Questo lavoro è stato supportato da Humboldt Universität zu Berlin, il Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlino, il centro tedesco per Malattie Neurodegenerative (DZNE), il Ministero federale tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e Gottfried Wilhelm Leibniz premio del DFG. Ringraziamo Shimpei Ishiyama per la progettazione grafica eccellente e Juliane Diederichs per l'eccellente assistenza tecnica.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida tedesche sul benessere degli animali sotto la supervisione dei comitati etici locali (LaGeSo). Umano e pipistrello cervello dati sono stati derivati da Naumann et al. 5 la procedura riportata di seguito viene eseguita su un ratto adulto maschio di Wistar (ceppo: RJHan:WI).
1. aspersione ed estrazione del cervello
Nota: Al fine di ottenere un cervello omogeneamente fisso e privo di sangue, perfusione perfusione dell'animale è fortemente incoraggiata, come residui di sangue aumenta il segnale di fondo non specifico durante la colorazione. Tuttavia, è anche possibile ottenere sezioni appiattite dall'ONU-irrorato esemplare e li macchia. La facilità di movimentazione del campione varia con la concentrazione di fissativo utilizzato. Troppo poco fissazione aumenta il rischio di gestione danni al cervello durante la spianatura e taglio, mentre troppo alte concentrazioni abbassare la flessibilità per l'appiattimento e la qualità del segnale colorazione.
<ol><li>Via irrorare l'animale, utilizzando un ago di 23G. Per una guida più dettagliata, vedere Gage et al. 9<ol>
<li>Utilizzare fosfato tampone salino10 (PBS; 0,02 M; pH 7.4) per scovare il sangue dal cervello e il corpo dell'animale. Continuare fino a quando il liquido di infusione appare chiaro, con almeno 150 mL di PBS viene infusa attraverso il sistema vascolare. Nota: I risultati migliori si ottengono ad una pressione simile all'intervallo della pressione sanguigna fisiologica dell'animale viene irrorato (ad es., ratto: 120-130 mmHg). Facoltativamente, aggiungere alla soluzione per evitare la coagulazione di sangue11eparina (10 U/mL).</li>
		<li>Per correggere il cervello, via infondere un minimo di 100 mL paraformaldeide12 (PFA, 4%; in fosfato 0,1 M di tampone (PB)13) fino a quando il collo dell'animale è rigido. Attenzione: PFA è un potenziale cancerogeno. Nota: Migliori risultati istochimici attività colorazione, ad esempio per la citocromo ossidasi, si ottengono, quando si utilizza 2% PFA. Per altro la macchiatura, come immunohistochemistry, 4% PFA è preferito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre il cervello dal cranio. Nota: Vedere Gage et al. 9 per i dettagli.<ol>
<li>Isolare la testa con le grandi forbici o cesoie dell'osso.</li>
		<li>Utilizzando le forbici bene, tagliare la pelle lungo la linea mediana dal collo al naso. Tirare la pelle per esporre il cranio. Rimuovere il collo e dei muscoli temporali utilizzando forbici bene.</li>
		<li>Rendere un midline tagliare attraverso l'osso interparietale a partire dal magnum di orifizio fino all'osso parietale.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare l'osso interparietale. Far scorrere bene forbici lungo la sutura sagittale e tagliare dalla parte posteriore del parietale all'estremità anteriore delle ossa frontali.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare parietali e ossa frontali. In alternativa, sollevare le ossa distanza usando il forcipe. Utilizzare un cucchiaio per tagliare le corde del nervo ventrale e rimuovere il cervello. Trasferire il cervello al PB (0,1 M; pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Difficoltà cervelli ONU-irrorati mediante immersione in 4% PFA per 1-3 h a 4 ° C (a seconda delle dimensioni del cervello e la sonda: toporagno: ~ 1h, umani: ~ 3 h). Nota: Per grandi e girencefalici cervelli come gli esseri umani, isolare e tagliare fuori la zona di interesse per ridurre i tempi di fissazione.</li>
	<li>Per ottenere più grandi aree corticali in una sezione, appiattire il cervello prima della post-fissazione ulteriore; procedere al passaggio 2. Tuttavia, per ottenere sezioni di più difficile da raggiungere aree come la corteccia di entorhinal mediale, post-fissare il cervello nel 4% PFA per 24 h prima di procedere al passaggio 2.</li>
</ol>2. dissezione e appiattimento del cervello
<ol><li>Separare gli emisferi del cervello utilizzando una lama di rasoio (lissencephalic cervelli) o bisturi (girencefalici cervelli). Nota: Se il cervello post-non è stato risolto, è suscettibile ai danni di movimentazione.</li>
	<li>Passaggio facoltativo per favoreggiamento stima di registrazione ed il restringimento di sezione successiva:<ol>
