Diese Arbeit wurde von Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, Humboldt Universität Zu Berlin, des Deutschen Zentrums für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Förderkennzeichen unterstützt. 01GQ1001A), NeuroCure, und der Gottfried Wilhelm Leibniz-Preis der deutschen Forschungsgemeinschaft. Wir danken Shimpei Ishiyama für hervorragende Grafik-Design und Juliane Diederichs für ausgezeichnete technische Unterstützung.

Alle experimentelle Verfahren wurden nach den deutschen Richtlinien im Bereich des Tierschutzes unter der Aufsicht der lokalen Ethik-Kommissionen (LaGeSo) durchgeführt. Mensch und Fledermaus Gehirn Daten stammen aus Naumann Et Al. 5 die folgende Prozedur erfolgt auf einer männlichen Erwachsenen Wistar Ratte (Stamm: RJHan:WI).
(1) Perfusion und Gehirn Extraktion
Hinweis: Um eine homogen fest und frei von Blut Gehirn zu erhalten, ist Transcardial Perfusion des Tieres dringend empfohlen, da verbleibende Blut unspezifische Hintergrundsignal während der Färbung erhöht. Dennoch ist es auch möglich, abgeflachten Abschnitte von UN-perfundierten Exemplar erhalten und färben sie. Die einfache Handhabung der Probekörpers hängt von der Konzentration des Fixiermittels verwendet. Zu wenig Fixierung erhöht das Risiko der Umgang mit Schädigung des Gehirns beim abflachen und schneiden, während zu hohe Konzentration die Flexibilität zum Abflachen und die Färbung Signalqualität zu senken.
<ol><li>Transcardially Durchspülen des Tieres mit einer 23G-Nadel. Eine ausführlichere Anleitung finden Sie unter Gage Et al. 9<ol>
<li>Verwenden Sie Phosphat Puffer Kochsalzlösung10 (PBS 0,02 M; pH 7,4) zu spülen, Blut aus dem Gehirn und den Körper des Tieres. Fortgesetzt, bis die Infusion Flüssigkeit klar, mit mindestens 150 mL PBS wird über das Gefäßsystem infundiert wird angezeigt. Hinweis: Die besten Ergebnisse werden erzielt bei einem Druck ähnlich wie das Spektrum der physiologischen Blutdruck des Tieres durchblutet wird (z.B., Ratte: 120-130 MmHg). Optional fügen Sie Heparin (10 U/mL hinzu), die Lösung für Blut Koagulation11zu vermeiden.</li>
		<li>Um das Gehirn zu beheben, die Transcardially mindestens 100 mL Paraformaldehyd12 Infusion (PFA, 4 %, in 0,1 M Phosphat-Puffer (PB)13) bis der Hals des Tieres steif ist. Achtung: PFA ist ein potential Karzinogen. Hinweis: Für histochemische Färbung, wie z. B. Cytochrom-Oxidase Aktivität besten Ergebnisse werden erzielt, wenn 2 % PFA. Für andere Färbung, wie z. B. Immunohistochemistry, 4 % PFA wird bevorzugt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrahieren Sie das Gehirn aus dem Schädel. Hinweis: Siehe Gage Et al. 9 für Details.<ol>
<li>Isolieren Sie den Kopf mit großen Scheren oder Knochen Scheren.</li>
		<li>Mit einer feinen Schere, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von Hals, Nase. Auseinanderziehen der Haut um den Schädel zu entlarven. Entfernen Sie Hals und zeitlichen Muskeln mit feiner Schere.</li>
		<li>Machen Sie eine Mittellinie durch den interparietal Knochen ab das Foramen Magnum bis zu den Parietal Knochen geschnitten.</li>
		<li>Verwenden Sie Rongeurs, um die interparietal Knochen abziehen. Schieben Sie feine Schere entlang der sagittale Naht und schneiden Sie vom hinteren Ende der parietalen am vorderen Ende der Stirnbeine.</li>
