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilizzare media attraverso un filtro di pori di 0,2 µm. Decantare 2,5 mL MEMα/BSA/FB medio in un piatto di vetro per topo e calda a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 . Nota: Altri raccolta e terreni di coltura che sono commercialmente disponibili (M2 e M16) sono inoltre comunemente usati. Attenzione: Si consiglia di rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice2 CO 5% uno alla volta per una durata limitata minimizzare l'esposizione all'aria ambiente durante le fasi di manipolazione.</li>
	<li>Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC.</li>
	<li>Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Individuare ogni corno uterino; le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Continuare a tenere l'ovidotto e con un altro set di una pinzetta rilasciare ovaia dalla bursa e posto in un piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS. Nota: Come nel passaggio 1, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO2. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO2 mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO2 . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti.</li>
	<li>Usando una siringa da 1 mL con un ago 27 gauge (o dimensioni simili), rilasciare complessi ovocita cumulo perforando manualmente i grandi follicoli antrali.</li>
	<li>Osservando attraverso un microscopio di dissezione, raccogliere i oocytes GV-organizzato utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5). Raccogliere solo gli ovociti che vengono rilasciati da follicoli antrali. Gli ovociti GV hanno un diametro di circa 90 µm. GV ovociti possono essere circondati da 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro totale di circa 200 µm.</li>
	<li>Cultura di ovociti in un vetro da orologio pulito o una piastra 9-pozzetti contenenti MEMα/BSA/FBS mezzo per 6 h raggiungere la metafase I a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .</li>
	<li>Procedere al passaggio 4.</li>
</ol>3. metafase II (MII) ovocita collezione
<ol><li>Per massimizzare gli ovociti isolati da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 IU di PMSG. Dopo 44 – 48 h, iniettare per via intraperitoneale con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG). Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare hCG, sciogliere una bottiglia di 10.000 U in 200 mL di PBS (5ml U/0.1). Conservare in varie porzioni monouso di 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Dopo 12-14 ore, preparare mezzo di raccolta MEMα/BSA/FBS, come descritto al punto 2.2, sopra.</li>
	<li>Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC.</li>
	<li>Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica, individuare ogni corno uterino. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Quindi rimuovere l'ovaia e l'ovidotto e porre nel piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS. Nota: Come nei passaggi 1 e 2, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO2. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO2 mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO2 . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 1 mL con un 27 G (o dimensioni simili) o sharp forcipe, strappare un buco nel ampulla di ovidotto per rilasciare gli ovociti MII. Nota: Fare attenzione a non danneggiare gli ovociti in ampulla. Ampulla apparirà gonfio e traslucido, tale che gli ovociti sono visibili (Figura 4).</li>
	<li>Raccogliere gli ovociti MII dal ampulla dell'ovidotto in un piatto nuovo con medium collezione facendo uso di una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5).</li>
	<li>Procedere al passaggio 4.</li>
</ol>4. ovocita denudamento e rimozione di Zona Pellucida
<ol><li>Preparare 300 IU/mL di ialuronidasi in medium MEMα completate con 3 mg/mL BSA a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo (2,5 mL/topo) in un vetro da orologio e mantenere a 37 ° C, 5% CO2. Nota: L'efficacia dell'ialuronidasi diminuisce acutamente dopo 1 h di preparazione. Per ovociti MII, ialuronidasi trattamento non è necessario.</li>
	<li>Esporre i complessi delle cellule ovocita-cumulo a 300 IU/mL di ialuronidasi in MEMα/BSA per 3 min a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo. Attenzione: Non superare 3 min di esposizione all'ialuronidasi, poiché potrebbe danneggiare gli ovociti.</li>
	<li>Per lavare gli ovociti, trasferimento ovociti in un fresco riscaldato piatto medio MEMα/BSA. Utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare (leggermente più grande rispetto al diametro dell'ovocita, che è circa 90 µm), pipettare i complessi su e giù per staccare completamente le cellule del cumulo. Consentire gli ovociti recuperare nell'incubatrice mentre si prepara per il prossimo passo.</li>
	<li>Soluzione di caldo acida Tyrode, MEMα/BSA e media di Waymouth a 37 ° C (500 µ l/topo). Posto 300 µ l in ogni pozzetto di lastre di vetro 9-Pozzo piccolo.</li>
