Nella biomassa lignocellulosica l'attività degli enzimi che analizzano i polisaccaridi è limitata dall'esistenza di interazioni non specifiche con la lignina. L'analisi FRET è un approccio rilevante per l'evoluzione su scala nanometrica. Ottenere tutte le sezioni dopo può essere una sfida a seconda della biomassa.
Prenditi il tuo tempo facendo il sessatura con il microtomo ed esegui lavaggi delicati. La raccolta delle misurazioni fluorescenti della durata e dello spettro consente una determinazione quantitativa sensibile e inequivocabile del FRET tra molecole di lignina e TAG in situ. Questo metodo utilizza l'uso di tecniche difficili, come il sezionamento di campioni sull'acquisizione e l'analisi di microscopie multidimensionali che possono essere facili da imparare con una dimostrazione visiva.
Per preparare campioni vegetali da legno, grano, fibre o frammenti utilizzare lamette da barba per tagliare campioni lunghi un centimetro senza danneggiare la struttura del materiale e posizionare i campioni sotto vuoto per rimuovere qualsiasi aria. Immergere i campioni per 24 ore in concentrazioni successive del 30% e del 50% di PEG diluito in acqua a temperatura ambiente con agitazione delicata. Seguito da 24 ore immerso in una concentrazione del 100% di PEG a 70 gradi Celsius.
Dopo l'immersione PEG al 100%, posizionare i campioni in capsule su una piastra calda di 70 gradi celsius e diminuire progressivamente la temperatura della piastra in cinque gradi celsius fino a quando la piastra raggiunge la temperatura ambiente. Una volta raffreddati i campioni, utilizzare un microtomo e lame monouso per ottenere con cura sezioni piatte spesse da 30 a 60 micrometri da ciascun blocco PEG. Rimuovere il PEG dalle sezioni con tre lavaggi d'acqua delicati di cinque minuti.
Dopo l'ultimo lavaggio, incubare fino a tre sezioni per tubo con 500 microlitri di sonda fluorescente preparata al momento per 72 ore protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione di colorazione, utilizzare un pennello per trasferire le sezioni su uno scivolo prima di montare le sezioni tra uno scivolo di vetro e uno scivolo di copertura numero 1.5H. Per determinare la larghezza della finestra spettrale del rivelatore sFLIM, posizionare i cristalli di urea in una scatola di coltura con un fondo di vetro da 0,17 micrometri e posizionare la scatola su un portacampioni al microscopio.
Seleziona l'obiettivo 20X e un laser a zaffiro drogato in titanio con una lunghezza d'onda di 900 nanometri e una potenza del 2% e accendi la scansione. Per eseguire misurazioni sFLIM, passare alla modalità sFLIM. Per raccogliere il secondo segnale armonico sul rivelatore sFLIM, regolare gradualmente la lunghezza d'onda dell'eccitazione laser da 900 a 980 nanometri fino a quando il secondo segnale armonico non viene raccolto nel secondo canale spettrale.
Quindi determinare la lunghezza della finestra spettrale. Passare alla modalità digitalizzata non D per inviare fotoni fluorescenti al rilevatore SFLIM. Impostare l'acquisizione sFLIM sulla modalità abilita per consentire il conteggio dei fotoni sul contatore del singolo fotone.
Quando lo strumento è pronto, posizionare una sola sezione vegetale di paglia di grano nativa di controllo tra lo scivolo e lo scivolo di copertura sullo stadio del microscopio e impostare il sistema sulla modalità continua per consentire la scansione laser. Impostare una raccolta di 30 secondi e verificare che il discriminatore di frazione costante sia compreso tra uno per 10 e il quarto e uno per 10 al sesto. Quindi selezionare l'area di misurazione nel campione e fare clic su Avvia.
Al termine della misurazione, salvare il file sdt e ripetere la misurazione per almeno altri nove campioni. Occorre trovare un equilibrio tra il raggiungimento di un numero sufficiente di fotoni raccolti per il fotone evitando l'acquisto di impulsi e gli effetti indotti dalla foto che possono alterare la durata della florescence. In alto analizzare i dati sFLIM acquisiti, importare i soli file di dati di paglia di grano nativo nel software del contatore di fotoni singolo e aprire Opzione e modalità per selezionare Multi Exponential 12,5 nanosecondi incompleto.
In Opzioni e preferenze selezionare Calcola automaticamente risposta strumentale e selezionare il modello adattamento esponenziale. Per ogni canale, applicate il modello di raccordo e salvate i parametri di adattamento in un foglio di calcolo. Per un confronto tra i canali e gli esperimenti calcolare la durata della fluorescenza principale in un foglio di calcolo.
Per calcolare la durata media per almeno 10 campioni in tutti i canali, analizzare la durata fluorescente principale sui canali donatori per determinare il valore del canale dedicato che ha scelto il numero di fotone più alto e corrisponde all'emissione massima di lignina. Per confrontare i valori sFLIM ed EFRET tra il campione di paglia di grano autoctono di controllo e un campione sperimentale, considerare un EFRET positivo associato a una diminuzione omogenea della durata tra il controllo e i campioni sperimentali da analizzare come evento FRET. In questo esperimento rappresentativo, le curve sFLIM mostrano alcune delle modifiche che possono essere ottenute tra il campione di riferimento e i due casi di interazione.
In effetti, l'aumento della fluorescenza nelle regioni spettrali corrispondente all'intervallo di emissione di rodiammina è facilmente visualizzabile. Un'attenta osservazione delle tre curve di decadimento del fotone del primo canale, rivela anche una più forte flessione per la paglia di grano autoctono con destrina taggata con Rhodamine, che per la paglia di grano autoctona incubata con PEG taggato con Rhodamine. Dopo aver sistemato le curve di decadimento del fotone e aver calcolato la durata della fluorescenza principale di ogni canale, la firma FRET diventa più ovvia.
Ad esempio, mentre il tempo di vita della fluorescenza aumenta e diminuisce alternativamente lungo lo spettro di fluorescenza per il campione di paglia di grano nativo, si osserva una chiara firma FRET sia per le sezioni di paglia di grano autoctone incubate con PEG taggato con rhodamina e paglia di grano autoctono con destrina taggata con campioni di rodiammina. Nel contesto dell'idrolisi della biomassa lignocellulosica, questo metodo può essere facilmente trasferito a studi di interazione enzimatica in vari campioni di biomassa che richiedono una caratterizzazione rigorosa di ogni nuova biomassa. Poiché lo sFLIM non richiede la fissazione del campione, apre la strada a studi dinamici sull'interazione enzimatica lignina ed è probabile che guidi strategie di ingegneria enzimatica e pre-trattamenti della biomassa.
Come la maggior parte del tempo, le misurazioni del tempo di vita richiedono l'uso di sorgenti laser a infrarossi a impulsi. Le precauzioni di sicurezza appropriate devono essere prese di conseguenza.
