Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica di Abigail Harris. Essi riconoscono anche Paula Cohen e Kim Holloway per aiutare ad ottimizzare il protocollo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse. Gli autori hanno anche apprezzano la lettura critica del manoscritto da Karen Schindler.
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM106262 a K.M.B.

Tutti i metodi che coinvolgono topi utilizzati alti standard etici e benessere e sono stati approvati dal comitato di uso al Drexel University College of Medicine e istituzionali Animal Care.
1. preparazione di soluzioni e strumenti necessari
<ol><li>Preparare il tampone di estrazione ipotonico (EB) in 50 mL di acqua ultrapura laboratorio grado, pH 8,2-8,4 (tabella 1). Rendono la soluzione fresco ogni volta, tenere sul ghiaccio ed utilizzare entro 2 h di preparazione spread; Ciò è necessario per ottimizzare la riduzione e la proteasi inibendo attività di DTT e PMSF, rispettivamente. Utilizzare 10 mL di EB per ogni coppia di testicoli del topo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di saccarosio di 100mm (fresco ogni volta) aggiungendo 0,342 g di saccarosio a 10 mL di laboratorio ultrapura acqua di grado. Aggiustare il pH a 8.2</li>
	<li>Preparare soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,15% Triton X-100, pH regolato a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1) mensile fresco e store è a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Diluire un 16% commercialmente PFA partenza stock disponibile al 4% in 1X PBS per uso come un magazzino di lavoro e quindi memorizzare 4% aliquote a-20 ° C.<ol>
<li>Per preparare la soluzione fissante, aggiungere 10 mL di soluzione al 4% PFA e 600 µ l di 10% Triton X-100 a 30 mL di 1X PBS, mescolare bene e regolare il pH a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1. Conservare la soluzione fissativa in una provetta conica da 50 mL avvolta nella carta stagnola a temperatura ambiente (per non più di 4 settimane).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzioni di lavaggio (mentre scivoli stanno asciugando gli ultimi 30 minuti) con 200 Photo-Flo: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 µ l di Photo-Flo 200 in 80 mL di 1X PBS) e 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µ l di Photo-Flo 200 in 40 mL di acqua ultrapura laboratorio). Utilizzare una finestra di Coplin 50 mL riempita con 40 mL di soluzioni per lavare i vetrini 10 o meno in un momento.</li>
	<li>Preparare i seguenti strumenti: 1 paio di forbici chirurgiche (di incidere la pelle), 1 paio di forbici chirurgiche punta fine (di incidere il peritoneo), 2 paia di pinze a punta dritto fine (per sezionare ogni testicolo), 1 lama di rasoio regolo (di incidere ogni testicolo), 2 paia di punta forcipe (per immobilizzare ogni testicolo e spremere i tubuli seminiferi) curvo, barattoli di Coplin 50ml, Teflon stampato 3 anello scivoli, 1 bisturi con lama taglia 11, camera umidificata, 100 x 15 mm piastre Petri, pennarello a punta fine o una matita e un shaker a piattaforma rotante.<ol>
<li>Premium posto uncharged vetrino smerigliato fine diapositive di vetro in posizione verticale in una vaschetta di Coplin 50 mL riempita con soluzione fissante fino all'utilizzo. Nota: La matita è comodo se diapositive verranno successivamente utilizzate nelle procedure che richiedono di etanolo, come l'ibridazione in situ di fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. i nuclei di spermatocita diffusione
<ol><li>Eutanasia di un topo maschio secondo le linee guida istituzionali (ad es., dislocazione cervicale con o senza CO2 asfissia).</li>
	<li>Utilizzare P10 - P20 maschi per valutare meiotiche celle nella prima ondata della spermatogenesi; Utilizziamo abitualmente P15 - P17 maschi per ottenere cellule da tutti i sottostadi della Profase I. adulti testicoli fornirà cellule da Profase I troppo, ma anche essi produrranno più postmeiotiche cellule, quali spermatidi.</li>
	<li>Raccolto e pesare i testicoli (registrare i pesi associati); quindi inserirli in una piastra Petri contenente poche gocce di freddo HEB per tenerli umidi.</li>