	<li>Per rimuovere la zona pellucida (ZP) trasferire 5 – 10 ovociti in soluzione di Tyrode. Esporre gli ovociti per solo 30-45 s alla soluzione. Nota: Esposizione troppo poco alla soluzione non rimuoverà la ZP completamente, che impedirà gli ovociti da scoppio e cromosomi da spalmare. Troppa esposizione danneggiare e uccidere l'ovocita. Guardando la dissolvenza di ZP sotto il microscopio di dissezione può aiutare a ottimizzare il tempo di esposizione. Attenzione: Utilizzando la soluzione di Tyrode fresco è critica, come sua funzione diminuisce con l'età. Utilizzare un pozzo fresco della soluzione di Tyrode per ogni gruppo di ovociti trattati per assicurare uniforme digestione della ZP.</li>
	<li>Immediatamente dopo la rimozione di ZP, lavare gli ovociti trasferendo in medio MEMα/BSA/FBS riscaldato. Ripetere questo passaggio di lavaggio. Nota: Fare attenzione durante il trasferimento, come gli ovociti attaccherà facilmente insieme e la pipetta di vetro o capillare segue la rimozione della ZP. La pipetta di vetro o capillare in mezzo di Waymouth di prebagnatura ridurrà ovociti attaccare insieme.</li>
	<li>Trasferire e consentire gli ovociti recuperare per 30 minuti nel mezzo di Waymouth a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .</li>
	<li>Procedere al passaggio 5.</li>
</ol>5. MI e MII ovocita della cromatina si diffonde
<ol><li>Utilizzando una penna PAP, disegnare un rettangolo di2 11 x 44 mm su vetrino come mostrato in Figura 6A.</li>
	<li>Ricoprire il vetrino con un sottile strato di fissativo (1% paraformaldeide, 0,2% Triton-X100 in H2O, pH 9.2) di Pipettare 100 µ l di fissativo sulla diapositiva e dondolo avanti e indietro la diapositiva. Tocca la diapositiva per sbarazzarsi di fissativo in eccesso.</li>
	<li>Pick up tra 5-10 ovociti con un ago di pipetta piccola bocca con come mezzi piccoli come possibile e trascinare l'ago in una linea attraverso la diapositiva rivestite con fissativo mentre depositando gli ovociti da 1 cm sopra il vetrino nella soluzione fissante. Eseguire questo passaggio utilizzando un microscopio di dissezione per garantire che gli ovociti sono stati depositati e che essi hanno scoppiato. Nota: Gli ovociti dovrebbero scoppiare immediatamente sulla diapositiva. L'altezza alla quale gli ovociti vengono depositati impatto il grado di diffusione della cromatina. Vedere risultati rappresentativi nella Figura 6 per ulteriori dettagli.</li>
	<li>Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata chiusa durante la notte per consentire la cromatina di aderire.</li>
	<li>Lasciare i vetrini asciugare completamente e sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di 0,4% imbibente-H2O, pH 8.0.</li>
	<li>Procedere al passaggio 6.</li>
</ol>6. Immunolabelling
<ol><li>Preparare il tampone di diluizione di anticorpo (ADB) descritto nella tabella 1.</li>
	<li>Preparare due vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di lavaggio tampone (WB) (10% ADB diluito in PBS) e uno di Coplin contenente 50 mL di WB e 0,05% di soluzione detergente (ad esempio, aggiungere 250 µ l di 10% detergente 50ml WB).</li>
	<li>Lavare le diapositive che sono state preparate nella sezione 1 e 5 del presente protocollo per 10 min in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di WB. Attenzione: Non lasciate che le diapositive asciutto in qualsiasi punto durante il immunolabelling.</li>
	<li>Lavare i vetrini per 10 min nel Coplin jar contenente 50ml WB e 0,05% di soluzione detergente. Quindi, lavare i vetrini nel restante di Coplin contenente 50 mL di soluzione di WB per 10 min.</li>
	<li>Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi primari selezionati diluito in ADB. Incubare a 4 ° C durante la notte in una camera umida chiusa. Nota: L'incubazione può essere ridotto a 2-3 ore a 37 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es., 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 6,2 e 6,5.</li>
	<li>Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi secondari selezionati diluito in ADB. Incubare i vetrini 1 a 2 ore a 37 ° C in una camera umida chiusa.</li>
	<li>Lavare i vetrini 2 volte per 10 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Lavare i vetrini 2 volte per 5 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-H2O di 0,2%, pH 8.0.</li>
</ol>7. montaggio vetrini
<ol><li>Per profase della cromatina spread preparato nel passaggio 2, aggiungere 100 µ l di mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Per cromatina MI e MII si diffonde preparato nel passaggio 5, aggiungere 50 µ l di mezzo di montaggio contenente DAPI (1.5µg / mL). Asciugare delicatamente il liquido in eccesso assente.</li>
	<li>Porre un coprivetrino 22 x 60 mm sulla parte superiore e sigillare con smalto trasparente. Conservare in una scatola di diapositiva a 4 ° C o -20 ° C fino alla valutazione tramite microscopia a fluorescenza. Nota: Toccare leggermente il coprioggetto per sbarazzarsi di mezzo di montaggio in eccesso prima di sigillare con smalto.</li>
</ol>

