A nostra conoscenza, questo protocollo è il primo a produrre matrici decellularizzate dal muscolo scheletrico fetale, fornendo un nuovo approccio per studiare le miopatie che iniziano a svilupparsi in utero. Questo protocollo genera una metrica specifica dello sviluppo e del tessuto che può essere utilizzata per studiare il comportamento delle cellule muscolari e le interazioni con la matrice extracellulare in un ambiente controllato. LAMA2-CMD è una distrofia muscolare congenita che inizia a manifestarsi alla nascita.
Questo modello può aiutare a svelare i meccanismi del modello coinvolti nella sua insorgenza e portare a nuove terapie target. Questo protocollo può essere adattato a diversi tessuti e modelli di malattia. È possibile ottenere diversi livelli di complessità a seconda dei tipi di matrice e cella, dimostrando la versatilità del sistema.
Questo è un protocollo molto semplice. La parte più impegnativa è la raccolta e la gestione dei campioni. Ma, con la pratica, le abilità tecniche possono essere facilmente migliorate.
Inizia trasferendo un feto eutanasia alla volta in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato. Dopo aver asportato la pelle e gli arti, tagliare il lato ventrale della gabbia toracica. Rimuovere lo sterno e gli organi sottostanti.
Posizionare i feti con il lato dorsale verso l'alto e rimuovere la porzione cervicale della colonna vertebrale. Successivamente, asportare i depositi di grasso dorsale e il tessuto connettivo muscolare profondo della schiena. Ora, ancorare la gabbia toracica usando una pinza chirurgica.
Con un microbisturi, raschiare accuratamente per staccare i muscoli profondi della schiena dal tessuto circostante. Conservare i tessuti in PBS in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Per un periodo più lungo, conservare il tessuto in una provetta vuota di microcentrifuga a meno 80 gradi Celsius.
Il primo giorno, utilizzare intere masse muscolari epaxiali. Aggiungere tre millilitri di tampone ipotonico contenente 1% penicillina e streptomicina a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere un frammento di tessuto muscolare a ciascun pozzetto e incubare durante la notte per 18 ore con agitazione.
Il secondo giorno, rimuovere il buffer con una pipetta a punta fine. Ora lavare i campioni tre volte con tre millilitri di PBS con un'agitazione di un'ora ogni volta. Dopo aver scartato il PBS, incubare i campioni in tre millilitri di soluzione detergente SDS allo 0,05% per 24 ore agitando.
Il terzo giorno, utilizzare una pipetta a punta fine per rimuovere il detergente SDS e lavare i frammenti tre volte con tre millilitri di tampone di lavaggio ipotonico con un'agitazione di 20 minuti ogni volta. Sostituire la soluzione dei pozzetti con due millilitri di soluzione di DNasi e incubare i frammenti di tessuto a 37 gradi Celsius per tre ore con agitazione. Dopo aver rimosso la soluzione di DNasi, lavare i frammenti tre volte con tre millilitri di PBS con un'agitazione di 20 minuti ogni volta, lasciando l'ultimo lavaggio durante la notte.
A un pallone T-25 seminato con cellule C2C12 subconfluenti, aggiungere 500 microlitri di tripsina e risospendere in un millilitro di mezzo completo. Mescolare 10 microlitri della sospensione con 10 microlitri di colorante blu tripano e caricare in un emocitometro per contare il numero di cellule e stimare la vitalità. In una cappa a flusso laminare, posizionare le matrici decellularizzate, o dECM, in una capsula di Petri contenente PBS con penicillina all'1% e streptomicina.
Utilizzando un bisturi e una pinzetta, separare le matrici in piccoli pezzi. Trasferire i frammenti nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti, posizionando da tre a quattro pezzi per pozzetto. Aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura completo preriscaldato in ciascun pozzetto e incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Scartare il terreno nella piastra del pozzetto e aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura completo contenente 50.000 cellule vitali di C2C12 a ciascun pozzetto. Incubare la piastra del pozzo per due giorni. Trasferire i dECM con le cellule in una piastra da 48 pozzetti contenente 400 microlitri di terreno di coltura completo.
Aspirare accuratamente il terreno ogni due giorni per evitare il distacco della matrice e ricostituire con il terreno fresco fino all'ottavo giorno. Per la differenziazione, sostituire il terreno di coltura completo con un terreno di differenziazione e incubare per quattro giorni fino al 12 ° giorno. Il tessuto muscolare era rossastro immediatamente dopo l'isolamento e diventava bianco a causa della lisi cellulare dopo l'incubazione in tampone ipotonico.
SDS fa sì che i muscoli diventino trasparenti. Dopo il trattamento con DNasi, è stato ottenuto un dECM più piccolo e trasparente. La quantificazione del DNA rivela una diminuzione di quasi il 100% dei dECM rispetto al tessuto nativo.
I dECM e il tessuto nativo hanno mostrato una colorazione tubulare simile per la laminina alfa due e la proteina laminina. L'analisi Western blot del tessuto nativo ha mostrato due bande per la subunità laminina alfa due, mentre tre bande più piccole sono state rilevate nella dECM. Per le laminine totali, i campioni di dECM hanno mostrato frammentazione proteica rispetto al tessuto nativo.
La fibronectina e il collagene I erano presenti nello spazio interstiziale tra le cellule del tessuto nativo e i dECM. Bande di fibronectina simili erano presenti in entrambi i campioni, indicando che non è influenzato dalla decellularizzazione. Meno bande di collagene I sono state osservate nei dECM.
Per il collagene IV, entrambi i campioni hanno mostrato una colorazione tubolare simile. Tuttavia, il peso molecolare delle bande dECM era inferiore. Le cellule C2C12 colonizzarono e proliferarono nei dECM e fuse in miotubi multinucleati.
Questi hanno espresso proteine a catena pesante della miosina dopo quattro giorni di incubazione nel mezzo di differenziazione. La colorazione intracellulare e pericellulare è stata osservata per la catena alfa due della laminina, le laminine totali e la fibronectina. Gli scaffold scheletrici fetali di topo decellularizzati possono essere utilizzati per far crescere cellule in sistemi di co-coltura, avvicinandoli alla situazione in vivo e contribuendo quindi alla comprensione delle malattie muscolari.