		<li>Verwenden Sie Rongeurs, um der parietalen und Stirnbeine abziehen. Alternativ, heben Sie die Knochen entfernt mit Pinzette. Verwenden Sie einen Löffel zu schneiden ventralen Nervenstränge und das Gehirn zu entfernen. Das Gehirn auf PB (0,1 M, pH 7,4) übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UN-perfundierten Gehirne zu beheben, durch Eintauchen in 4 % PFA für 1-3 h bei 4 ° C (abhängig von der Größe des Gehirns und Sonde: Zähmung: ~ 1 h, Human: ~ 3 h). Hinweis: Für große und Gyrencephalic Gehirne wie die Menschen isolieren und den Bereich von Interesse, Fixierzeit zu reduzieren.</li>
	<li>Um größeren kortikalen Bereiche in einem Abschnitt zu erhalten, glätten Sie das Gehirn vor weiteren Post-Fixierung; fahren Sie mit Schritt 2 fort. Jedoch um Teile der schwerer zugänglichen Bereichen wie den medialen entorhinalen Kortex zu erhalten, nach dem Beheben des Gehirns bei 4 % PFA für 24 h bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.</li>
</ol>2. Präparation und Abflachung des Gehirns
<ol><li>Trennen Sie die Gehirnhälften mithilfe einer Rasierklinge (Lissencephalic Köpfe) oder Skalpell (Gyrencephalic Köpfe). Hinweis: Wenn das Gehirn nach dem nicht feststeht, ist es anfällig für Beschädigungen durch Handhabung.</li>
	<li>Optionaler Schritt für die Unterstützung der nachfolgende Abschnitt Registrierung und Schrumpfung Schätzung:<ol>
<li>Punktion den Kortex auf einer Fläche von nicht-Interesse, mit einer 35G-Nadel senkrecht zur kortikalen Fläche. Wiederholen Sie Schritt zwei Mal in definierten Abständen entlang der kortikalen Blatt. Um den Abstand entlang der kortikalen Blatt zu bestimmen, verwenden Sie einen vorgeschnittenen Thread auf eine feste Länge (z.B. 5 mm) und legen Sie es entlang der kortikalen Oberfläche Punkte der Punktion zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic Gehirne: subkortikale Strukturen mithilfe einer sezierenden Spachtel entfernen. Kritisch: Halten Sie das Gehirn feucht mit PB (0,1 M, pH 7,4) während des gesamten Verfahrens.<ol>
<li>Halten Sie das Gehirn durch das Kleinhirn und sanft legen Sie den Spatel um eine Dissektion Flugzeug im Corpus Callosum zu öffnen. Die Runde Spitze des Spachtel darauf von der Hirnrinde.</li>
		<li>Schieben Sie die Spachtel weiter und ziehen Sie, bis die Spachtel zwischen dem Thalamus und Kortex ist. Separate subkortikalen Strukturen mit Kratzen Bewegungen.</li>
		<li>Überprüfen der Hemisphäre für gleichmäßige Dicke. Hinweis: Alle unebenen Regionen könnte ein Trans-Schicht Gefälle während Schnitt führen. Verwenden Sie für tangentiale schneiden ein Skalpell, um einen sauberen Schnitt durch das Gehirn parallel zur pial Oberfläche der Region machen aus dem tangentialen Abschnitte gewünscht werden.</li>
		<li>Optionale Schritte zur Abflachung Qualitätsverbesserung:<ol>
<li>Machen Sie einen sauberen Schnitt durch das Striatum, Nucleus Accumbens und orbitofrontalen Kortex, da sie die Dicke der Rinde in der lateralen Region erhöhen. Fügen Sie außerdem einen Linderung Schnitt an der Basis des inneren Bereich des präfrontalen Kortex, der ermöglicht die Entfaltung des medialen Teile des Cortex.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie die Hemisphäre (Kortex nach unten) auf einen Objektträger. Fahren Sie mit Schritt 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic Gehirne: Entfernen der weißen Substanz Windungen zu entfalten (ausführliche Protokolle finden Sie unter: Sincich Et Al. 14; Tootell und Silverman (15). Kritisch: Verwendung PB (0,1 M; pH 7,4), das Gehirn feucht zu jeder Zeit zu halten.<ol>
<li>Ein feuchtes Filterpapier in einer großen Petrischale, setzen Sie den gewünschten Bereich mit dem Kortex nach oben auf.</li>