<ol>
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P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Cromatina diffusione preparati permettono ai ricercatori di studiare cronologicamente femmina mammiferi meiosi e la localizzazione dinamica delle proteine coinvolte. Gli spread di cromatina embrionale e neonatale consentono analisi di eventi durante la profase meiotica. Metafase I e metafase II cromatina spread può essere utilizzato per distinguere single sorella cromatidi da accoppiato cromosomi omologhi appaiati e sorelle così come valutare ploidia. In confronto, il protocollo descritto qui può essere vantaggioso ri...

Durante la spermatogenesi, grandi onde semisincrona meiotiche delle cellule di germe sono rapidamente e continuamente rifornite nel testicolo all'inizio della pubertà e durante l'età adulta1. In contrasto con i maschi, meiosi nelle femmine sono avviato esclusivamente durante lo sviluppo fetale. Dopo la nascita, gli ovociti rimangono arrestati in una fase prolungata dictyate di Profase I con un'intatto della vescicola germinale (GV; involucro nucleare) fino alla pubertà. Al momento della comparsa della pubertà, un sottoinsieme degli ovociti vengono selezionati ciclicamente a subire la crescita e la maturazione, segnando l'inizio della ripresa meiotica. Meiotica ripresa negli ovociti adulti si manifesta con la scomparsa del GV in un processo noto come rottura della vescicola germinale (GVBD). L'ovocita subisce quindi condensazione cromosomica e segregazione, seguita da estrusione corpo polare. Ovociti diventano arrestati sulla progressione di MII e sono stimolati per completare la divisione meiotica seconda e definitiva solo dopo la fecondazione.
Fertilità femminile è altamente dipendente dal successo della Profase Meiotica I progressione. Chiave di questo è la formazione di un collegamento fisico tra cromosomi omologhi, conosciuto come i chiasme, che è mediata dalla riparazione dell'indotto del DNA doppio filo (DSBs) tramite crossover ricombinazione2. Questo processo si verifica nel contesto di un'impalcatura proteico dinamico conosciuto come il complesso Sinaptonemale (SC) che si forma tra cromosomi omologhi per facilitare loro synapsis3. Lo SC è una struttura tripartita della chiusura lampo-come costituito da due elementi laterali paralleli collegati da proteine regione centrale che tiene gli omologhi insieme durante la riparazione del DNA in corso. Prima sinapsi, precursori degli elementi laterali, chiamati elementi assiali, formano tra la sorella cromatidi. Complesso Sinaptonemale proteine quali SYCP2 e SYCP3 formano elementi assiali che colocalize agli assi sorella-cromatidio coesione durante la profase precoce. Successivamente i servire come siti per la proteina del filamento trasversale, SYCP1, che facilita il montaggio di elemento centrale e sinapsi tra omologhi allineati4di legame. Nei oocytes del mouse, synapsis completa è indicata dalla presenza di 20 completamente sovrapposti tratti SYCP3 e SYCP1, che possono essere visualizzati utilizzando cromatina diffondere preparazioni. Synapsis è completato con l'entrata in sotto il tavolino di pachitene, per cui maturo crossover che sono destinati a chiasmata forma tra omologhi sono decorate con mutL dimeri di omologo (MLH1/3) per promuovere la loro accurata lavorazione5,6 , 7. la manutenzione strutturale dei complessi di cromosomi (SMC), tra cui coesina, condensin e il SMC5/6 complessi, sono importanti per la regolazione della dinamica di cromosoma e struttura durante meiosi8,9, 10,11,12. Collettivamente, questi eventi garantiscono bi-orientamento corretto di cromosomi omologhi a opposte pali dell'alberino dopo smontaggio della SC.
Il ciclo cellulare meiotico è un potente modello per esaminare i ruoli delle varie proteine in manutenzione di genoma a causa dell'induzione programmata e la successiva riparazione di DNA DSBs. Inoltre, la meiosi dei mammiferi sono anche un modello rilevante per lo studio delle modificazioni epigenetiche e imprinting13. Tuttavia, è tecnicamente difficile valutare questi eventi durante la meiosi femminile, che si svolge nelle ovaie fetali e neonatali nei mammiferi (Figura 1). Profase I posso essere divisa in 5 sottostadi: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e dictyate. Qui, descriviamo come isolare e distinguere tra fetale e neonatale ovaie e testicoli (Figura 2). Adattato da metodi precedentemente descritti, questo manoscritto delinea anche un protocollo (fase 1) con video dimostrativo per la preparazione di Profase Meiotica femmina ho cromatina si diffonde14,15,16,17 . Quando accoppiato con immunolabelling, come descritto nei passaggi 6-7, questo protocollo consente analisi microscopica dettagliata della Profase I eventi negli ovociti.