<li>La corteccia in un'area di non-interesse, la puntura con un ago di 35G normale alla superficie corticale. Ripetere il passaggio due volte alle distanze definite lungo il foglio corticale. Per determinare la distanza lungo il foglio corticale, utilizzare un thread pre-tagliato a lunghezza fissa (ad es., 5mm) e posarlo lungo la superficie corticale per determinare i punti di foratura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic cervelli: rimuovere le strutture subcortical utilizzando una spatola per dissezione. Critico: Mantenere umido con PB (0,1 M; pH 7.4) durante l'intera procedura il cervello.<ol>
<li>Tenere il cervello dal cervelletto e inserire delicatamente la spatola per aprire un piano di dissezione in callosum del corpus. La punta rotonda di spatola dovrebbe puntare lontano la corteccia.</li>
		<li>Far scorrere la spatola ulteriormente e tirare delicatamente fino a quando la spatola è tra il talamo e la corteccia. Strutture subcortical separate con movimenti di graffiare.</li>
		<li>Ispezionare l'emisfero per anche lo spessore. Nota: Qualsiasi regioni irregolare potrebbero comportare un gradiente trans-strato durante il sezionamento. Per il sezionamento tangenziali, utilizzare un bisturi per fare un taglio pulito attraverso il cervello, parallela alla superficie pial della regione da cui sezioni tangenziali sono desiderati.</li>
		<li>Passaggi facoltativi per migliorare la qualità di conversione della trasparenza:<ol>
<li>Fare un taglio pulito attraverso il corpo striato, nucleo accumbens e nella corteccia orbitofrontal, poiché aumentano lo spessore della corteccia nella regione laterale. Inoltre, aggiungere un alleviamento taglio alla base della regione interna della corteccia prefrontale, che permette il dispiegarsi delle porzioni mediale della corteccia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare l'emisfero (corteccia rivolto verso il basso) su un vetrino. Procedere al punto 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girencefalici cervelli: rimuovere la materia bianca a svolgersi i gyri (per protocolli dettagliati, vedere: Sincich et al. 14; Tootell e Silverman15). Critico: Uso PB (0,1 M; pH 7.4) per mantenere il cervello umido in tutti i tempi.<ol>
<li>Mettere l'area di interesse su una carta da filtro umida in un grande piatto di Petri, con la corteccia rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Rimuovere la membrana aracnoide e la pia utilizzando due pinze.</li>
		<li>Utilizzare un batuffolo di cotone umido e inserire delicatamente in ogni solco per staccare aderenze tra circonvoluzioni.</li>
		<li>Girare il cervello intorno utilizzando un'altra carta da filtro umido.</li>
		<li>Utilizzare due curve micro spatole per dispiegare i gyri singoli. Utilizzare il lato convesso delle spatole per stuzzicare a pezzi la materia bianca fino ad arrivare vicino l'estremità concava del gyrus. Utilizzare un batuffolo di cotone umido e procedere con movimenti vorticosi di raggiungere l'estremità concava del gyrus.</li>
		<li>Stuzzicare apart gyri singoli. Se necessario, aggiungere alleviare piccoli tagli se la tensione è troppo alta.</li>
		<li>Appiattire il cervello spiegato nella capsula di Petri o un contenitore simile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Facoltativamente, posto di cervelli più grandi su una spugna filtro carta coperta, per garantire che le regioni non asciugarsi.</li>
	<li>Posizionare due pezzi arrotolati di argilla su entrambi i lati. Critico: Come lo spessore dell'argilla definisce quanto l'emisfero può essere appiattito, assicurarsi che l'argilla è 10-20% più sottile di corteccia del ONU-appiattita.</li>
	<li>Premere delicatamente una seconda diapositiva vetro/piccola capsula di Petri sulla corteccia finché l'emisfero è completamente piatto. Per ottenere i migliori risultati per una regione desiderata, posizionare il vetrino prima sulla zona rispettiva. Per ottenere i migliori risultati per i cervelli lissencephalic, posizionare il vetrino tangenzialmente alla parte laterale prima e applicare una pressione concentrata su questa regione.</li>
	<li>Mettere un peso (per esempio, un vetro da orologio in ceramica) sulle diapositive di vetro/Petri e appiattire l'emisfero per 3-5 h a 4 ° C in PB.</li>