		<li>Entfernen Sie die Arachnoidea Membran und Pia mit zwei Pinzetten.</li>
		<li>Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und einführen Sie vorsichtig, in jeder Sulcus, Verwachsungen zwischen den Windungen zu lösen.</li>
		<li>Umdrehen Sie das Gehirn mit einem anderen feuchten Filterpapier.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei gebogene Mikro Spachtel um zu einzelnen Windungen zu entfalten. Verwenden Sie die konvexe Seite der Spatel, um der weißen Substanz auseinander zu necken, bis hin zu nahe an das konkave Ende der Gyrus. Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und fahren Sie mit wirbelnden Bewegungen, konkave Ende der Gyrus zu erreichen.</li>
		<li>Neben einzelnen Windungen zu necken. Falls erforderlich, fügen Sie kleine Entlastung schneidet, wenn die Spannung zu hoch ist.</li>
		<li>Glätten Sie entfaltete Gehirn in der Petrischale oder einen ähnlichen Behälter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optional legen Sie größere Gehirne auf einem Filterpapier bedeckt Schwamm, um sicherzustellen, dass die Regionen nicht austrocknen.</li>
	<li>Legen Sie zwei gerollte Stücke von Ton auf beiden Seiten. Kritisch: Wie die Dicke des Tons legt fest, wieviel die Hemisphäre abgewickelt werden kann, sicherstellen, dass der Ton 10-20 ist % dünner als die UN-abgeflachte Kortex.</li>
	<li>Drücken Sie vorsichtig eine zweiten Glas Folie/kleine Petrischale auf der Rinde, bis die Hemisphäre komplett flach ist. Um die besten Ergebnisse für eine gewünschte Region zu erhalten, legen Sie die Glas-Folie zuerst auf den entsprechenden Bereich. Um die besten Ergebnisse für Lissencephalic Gehirne zu erhalten, legen Sie den Objektträger tangential an den seitlichen Teil zuerst und konzentrierten Druck auf diese Region.</li>
	<li>Setzen Sie eine Gewicht (z.B. einem keramischen Uhrglas) auf der Glas-Folien/Petrischale und Glätten der Hemisphäre für 3-5 h bei 4 ° C in PB.</li>
	<li>Lassen Sie für Post-Fixierung den Druck und entfernen Sie die Glasplatten zu. Aufsetzen der abgeflachten Halbkugel in PFA (frei schwebend) für 24 h einen Shaker bei 4 ° C. Hinweis: Beste Ergebnisse für histochemische Aktivität Keramikschalen werden erzielt, wenn 1 % mit PFA. Für andere Färbungen, wie z. B. Immunohistochemistry, für UN-perfundierten Gehirne, 2 % PFA verwendet werden kann.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows für Abflachung der eine Ratte kortikalen Hemisphäre und Visualisierung von Modulen im somatosensorischen Kortex. Im Anschluss an die Transcardial Durchblutung des Gehirns einer Maus wurde seziert (A). Subkortikale Strukturen wurden entfernt und Kortex wurde zwischen zwei Glasplatten in Phosphatpuffer (B) dem Erdboden gleichgemacht. Abgeflachte Halbkugel (C) war nach dem fest, tangential geschnitten und gebeizt für Cytochrom-Oxidase-Aktivität (D). Skalieren von Balken = 1 cm. R: Rostral, C: am L: seitlich, M: Medial. Abbildung von Lauer Et Al. angepasst 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
3. Schneiden Tangential Abschnitte
Hinweis: Je nach den Anforderungen der Färbung Protokolle können der Schneidvorgang und Dicke angepasst werden. Ein Vibratome wurde verwendet, um den Hemisphären für histochemische Weiterverarbeitung (Schritt 3.2) auf 80-150 µm geschnitten. Jedoch für immunhistochemische Verarbeitung dünnere Sektionen sind erwünscht und ein Einfrieren Mikrotom diente für Stationspunkte (Schritt 3.3) bei 10-60 µm. Sehen Sie Video 1.
