Questo metodo può aiutare ad affrontare importanti domande in campo cardiovascolare sull'impatto che la matrice extracellulare ha durante diverse fasi fisiologiche e di sviluppo del cuore. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi comparativa tra matrici extracellulari fetali e adulte applicando un metodo di decellularizzazione simile a entrambi i tipi di tessuto. Quindi questo metodo è stato applicato con successo ad altri organi come le resezioni chirurgiche dei pazienti oncologici che facilitano lo studio della matrice extracellulare in diversi contesti.
Inizia risciacquando brevemente il cuore fetale e adulto del topo con PBS ghiacciato. Quindi posizionare i tessuti sotto un microscopio sezionante e utilizzare piccole forbici dritte per rimuovere gli atri, il ventricolo destro e il setto dai cuori adulti del topo. Trasferire il ventricolo sinistro in una nuova piastra di Petri e dividere la parete libera del ventricolo sinistro in strisce longitudinali spesse due millimetri.
L'uso di espianto ventricolo sinistro del topo adulto di dimensioni omogenee è essenziale per una costante efficienza di decellularizzazione. Utilizzare il bisturi e le pinzette seghettate con punta curva per rimuovere il muscolo papillare prima di utilizzare una griglia di due per due millimetri per tritare ulteriormente le strisce in frammenti di tessuto più piccoli. Quando tutto il tessuto è stato tritato, sciacquare brevemente i pezzi con abbastanza PBS per coprire le espianto.
E trasferire i cuori fetali e i pezzi di tessuto cardiaco adulto in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenenti 250 microlitri di temperatura di taglio ottimale o composto OCT per tubo. Quindi, congelare i campioni di tessuto cardiaco in isopentane raffreddato a ghiaccio secco per la conservazione a -80 gradi Celsius. Per decellularizzare i tessuti crio-conservati posizionare i campioni congelati in una piastra di Petri contenente abbastanza PBS da coprire completamente le espianto.
Dopo che l'OCT si è sciolto, immergere i campioni in una nuova piastra di Petri di PBS e lavare i campioni tre volte su uno shaker per 10-15 minuti a 60 giri/min per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di tampone ipotonico funzionante a ciascun pozzo di una piastra sterile di coltura tissutale a 24 pozzetto e utilizzare forcelle fini per trasferire un frammento ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 18 ore, a 165 giri/min seguita da tre lavaggi di un'ora in un millilitro di PBS per pozzo, per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di solfato di dodecile di sodio appena preparato o soluzione di SDS ad ogni pozzo per un'incubazione 24 ore su 24 a 25 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare i campioni con tre lavaggi di 20 minuti in un millilitro di tampone di lavaggio ipotonico per lavaggio seguito dall'aggiunta di un millilitro di soluzione di trattamento della DNasi a ciascun pozzo per un'incubazione di tre ore, a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, i campioni decellularizzati dovrebbero perdere la loro consistenza simile alla gelatina.
Quindi lavare i frammenti di tessuto tre volte con un millilitro di PBS per 20 minuti per lavaggio seguito da un lavaggio notturno in un millilitro di PBS fresco per pozzo a temperatura ambiente e 60 giri/min. Per valutare la rimozione dei resti cellulari dal tessuto decellularizzato, la mattina successiva fissare i campioni in un millilitro di tampone neutro del 10% preparato al momento integrato con lo 0,03% di eosina acquosa per pozzo per 2,5-3 ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni in un millilitro di PBS per pozzo.
E utilizzare uno stampo monouso in vinile per incapsulare i frammenti decellularizzati nel gel di lavorazione istologico secondo le specifiche del produttore. Successivamente, trasferire i frammenti incapsulati in una cassetta di incorporamento per l'elaborazione della biopsia. Ed elaborare i campioni per l'incorporamento di paraffina attraverso successive incubazioni di 30 minuti in concentrazioni ascendenti di etanolo, soluzione di idrocarburi alifatici isoparaffinici e due paraffina Celsius di 56 gradi.
Dopo l'emergente della seconda paraffina, montare i campioni in un blocco di paraffina e utilizzare un microtomo per ottenere sezioni spesse tre micrometri. Quindi verificare l'efficienza di decellularizzazione macchiando le sezioni con ematossilina ed eosina e le macchie tricromache di Masson secondo protocolli standard. Dopo il lavaggio PBS durante la notte con scuotimento, aggiungere 500 microlitri di DPBS appena preparati, integratori con 2,5 microgrammi per millilitro di soluzione antibiotica ampotericina B 1% ad ogni impalcatura.
E conservare i campioni da uno a sette giorni a quattro gradi Celsius. Prima di ospitare le cellule, sostituire la soluzione DPBS con 500 microlitri di mezzo basale cellulare integrati con antibiotici. E incubare le impalcature per un'ora a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, utilizzare un microscopio per aggiungere una goccia di quattro microliter di DPBS al centro di un pozzo di una piastra da 96 pozzetto per impalcatura. E usa una sottile pinzetta dritta per trasferire un'impalcatura decellularizzata nella parte superiore di ogni goccia. Rimuovere eventuali DPBS aggiuntivi per aspirazione e verificare che l'impalcatura non sia piegata o rugosa.
Quando le impalcature si sono asciugate ai bordi, seduti lentamente una sospensione a cella singola delle celle di interesse sulla parte superiore di ogni impalcatura. I tessuti decellularizzati del giorno embrionale 18 sono caratterizzati da una struttura altamente traslucida mentre le espianto adulte mostrano un aspetto traslucido e bianco. Le macchie di ematossilina ed eosina e tricomio di Masson confermano un'efficiente rimozione cellulare dalla presenza di rete porosa.
Il materiale nucleare viene ridotto di circa il 99,8% dopo la decellularizzazione, rispetto ai tessuti non manipolati, che è essenziale per evitare di innescare una risposta infiammatoria indesiderata al momento dell'impianto. La vitalità cellulare all'interno di ponteggi seduti può essere monitorata durante la coltura in vitro mediante colorazione calceina. L'analisi terminale del ripopolamento e della distribuzione cellulare tra le impalcature, può anche essere eseguita dopo l'elaborazione della paraffina come osservato in queste immagini rappresentative di una sezione centrale del bioscaffold.
Quindi questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nell'esplorazione delle proprietà bioattive della matrice extracellulare dal cuore fetale e adulto del topo ma anche di altri tessuti.