	<li>Tenere testicolo contro il fondo del piatto con una pinza a punta ricurva e utilizzare una lama di rasoio regolo per fare un'incisione del midline verticale piccolo attraverso la capsula del testicolo. Mentre ancora in mano il testicolo contro il fondo del piatto con un forcipe, utilizzare un secondo set di pinze punta ricurva o lama di rasoio regolo per spremere delicatamente i tubuli seminiferi dal testicolo.<ol>
<li>Inserire i tubuli in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di HEB freddo, avendo cura di evitare di mettere i pezzi della capsula nel tubo. Ripetere la procedura con il secondo testicolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare i tubuli seminiferi decapsulato nel tubo conico contenente HEB in ghiaccio per 30-60 min, a seconda delle dimensioni dei testicoli. Incubare i tubuli seminiferi da un paio di testicoli pesa 30 mg o meno per 30 min, tubuli da un paio di testicoli pesatura 31 a 50 mg per 30-45 minuti e testicoli più grandi per 60 minuti. Non alterare i tempi per un solo testicolo. Nota: Il tempo di incubazione ottimali può variare a seconda dell'esperienza di sperimentatore, i reagenti utilizzati e i topi analizzati.</li>
	<li>Mentre i tubuli seminiferous sono incubando in EB, è possibile utilizzare un pennarello o una matita per etichettare le estremità glassate di vetrino diapositive con mouse numero, data e numero della diapositiva. Quindi è possibile porre i vetrini pre-puliti in una vaschetta di Coplin contenente la soluzione fissante.</li>
	<li>A seguito di incubazione, versare tubuli ed EB in una capsula Petri pulita e tubuli separate in circa ciuffi di diametro di 3 mm. Ogni ciuffo produce 2 scivoli e il numero di diapositive ha reso dipende dalla dimensione dei testicoli. Nota: Possiamo ottenere 8 scivoli da wild-type e 6 diapositive da subfertile Chtf18-null testicoli P16 (che sono più piccoli a causa di numeri in diminuzione delle cellule di germe meiotica e mitotica8). Un testicolo adulto pesa 100 mg o più dovrebbe produrre 16 vetrini.</li>
	<li>Posto 23 µ l di soluzione di saccarosio di 100 mM in un anello di Teflon stampato, 3 anello scorrevole e aggiungere un ciuffo di tubuli seminiferi sul ring.  Quindi usando curve suggerimento pinze per tenere il ciuffo, delicatamente tritare i tubuli con una lama di rasoio taglia 11 fino a quando la soluzione diventa torbida. Nota: Non overmince come questo si tradurrà in cromosomi frammentati. Si noti che cromosomi frammentati potrebbero anche essere indicativi di un fenotipo mutante.</li>
	<li>Rimuovere i detriti, aggiungere un altro 23 µ l di soluzione di saccarosio e utilizzare una micropipetta delicatamente dispensazione la miscela su e giù un paio di volte per aiutare a separare le cellule in sospensione.</li>
	<li>Rimuovere un vetrino ammollo nel Vaso Coplin contenente soluzione fissante e inclinare la diapositiva sopra il vaso, in modo che una gocciolina generosa raccoglie nell'angolo inferiore della diapositiva.<ol>
<li>Pipettare 20 µ l di sospensione cellulare saccarosio dall'anello della diapositiva stampata 3 anello Teflon in fissativa gocciolina su un premio glassato di vetrino e dispensare la sospensione su e giù per 2 - 3 volte. Nota: La goccia fissativa deve essere abbastanza grande nel volume affinché aggiunta di 20 μL della sospensione delle cellule di saccarosio ad esso permette la copertura attraverso l'intera diapositiva quando la miscela è diffuso (Vedi 2.11 qui sotto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentamente inclinare la diapositiva al lato opposto la goccia per diffondere la sospensione cellulare lungo la lunghezza della diapositiva. Poi lentamente inclinare la diapositiva torna a diffondere la sospensione cellulare lungo la larghezza della diapositiva per coprirlo completamente. Evitare di diffondere la sospensione sulla stessa area della diapositiva più di una volta altrimenti che le celle si sovrappongono tra loro.</li>
	<li>Immediatamente porre il vetrino in una camera umidificata e ripetere i passaggi da 2.8 a 2.11 fino a quando tutti i grumi di tubuli seminiferi sono stati utilizzati per rendere diapositive. È importante non spostare la camera umidificata durante il processo di essiccazione per evitare lo strappo e la sovrapposizione di cellule.</li>
	<li>Lasciare i vetrini Incubare in una camera umidificata coperta a temperatura ambiente per 2,5 h in modo che si asciugano lentamente e non completamente. Umidità elevata e lenta essiccazione in questo passaggio sono importanti per garantire un'adeguata diffusione della cromatina. Quindi rimuovere il coperchio dell'alloggiamento e vetrini asciugare completamente altri 30 min.</li>