<ol><li>Waschen Sie die abgeflachte Halbkugel in PB (0.1M; pH 7,4) für 15 Minuten.</li>
	<li>Geschnitten Sie die Hemisphäre auf eine Vibratome.<ol>
<li>Ort der Hemisphäre tangential auf dem slicing Halter. Drücken Sie gegebenenfalls noch einmal vorsichtig mit einem Objektträger vor der Befestigung in Position (z.B., mit Sekundenkleber). Hinweis: Minimieren Sie die Kleber verwendet, da aufgrund der geringen Dicke der abgeflachten Halbkugeln schneiden Artefakten führen können.</li>
		<li>Geschnitten Sie die Halbkugel aus dicker und stabiler Ende am Ende dünner (posterior, anterior, hier) an die gewünschte Dicke. Fahren Sie mit Schritt 3.4. Hinweis: Wenn geringe Fixierung Konzentrationen verwendet wurden, schneiden Sie es mit einer langsamen Geschwindigkeit und eine hohe Amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneiden Sie die Hemisphäre auf ein Einfrieren Mikrotom.<ol>
<li>Cryoprotect sinkt das Gehirn durch Eintauchen in eine 30 % Saccharoselösung (in PB) bis es. Hinweis: Abhängig von der Größe des Gewebes wird Cryoprotected Untergang in der Lösung von ein paar Stunden bis wenige Tage reichen. Für größere Gehirne alternative Cryoprotection Methoden angesehen werden könnten (siehe Rosene Et Al. ( 16).</li>
		<li>Bilden Sie eine Eis auf der eisigen Mikrotom, das Gehirn zu montieren. Konstruieren Sie das Eis Basis durch Einfrieren PB auf dem Block Gesicht des eiskalten Mikrotom. Kritisch: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Eis-Basis parallel zu dem Mikrotom Klinge. Um dies zu tun, schneiden Sie das leere Eis Basis mit dem Mikrotom-Messer, die Eis-Basis parallel zu der Schnittfläche exakt auszurichten.</li>
		<li>Betten Sie des Gehirns im eiskalten Medium ein und montieren Sie ihn auf das Gesicht der Block des Mikrotom mit einer Fläche von Interesse, die parallel zu den Block-Gesicht. Gesicht der pial Oberfläche des Gehirns auf die Block-Gesicht der Mikrotom. Kritisch: Passen Sie die Gefriertemperatur je nach Probengröße; höhere Temperaturen besser Abschnitt Integrität sicherzustellen, beim Schneiden, aber größere Abschnitte erfordern niedrigere Temperaturen zum Beispiel gleichmäßig einfrieren.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gehirn tangential auf die gewünschte Dicke (langsamer und einheitliche Schnittgeschwindigkeiten führen beste Schnittqualität).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in PB für 15 min auf einem Boston-Shaker.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: Schematische Video von tangential-Schnitt von einer Ratte mediale entorhinalen Kortex und Anordnung der Module Parasubicular und entorhinalen. Die mediale entorhinalen Kortex des Gehirns, Nagetier befindet sich am hinteren Ende des Kortex und in Richtung der medialen und ventralen Seite gekippt ist. Tangentiale Abschnitte erhält man durch ein Messer entlang dieser Winkel ausrichten. Folglich zeigt die entsprechenden Zelltyp-spezifische Färbung modulare Strukturen im medialen entorhinalen Kortex und angrenzenden Parasubiculum. Video von Ray und Brecht8angepasst. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
(4) Visualisierung der kortikalen Module mit Cytochrom-Oxidase Färbung
Hinweis: Unterschiedliche Färbung Protokolle entwickelt für histochemische Nachweis der Cytochrom-Oxidase Aktivität, z. B.zuerst von Wong-Riley17 und wurden später geändert durch Divac Et al. 18 dieses Protokoll basiert auf der von Divac Et al. 18, da die Verwendung von Nickel-Ammoniumsulfat (NiAS) in einen höheren Kontrast und besser definierte Module in gefärbten kortikalen Areale führt.
<ol><li>Vorbereiten der Cytochrom-Oxidase Färbelösung (siehe Divac Et Al. 18). für 10 mL der Lösung hinzufügen: 10 mL HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4), 400 mg Saccharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg Cytochrom C, 6 mg Diaminobenzidine (DAB). Achtung: DAB und NiAS sind krebserregend. Hinweis: Fügen Sie DAB kurz vor der Inkubation der Abschnitte.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4) auf einen Shaker für 15 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in der Färbelösung bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker. Hinweis: Beachten Sie die Geschwindigkeit der Färbung. Wenn es keine sichtbare Reaktion, ändern Sie in Inkubation bei 37 ° C. Abhängig von der Menge der Fixierung kann Färbung nach 10 Minuten oder mehrere Stunden beobachtet werden.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 4 % PFA; Dies verhindert, dass unerwünschte wieder sterben und Erhöhung der Hintergrundsignal.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitten drei Mal mit HEPES-Puffer für 10 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf Objektträgern.</li>
	<li>Entwässern Sie in den Abschnitten mit einer zunehmenden Alkohol-Zeile:<ol>
<li>Waschen Sie Folien in 60 % Ethanol für 1 min. Waschen die Folien in 80 % Ethanol, für 1 min. Waschen die Folien in 96 % igem Ethanol für 2 min. Waschen die Folien in 100 % igem Ethanol für 3 min. Waschen Sie die Folien in Isopropanol für 5 min. die Objektträger in Xylol für 5 min waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sofort eine schnelle Aushärtung-Eindeckmittel und hinzufügen ein Deckglas. Kritisch: Verwenden Sie nicht Montage wässrige Medien, wie NiAS ausgewaschen werden wird und die Färbung beeinträchtigen.</li>
	<li>Halten Sie die Abschnitte bei 4 ° C für langfristige Lagerung.</li>
</ol>(5) Visualisierung der kortikalen Module mit immunhistochemischen Färbung
Hinweis: Mehrere Protokolle stehen für Immunohistochemistry, optimiert für die Probe und die Art der Sonde. Anpassungen können je nach Bedarf von unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörpern, permeabilizing Agenten und Inkubationszeiten. Das folgende Protokoll führt zu guten Ergebnissen für die Erkennung einer Vielzahl von Antikörpern und Visualisierung durch fluoreszierende Sonden.