	<li>Per post-fissazione, rilasciare la pressione e rimuovere le diapositive di vetro. Mettere l'emisfero appiattito in PFA (mobile) per 24 h in un agitatore a 4 ° C. Nota: Si ottengono migliori risultati per colorazioni istochimiche attività quando si utilizza 1% PFA. Per altre colorazioni, come immunohistochemistry, al posto del cervello non perfusi, 2% PFA può essere utilizzato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'appiattimento di un emisfero corticali del ratto e la visualizzazione dei moduli nella corteccia somatosensoriale. Successivamente la perfusione di perfusione, il cervello di un topo è stato dissecato (A). Strutture subcortical sono stati rimossi e corteccia è stato appiattito fra due vetrini in tampone fosfato (B). Appiattito emisfero (C) era post-fisso, tangenzialmente sezionato e macchiato per attività dell'ossidasi del citocromo (D). Scala bar = 1 cm. r: rostrale, c: Caudal, l: laterale, m: mediale. Figura adattata da Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. taglio di sezioni tangenziali
Nota: A seconda delle esigenze dei protocolli di colorazione, la procedura di taglio e lo spessore possono essere adattati. Un vibratomo è stato usato per tagliare gli emisferi per un'ulteriore elaborazione istochimica (punto 3.2) a 80-150 µm. Tuttavia, per l'elaborazione di immunohistochemical, sezioni più sottili sono desiderati e un congelamento microtomo è stato usato per sezionamento (punto 3.3) a 10-60 µm. Guarda il Video 1.
<ol><li>Lavare l'emisfero appiattito in PB (0.1 m; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un vibratomo.<ol>
<li>Mettete l'emisfero tangenzialmente sul supporto per affettare. Facoltativamente, premere di nuovo delicatamente con un vetrino prima di fissarla in posizione (ad es., con colla a presa rapida). Nota: Ridurre al minimo la quantità di colla utilizzata, perché gli artefatti di taglio potrebbero essere causa il piccolo spessore degli emisferi appiattiti.</li>
		<li>Tagliare l'emisfero dall'estremità più spessa e più stabile verso l'estremità più sottile (posteriore a anteriore, qui) lo spessore desiderato. Procedere al punto 3.4. Nota: Se le concentrazioni basse di fissazione sono state usate, tagliato ad una velocità lenta e un'elevata ampiezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un congelamento microtomo.<ol>
<li>Cryoprotect il cervello immergendolo in una soluzione di saccarosio al 30% (in PB) fino a quando si affonda. Nota: A seconda delle dimensioni del tessuto essere prelevate, affondando nella soluzione può variare da poche ore ad alcuni giorni. Per i più grandi cervelli crioprotezione alternativi metodi potrebbero essere considerati (Vedi Antonella et al. 16).</li>
		<li>Formare un ghiaccio base del congelamento microtomo per montare il cervello. Costruire il base di ghiaccio di congelamento PB sul viso di blocco del congelamento microtomo. Critico: Assicurarsi che la superficie della base del ghiaccio sia parallela alla lama del microtomo. Per effettuare questa operazione, tagliare il ghiaccio vuoto base utilizzando la lama del microtomo per allineare esattamente la base di ghiaccio parallela alla superficie di taglio.</li>
		<li>Incorporare il cervello in mezzo di congelamento e montarlo sul viso di blocco del microtomo con l'area di interesse parallelo alla faccia del blocco. Faccia la superficie pial del cervello verso la faccia di blocco del microtomo. Critica: Regolare la temperatura di congelamento a seconda delle dimensioni del campione; temperature più elevate assicurano migliore sezione integrità durante il sezionamento, ma più grandi sezioni richiedono temperature più basse per congelare il campione in modo uniforme.</li>
		<li>Tagliare il cervello tangenzialmente allo spessore richiesto (velocità di taglio più lento e uniforme risultato nella migliore qualità di sezione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni in PB per 15 minuti su un agitatore.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: video schematico della tangenziale di sezionamento da una corteccia di entorhinal mediale del ratto e il layout dei moduli Parasubiculare ed entorinale. La corteccia di entorhinal mediale di un cervello del roditore è situata all'estremità posteriore della corteccia ed è inclinata verso il lato mediale e ventrale. Sezioni tangenziali sono ottenute con un coltello lungo questo angolo di orientamento. Di conseguenza, colorazione specifica cellula-tipo appropriato rivela strutture modulari nella corteccia di entorhinal mediale e Parasubiculare adiacente. Video tratto da Ray e Brecht8. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
4. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura dell'ossidasi del citocromo
Nota: Diversi protocolli di colorazione sono stati sviluppati per il rilevamento di istochimica di attività dell'ossidasi del citocromo, ad es., in primo luogo da Wong-Riley17 e successivamente modificati da Divac et al. 18 il presente protocollo è basato su quello di Divac et al. 18, poiché l'uso di solfato di nichel-ammonio (NiAS) si traduce in un maggiore contrasto e meglio definiti moduli in aree corticali macchiate.