Oogenesi sono soggetta a errori ed eventi malsegregazione cromosoma durante la prima divisione meiotica rappresentano la fonte più comune di malattia genetica nella progenie18,19. In questo manoscritto (punto 2 del protocollo), descriviamo un protocollo in cui gli ovociti maturi in scena GV sono estratti da innescato ovaie di topi femminili adulti. In condizioni favorevoli, ovociti adulti subiscono luteinizing ormone-indipendente ripresa della meiosi seguendo l'isolamento e la coltura20. In seguito ripresa meiotica, ovociti progredire attraverso meiosi I, quindi arrestano in metafase II. Gli ovociti rimangono arrestati in metafase II, a meno che non fertilizzato. Nei passaggi 2-5, ci adattiamo protocolli precedentemente segnalati con video dimostrativo per descrivere come raccogliere, cultura e preparare gli ovociti MI e MII per cromatina diffusa preparazioni21. Questa tecnica di diffusione di cromatina consente immunolabelling chiaro di proteine associate con i cromosomi. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato anche per distinguere tra cromosomi bivalenti e univalent e può ulteriormente risolvere single sorella cromatidi per facilitare la valutazione della ploidia degli ovociti. Pertanto, oltre a rivelare modelli di localizzazione delle proteine meiotiche, questo protocollo può anche servire come uno strumento prezioso per il delucidamento potenziali cause di malsegregazione cromosoma durante MI e MII.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting&amp;nbsp;scissors, sharp tip, 41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Watch glass square 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>50x Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent in manuscript</td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Wetting agent in manuscript</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Brand Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Mitutoyo micrometer head</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.45 &amp;mu;m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm pipette tip</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth&#039;s media</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>For oocyte culture media</td></tr><tr><td>500ml filter units 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Dilution factor- 1:1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Dilution factor- 1:50</td></tr><tr><td>Human anti-centromere protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Dilution factor- 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr></tbody></table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Tecniche di diffusione della cromatina sono stati ampiamente usati per valutare la localizzazione dinamica di varie proteine durante la gametogenesi, particolarmente per la spermatogenesi. Queste tecniche permettono per visualizzazione della proteina e modelli di localizzazione del DNA durante eventi meiotici quali cromosomi omologhi abbinamento, synapsis e riparazione del DNA. Mentre alcuni protocolli sono stati descritti nella letteratura, tecniche di diffusione generale della cromatina usando i oocytes profase mammiferi sono limitate e difficile dovuto i tempi di apertura di meiosi nelle ovaie fetali. In confronto, spermatociti profase possono essere raccolti da topi giovani maschi con rendimenti più alti senza l'esigenza di microdissection. Tuttavia, è difficile ottenere una popolazione pura sincronizzata delle cellule alle fasi specifiche a causa dell'eterogeneità delle popolazioni meiotica e post-meiotic delle cellule di germe nel testicolo giovanile e adulto. Per le successive fasi della meiosi, è vantaggioso per valutare gli ovociti che subiscono meiosi I (MI) o meiosi II (MII), perché gruppi di ovociti maturi possono essere raccolti da topi femminili adulti e stimolati per riprendere la meiosi nella cultura. Qui, metodi per le preparazioni di cromatina meiotica sviluppa usando i oocytes sezionato da fetale, neonatale e adulte ovaie sono descritti con dimostrazioni video di accompagnamento. Gli eventi di malsegregazione di cromosoma in mammiferi ovociti sono frequenti, specialmente durante MI. Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare e caratterizzare gli effetti di mutazioni differenti o esposizioni ambientali durante le varie fasi dell'oogenesi. Come ci sono chiare differenze tra oogenesi e spermatogenesi, le tecniche descritte all'interno hanno un valore inestimabile per aumentare la nostra comprensione dell'oogenesi dei mammiferi e il sessualmente dimorphic caratteristiche delle dinamiche del cromosoma e della proteina durante la meiosi .

Abbiamo descritto due tecniche per visualizzare e valutare i cromosomi meiotici negli ovociti. La prima tecnica è adatta per valutare la progressione della profase in ovaie embrionale e neonatale. Profase della cromatina diffusione preparazioni sono incredibilmente utili per la visualizzazione di numerosi processi dinamici durante la meiosi, tra cui cromosoma abbinamento, synapsis e desynapsis, ricombinazione omologa e rimodellamento epigenetico del cromosoma. Qui, abbiamo dimostrato l'u...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Preparazioni per la diffusione della cromatina per l'analisi della progressione degli ovociti di topo dalla profase alla metafase II | Genetica | Video

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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15.3K Views.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.

Video: Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetica

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologia

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...