<ol><li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer (0,1 M, pH 7,4) für 15 Minuten.</li>
	<li>Optional: Führen Sie Antigen-Retrieval um ein Epitop über einem Wasserbad (basierend auf Jiao Et Al. zu entlarven 19; für alternative Methoden siehe Pileri Et al. ( 20).<ol>
<li>Ein Wasserbad auf 80 ° c vorheizen Tri-Natrium-Citrat Puffer19 (pH 8,0) vorbereiten und im Wasserbad auf 80 ° c vorheizen</li>
		<li>Übertragen Sie die Abschnitte auf Tri-Natrium-Citrat-Puffer. Inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei 80 ° C</li>
		<li>Die Abschnitte auf Zimmertemperatur abkühlen</li>
		<li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer für 15 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitten zwei Mal in PBS-X (0,5 % Triton-X, in 0,1 M PBS) für 15 Minuten.</li>
	<li>Unspezifische Epitope durch die Abschnitte in einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA; 2,5 %) und Triton-X (0,75 %) mit PBS-Puffer für 2 h Inkubation zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in Primärantikörper, z.B.Calbindin - D28k (1:5 000, 1 % BSA in PBS-X), für 2-3 Tage auf einem Schüttler bei 4 ° C. Hinweis: Optimale Verdünnung für den primären Antikörper richtet sich nach den spezifischen Antikörper verwendet. Beziehen sich auf Herstellerangaben Verdünnung Kriterien für einen spezifischen Antikörper zu erhalten. Mehrere Antikörper können zusammen verwendet werden aber gegen verschiedene Arten angehoben werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS-Puffer für 15 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in Sekundärantikörper (1: 200, 1 % BSA mit PBS-Puffer) bei 4 ° C in einen Shaker geben. Hinweis: Mehrere sekundäre Antikörper können bei verschiedenen Spektren verwendet werden, wenn mehrere primäre Antikörper verwendet wurden.</li>
	<li>Der sekundäre Antikörper durch Waschen in den Abschnitten dreimal mit PBS-Puffer für jeweils 10 min. abwaschen.</li>
	<li>Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf einem Objektträger für die Mikroskopie. Hinweis: Die Abschnitte sollte noch vor der Montage das Deckglas feucht sein.</li>
	<li>Gelten Sie Eindeckmedium geeignet für Fluoreszenz-Farbstoffen auf die Gewebeschnitte und einem Deckgläschen.</li>
	<li>Trocknen Sie die Abschnitte für 1 h.</li>
	<li>Für langfristige Lagerung versiegeln Sie des Deckglases mit Nagellack und halten Sie im Dunkeln bei 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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M., Lenschow, C., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+selected+size+differences+and+conserved+sexual+monomorphism+of+genital+cortex.">Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex.</a> J Comp Neurol. , (2017).</li><li>Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+bundles+of+dendrites+in+the+neocortex.">Vertical bundles of dendrites in the neocortex.</a> Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).</li><li>Bernardo, K. L., Woolsey, T. 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Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Modularität in der Großhirnrinde ist mit einer Vielzahl von Techniken identifiziert worden. Die frühesten Studien in der Regel identifiziert kortikalen Module durch die beiden Visualisierung Zelle dichten Regionen oder fehlender Fasern1. Nachfolgende Methoden haben die Anwesenheit von dendritischen Bündel24, Afferenzen aus einer bestimmten Region25oder Anreicherung von Neurotransmittern26genutzt. Hier zeigen wir zwei Techn...