<ol><li>Preparare il citocromo ossidasi soluzioni di colorante (Vedi Divac et al. 18). per 10 mL di soluzione, aggiungere: 10 mL di tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4), 400 mg di saccarosio, 12,5 mg NiAS, citocromo C, 6mg diaminobenzidina (DAB) di 2 mg. Attenzione: DAB e NiAS sono cancerogene. Nota: Aggiungere DAB appena prima dell'incubazione delle sezioni.</li>
	<li>Lavare le sezioni nel tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4) su un agitatore per 15 min.</li>
	<li>Incubare le sezioni nella soluzione colorante a temperatura ambiente in un agitatore. Nota: Osservare la velocità della colorazione. Se non c'è nessuna reazione visibile, modificare in incubazione a 37 ° C. A seconda della quantità di fissazione, la colorazione può essere osservata dopo 10 min o in diverse ore.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 4% PFA; Questo impedisce indesiderate ri-morire e aumento del segnale di fondo.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte utilizzando tampone HEPES per 10 min.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni sulle lastre di vetro.</li>
	<li>Disidratare le sezioni con una riga di alcol crescente:<ol>
<li>Lavare i vetrini in etanolo al 60% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo di 80% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo al 96% per 2 min. lavare i vetrini in etanolo al 100% per 3 min. lavare i vetrini in isopropanolo per 5 min. lavare i vetrini in xilene per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immediatamente aggiungere un mezzo di montaggio a indurimento rapido e un vetrino coprioggetti. Critica: Non usare mezzi di montaggio a base acqua, come NiAS sarà lavato e degradare la colorazione.</li>
	<li>Mantenere le sezioni a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>5. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura Immunohistochemical
Nota: Protocolli multipli sono disponibili per l'immunoistochimica, ottimizzato per il campione e il tipo di sonda. Gli adattamenti possono essere fatto come richiesto, dalla variazione delle concentrazioni di anticorpi, agenti permeabilizing e tempi di incubazione. Il seguente protocollo porta a buoni risultati per la rilevazione di una vasta gamma di anticorpi e la visualizzazione di sonde fluorescenti.
<ol><li>Lavare le sezioni in PBS (0,1 M; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Facoltativo: Eseguire ricupero dell'antigene per smascherare un epitopo usando un bagno di acqua (basato su Jiao et al. 19; per metodi alternativi, vedere Pileri et al. 20).<ol>
<li>Preriscaldare un bagno di acqua a 80 ° C. Preparare tri-sodio citrato buffer19 (pH 8.0) e preriscaldarlo nel bagno d'acqua a 80 ° C.</li>
		<li>Trasferire le sezioni in tampone citrato tri-sodio. Incubare le sezioni per 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Raffreddare le sezioni fino a temperatura ambiente</li>
		<li>Lavare le sezioni in PBS per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni due volte in PBS-X (0,5% Triton-X, in 0.1 M PBS) per 15 min.</li>
	<li>Bloccare gli epitopi aspecifici incubando le sezioni in una soluzione di albumina di siero bovino (BSA; 2,5%) e Triton-X (0,75%) in PBS per 2 h.</li>
	<li>Incubare le sezioni in anticorpo primario, ad esempio, calbindina - D28k (1:5, 000, 1% BSA in PBS-X), per 2-3 giorni su un agitatore a 4 ° C. Nota: Una diluizione ottimale per l'anticorpo primario dipende l'anticorpo specifico utilizzato. Fare riferimento alle informazioni del fabbricante per ottenere criteri di diluizione per un anticorpo specifico. Anticorpi multipli possono essere utilizzati insieme, ma devono essere sollevati contro diverse specie.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte in PBS per 15 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare le sezioni pernottamento in anticorpo secondario (1: 200, 1% BSA in PBS) a 4 ° C in un agitatore. Nota: Più anticorpi secondari possono essere utilizzati a differenti spettri se gli anticorpi primari multipli sono stati usati.</li>
	<li>Lavare l'anticorpo secondario lavando le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti ciascuno.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni su un vetrino per microscopio. Nota: Le sezioni devono ancora essere umide prima di montare il vetrino coprioggetto.</li>
	<li>Applicare liquido di montaggio adatto per fluorescenza coloranti su sezioni di tessuto e applicare un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Asciugare le sezioni per 1 h.</li>