	<li>Mettere i vetrini (retro o in un modello di zigzag) in una vaschetta di Coplin contenente 0,4% di soluzione di Photo-Flo 200/1 X PBS e lavare i vetrini due volte, 5 minuti ciascuno, agitando delicatamente la Coplin jar su una piattaforma rotante shaker. Utilizzare la soluzione fresca per ogni lavaggio e mantenere diapositive da diversi topi in vasi separati per ciascuno dei lavaggi.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenenti 0,4% Photo-Flo 200/dH2O soluzione per 5 min una volta durante l'agitazione.</li>
	<li>Rimuovere diapositive dal Coplin jar (ultimo lavaggio), accuratamente pulire i bordi e le parti inferiori delle diapositive per eliminare il liquido in eccesso e mettere i vetrini in una posizione angolata, quasi-montante ad asciugare. Uno sperimentatore che è abile in questa tecnica può elaborare e preparare i nuclei superficie-diffusione dai topi di 4 o 5 in un giorno.</li>
	<li>Una volta asciutto (15-20 min), processo diapositive immediatamente per immunofluorescenza o conservare a-80 ° C in una scatola di diapositive ben chiuso al riparo dalla luce per un massimo di 3 settimane (a seconda delle proteine bersaglio valutandi; risultati ottimali possono essere ottenuti se macchiato lo stesso giorno o entro 2 settimane).<ol>
<li>Se conservati a-80 ° C, quindi lasciare vetrini a temperatura ambiente e lavare in una vaschetta di Coplin contenente 1 X PBS o blocco per 5 min prima della colorazione. Nota: Molti protocolli di colorazione di immunofluorescenza diversi fornirà buoni risultati; per un protocollo di immunostaining8, fare riferimento a Berkowitz et al.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per ottenere un numero elevato di nuclei spermatocita ben diffusa, di buona qualità, le fasi più critiche del presente protocollo includono il tempo di incubazione appropriato dei tubuli seminiferi in EB, appropriata macinazione dei tubuli seminiferi, e la tecnica impiegata per si sono diffuse la sospensione cellulare di saccarosio attraverso le diapositive rivestite con fissativa. Noi incubare tubuli seminiferi dai testicoli dei maschi di tipo selvaggio che vanno da postnatale giorno 15 all'età adulta in EB per 45 mi...

Topi sono utilizzati estesamente come organismo modello per lo studio di meiosi nei mammiferi. Possono essere valutati sia i normali processi di sviluppo e difetti che si verificano durante la meiosi. La linea temporale e la progressione delle caratteristiche salienti che si verificano durante la profase I e sottostadi, come pure una moltitudine di specifiche proteine coinvolte in processi cruciali per la regolazione della meiosi può essere caratterizzati in wild type e topi mutanti. Diversi processi specializzati che si verificano durante la meiosi che ho posso essere studiato in dettaglio (rivisto in Handel e Schimenti1). Questi includono la formazione di rotture a doppio filamento (DSB) del DNA e riparazione, ricombinazione, la formazione di Complesso Sinaptonemale e segregazione del cromosoma.
Un aspetto importante di studiare processi meiotici è la capacità di esaminare i nuclei contenenti cromosomi omologhi sono risolti, visivamente e otticamente, per meglio distinguono e identificano i sottostadi della profase I. profase è composto da 5 sottostadi che sono caratterizzati da specifiche caratteristiche tra cui la formazione del complesso synaptonemal (SC). Lo SC è un'impalcatura di proteina tripartita che consente l'accoppiamento e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA degli omologhi. Durante leptonema, omologhi allineare come gli elementi assiali di SC sono fissati. Quindi allegato di elementi centrali del complesso synaptonemal durante zygonema facilita la connessione fisica e accoppiamento (sinapsi) tra coppie di omologhi di. Durante pachynema, sinapsi degli omologhi diventa completo e crossover di DNA sono formate dalla riparazione di una popolazione di seleziona delle rotture del doppio filamento di DNA tramite ricombinazione omologa. La SC Disassembla durante diplonema, permettendo per omologhi di desynapse ma rimangono attaccati ai loro centromeri ed ai luoghi dei crossover di DNA. Infine durante diacinesi, omologhi ricondenseranno e si verifica la transizione alla metafase1.