	<li>Per l'archiviazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto con smalto e tenere al buio a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).</li><li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomical+studies+of+the+SmL+face+cortex+with+special+reference+to+the+occurrence+of+"barrels"+in+layer+IV.">Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV.</a> J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).</li><li>Krubitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+neocortex+in+mammals:+are+species+differences+really+so+different?.">The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?.</a> Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).</li><li>Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+selected+size+differences+and+conserved+sexual+monomorphism+of+genital+cortex.">Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex.</a> J Comp Neurol. , (2017).</li><li>Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+bundles+of+dendrites+in+the+neocortex.">Vertical bundles of dendrites in the neocortex.</a> Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).</li><li>Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+trajectories+between+mouse+somatosensory+thalamus+and+cortex.">Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex.</a> J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).</li><li>Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+Modular+Microcircuits+of+the+Rat+Medial+Entorhinal+Cortex.">Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex.</a> Front Syst Neurosci. 11, (2017).</li><li>Livingstone, M. S., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+inputs+to+cytochrome+oxidase-rich+regions+in+monkey+visual+cortex.">Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).</li><li>Land, P. W., Simons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+oxidase+staining+in+the+rat+SmI+barrel+cortex.">Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).</li><li>Welker, C., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+layer+IV+in+the+somatosensory+neocortex+of+the+rat:+description+and+comparison+with+the+mouse.">Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse.</a> J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).</li><li>Retzius, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Cajal'schen+zellen+der+grosshirnrinde+beim+menschen+und+bei+s&#228;ugetieren.">Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei s&#228;ugetieren.</a> Biol Unters. 5, 1-9 (1893).</li><li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vert&#233;br&#233;s. , (1911).</li><li>Chapin, J. K., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+body+representation+in+the+SI+cortex+of+anesthetized+and+awake+rats.">Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats.</a> J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).</li><li>L&#246;wel, S., Freeman, B., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+the+orientation+column+system+in+large+flat-mounts+of+the+cat+visual+cortex:+A+2-deoxyglucose+study.">Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study.</a> J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+rat+parasubiculum.">Functional architecture of the rat parasubiculum.</a> J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).</li><li>Snyder, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Map projections--A working manual (Vol. 1395). , (1987).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Modularità nella corteccia cerebrale è stato identificato usando una varietà di tecniche. I primi studi in genere identificati corticale moduli o visualizzando delle cellule dense regioni, o un'assenza di fibre1. I metodi successivi hanno utilizzato la presenza di fasci dendritiche24, afferenze da una particolare regione25, o l'arricchimento di neurotrasmettitori26. Qui dimostriamo due tecniche, l'istochimica (i) del citocr...

Alcuni dei più significativi cambiamenti nella struttura del cervello attraverso la filogenesi può essere osservata nella corteccia cerebrale. Nonostante le differenze significative, la corteccia degli animali segue uno schema comune e possa essere suddivisi in due modi distinti, di strati e zone1. Strati corticali siano parallele alla superficie del cervello e variano in numero da 3 strati in cortecce rettile2 a 6 strati in cortecce dei mammiferi1. Aree corticali sono invece distinte regioni della corteccia che corrispondono in gran parte alle funzionalità distinte, ad esempio, la corteccia somatosensoriale è coinvolto nella sensazione di tocco o la corteccia visiva nell'elaborazione di input visivi. Queste aree corticali possono spesso essere suddivisi patch o moduli3, che si ripetono regolarmente strutture anatomiche, essenzialmente trovati parallele alla superficie pial del cervello. Moduli corticale possono essere limitati a un particolare livello4o estendono in diversi strati5.