Storicamente, superficie-diffusione della cromatina meiotica ha reso alcuni nuclei, particolarmente quelle dalle prime fasi della Profase I2. Di conseguenza, questi metodi sono stati modificati per migliorare la separazione delle cellule dai tessuti (cioè testicolo o dell'ovaio), la tecnica di diffusione della cromatina meiotica e la resa dei nuclei meiotic di alta qualità per valutazione2,3, 4. Inoltre, questo metodo si è rivelato utile nel preservare nucleare e cromatina associata proteine nei nuclei meiotici, come dimostrato da immunolocalizzazione pubblicati tecniche5,6,7. Di conseguenza, il metodo inizialmente descritto da Peters2 e dimostrato qui rese molti nuclei di spermatocita scoppio separata contenente gli omologhi che subiscono i sottostadi leptotene, zigotene, pachitene, diplotene e diacinesi della Profase I.
La tecnica della preparazione di superficie-diffusione nuclei (chiamati anche analisi di diffusione della cromatina) è ampiamente usata per lo studio di meiosi nei campi della biologia riproduttiva e cella. Diapositive che contengono i nuclei superficie-diffusione possono essere successivamente immunostained con gli anticorpi alle proteine di interesse o sottoposti a macchiatura d'argento e poi analizzati con microscopia. Il metodo è simile per i topi maschi e femminili, anche se le modifiche sono state descritte per topi femmina2. È fondamentale non overmince tubuli seminiferi. I nuclei devono anche essere ben distribuiti affinché seguendo immunostaining omologhi e proteine associate sono chiaramente visibili con la microscopia. Superficie-diffusione nuclei possono essere preparati in poche ore ed entrambi immunostained immediatamente o conservati a-80 ° C per un massimo di 3 settimane prima di scongelamento e immunostaining. Tuttavia, risultati ottimali si ottengono migliori per alcune proteine se immunostaining viene eseguita immediatamente o entro 2 settimane di preparazione di superficie-diffusione nuclei. I vetrini possono essere immunostained con un protocollo standard usando gli anticorpi alle proteine di interesse, seguita da incubazione con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescente proteine o coloranti, allora imaged con microscopia di fluorescenza8. Al giorno postnatale 15-21 c'è tessuto sufficiente per ogni coppia di tipo selvaggio testicoli per produrre 6-10 diapositive e più vecchi topi (compresi gli adulti) produrrà più diapositive. Tuttavia, topi wild type 6 settimane di età ed oltre anche resa più post-meiotiche cellule (cioè spermatidi) sui vetrini seguendo immunostaining. Inoltre, tutti i sottostadi della profase io posso essere osservato in topi giovanili e adulti. Testicoli da maschi a giorni postnatali 10 a 15 produrrà molti più cellule leptotene e zigotene. Topi oltre postnatale giorno 14 a 15 anni di età produrrà più nuclei di pachitene e diplotene.
Qui descriviamo e dimostrare un metodo ampiamente usato della preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Meiosi nei mammiferi sono un processo di sviluppo dinamico che si verifica nelle cellule germinali e possa essere studiato e caratterizzato. Utilizzando un metodo per diffondere i nuclei sulla superficie delle diapositive (piuttosto che farli cadere da un'altezza), dimostriamo una tecnica ottimizzata su spermatociti del mouse che è stato descritto nel 1997. Questo metodo è ampiamente usato nei laboratori per lo studio dei mammiferi meiosi perché produce una pletora di nuclei di alta qualità in fase di sottostadi della profase I. seminiferi tubuli si inserisce in una soluzione ipotonica a gonfiarsi spermatociti. Poi spermatociti vengono rilasciati in una soluzione di saccarosio per creare una sospensione cellulare e i nuclei sono sparsi su vetrini imbevuta di fissativo. A seguito di immunostaining, può essere esaminata una diversità delle proteine attinente a processi meiotici. Ad esempio, proteine del complesso synaptonemal, una struttura tripartita che collega i cromosoma assi e nuclei degli omologhi insieme possono essere facilmente visualizzate. Proteine di ricombinazione meiotic, che sono coinvolti nella riparazione di rotture a doppio filamento del DNA tramite la ricombinazione omologa, possono anche essere immunostained per valutare la progressione della Profase I. Qui descriviamo e dimostrare dettagliatamente una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio dei mammiferi meiosi in spermatociti da topo maschio giovanile o adulta.

La capacità di questo metodo per fornire un numero elevato di superficie sviluppa nuclei che contengono gli omologhi intatti dipende da tre fattori principali: 1) tempo di incubazione appropriato di tubuli seminiferi in buffer ipotonico (cioè EB) per ottenere adeguatamente si gonfiò spermatocita i nuclei che scoppiano ma non si disintegrano da prolungata incubazione in EB, 2) micropipetting le goccioline di saccarosio di cellule per ottenere una sospensione separata dei nuclei che non ...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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Video: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

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Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.