Metodi standard di sezionamento del cervello coinvolgono sezioni normale alla superficie del cervello, come coronale e sagittale. Mentre questi metodi possono essere utilizzati per visualizzare moduli corticale, una moltitudine di caratteristiche interessanti possa essere rivelata quando i moduli corticali sono visualizzati tangenzialmente, in un piano parallelo alla superficie del cervello. Per esempio, somatosensoriali moduli nel cervello del roditore che rappresenta baffi, appaiono come barili quando visualizzato normale alla superficie del cervello, e così le regioni derivano la corteccia di canna di nome. Sulla visualizzazione le botti in un orientamento tangenziale, esse però rivelano una baffo-mappa, con le canne essendo disposti in un orientamento topografico del mirroring l'esatta disposizione dei baffi sulla superficie esterna del corpo. In alcuni casi, disposizione modulare è sfuggito anche rilevamento per lunghi periodi, quando visualizzati in un modo non tangente. La corteccia di entorhinal mediale, è noto per la presenza di celle della griglia, i neuroni che il fuoco in un reticolo esagonale regolare quando un animale attraversa un ambiente. Anche se è una zona fortemente indagata, fino a poco tempo fa, la presenza di patch o moduli di cellule nella corteccia entorinale mediale, che sono fisicamente disposti in un reticolo esagonale6, era fuggito il rilevamento. La presenza e la disposizione di questi moduli, nel cervello del ratto, è stata facilitata effettuando sezioni tangenziali della corteccia entorinale mediale e indagando la citoarchitettura in maniera strato-saggio.
A seguito di sezionamento, il particolare aspetto della visualizzazione dei moduli corticale può essere realizzato anche in più modi. Classicamente, gli studi hanno delineato moduli basati sul cellulare densità o fibra di formato1. Un altro approccio popolare è l'uso di istochimica di citocromo ossidasi, che rivela le aree di maggiore attività8. Approcci più recenti includono guardando tipi di cellule geneticamente determinata, distinti sulla base della loro espressione di proteina profili6,8.
In questo studio, evidenziamo i metodi per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi, ottenere sezioni tangenziali appiattite e visualizzare corticale moduli basati sul citocromo ossidasi istochimica e immunoistochimica di proteine specifiche del tipo di cella.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cytochrome oxidase staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON-X 100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting or freezing media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (immunofluorescence)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt (histochemistry)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NC0696746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol dehydration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>78475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jung RM2035</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Shears - 24 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16150-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Large Loops</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

La corteccia del cervello dei mammiferi è parcellated in sottostrutture distinte o moduli. Moduli corticali in genere siano parallele al foglio corticale e possono essere delineate da alcuni metodi istochimici e immunohistochemical. In questo studio, segnaliamo un metodo per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi e appiattirli per ottenere parallelo di sezioni al foglio corticale. Abbiamo ulteriormente evidenziare selezionato istochimiche e immunohistochemical metodi per elaborare questi appiattito tangenziale sezioni per visualizzare moduli corticale. Nella corteccia somatosensory di vari mammiferi, eseguiamo la citocromo ossidasi istochimica per rivelare il corpo mappe o corticale moduli che rappresenta diverse parti del corpo dell'animale. Nella corteccia entorinale mediale, un'area dove vengono generate le celle della griglia, utilizziamo metodi di immunohistochemical per evidenziare i moduli dei neuroni geneticamente determinati, che sono organizzati in un modello di griglia nel foglio di corticale attraverso le diverse specie. Nel complesso, mettiamo a disposizione un framework per isolare e preparare layer-wise appiattito sezioni corticale e la visualizzazione di corticale moduli utilizzando istochimiche e immunohistochemical metodi in un'ampia varietà dei cervelli dei mammiferi.

Abbiamo ottenuto sezioni appiattite corticali della corteccia somatosensory in una varietà di cervelli ed elaborato li per la citocromo ossidasi istochimica visualizzare i moduli somatotopica che rappresenta diverse parti del corpo. Questo approccio comparativo permette di studiare le forze evolutive che corteccia forma, ad esempio, risultati altamente conservata rappresentazione delle vibrisse baffi in roditori e lagomorpha come botti21 (<strong class="x...

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Views.  Humboldt University of Berlin. Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Video: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

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Neuroscienze

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Riproduzione automatica Interactive Video per gli Studi di comunicazione animale

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...