Einige der wichtigsten Änderungen in der Gehirnstruktur über Phylogenie kann in der Großhirnrinde beobachtet werden. Trotz der erheblichen Unterschiede der Hirnrinde von Tieren folgt ein gemeinsames Muster und kann breit geteilt werden auf zwei verschiedene Arten von Schichten und Bereichen1. Kortikale Schichten liegen parallel zur Oberfläche des Gehirns und variieren in der Zahl von 3 Schichten in Reptilien Cortex2 bis 6 Lagen in Säugetieren Cortex1. Kortikalen Areale auf der anderen Seite sind verschiedene Regionen des Cortex, die unterschiedliche Funktionalitäten, z.B.weitgehend entsprechen, somatosensorische Cortex in der Empfindung des Touch oder den visuellen Cortex bei der Verarbeitung von visuellen Eingänge beteiligt ist. Diese kortikalen Bereiche können oft in Patches oder Module3, unterteilt werden, die regelmäßig zu, anatomische Strukturen, die im wesentlichen parallel zur pial Oberfläche des Gehirns gefunden wiederholen. Kortikale Module können auf einem bestimmten Layer4beschränkt oder erstrecken sich über mehrere Ebenen5.
Strukturierendes Standardmethoden des Gehirns umfassen Abschnitte des Gehirns, wie koronale oder sagittale senkrecht zur Fläche. Während diese Methoden verwendet werden können, kortikale Module zu visualisieren, kann eine Vielzahl von interessanten Features aufgedeckt werden, wenn die kortikalen Module in einer Ebene parallel zur Oberfläche des Gehirns tangential, visualisiert werden. Zum Beispiel somatosensorischen Module im Nagetier Gehirn repräsentieren Schnurrhaare, erscheinen als Fässer als normal auf die Gehirn-Oberfläche visualisiert, und somit die Regionen ableiten den Name Fass Kortex. Jedoch auf die Fässer in einer tangentialen Ausrichtung zu visualisieren, offenbaren sie eine Whisker-Karte, mit den Fässern in einer topographischen Ausrichtung spiegeln das genaue Layout der Schnurrhaare auf die äußere Körperoberfläche angelegt. In bestimmten Fällen modulare Anordnung hat sogar entkommen Erkennung für einen erheblichen Zeitraum, wenn in gewissem Sinne nicht tangential visualisiert. Die mediale entorhinalen Kortex ist bekannt für das Vorhandensein der Gitterzellen, Neuronen, die in einem regelmäßigen hexagonalen Muster zu feuern, wenn ein Tier eine Umgebung durchlaufen ist. Obwohl es eine stark untersuchten Gegend bis vor kurzem, das Vorhandensein von Patches oder Module von Zellen in der medialen entorhinalen Kortex ist, die physisch in einem hexagonalen Muster6angelegt sind geflohen Erkennung. Das Vorhandensein und die Anordnung dieser Module in der Rattengehirn wurde durch tangentiale Abschnitte des medialen entorhinalen Kortex und untersucht die Cytoarchitecture in gewissem Sinne Schichtweiser erleichtert.
Im Anschluss an die schneiden, kann der besondere Aspekt der Visualisierung der kortikalen Module auch auf vielfache Weise realisiert werden. Klassisch, haben Studien Module basierend auf Zelle Dichte oder Faser Layout1abgegrenzt. Ein weiterer beliebter Ansatz ist die Verwendung von Cytochrom-Oxidase Histochemie, die Bereiche der höheren Aktivität8enthüllt. Neuere Ansätze beinhalten Blick auf genetisch bedingte Zelltypen unterschieden auf der Basis ihrer Protein Ausdruck Profile6,8.
In dieser Studie beleuchten wir Methoden zum Isolieren der Hirnrinde von Säugetier-Gehirne, abgeflachte tangential Abschnitte erhalten und kortikalen Module basierend auf Cytochrom-Oxidase Histochemie und Immunhistochemie Zelltyp spezifische Proteine zu visualisieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cytochrome oxidase staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON-X 100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td>
			<td>Swant</td>
			<td>RRID: AB_10000340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting or freezing media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (immunofluorescence)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt (histochemistry)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NC0696746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol dehydration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>78475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM 650V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jung RM2035</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Shears - 24 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16150-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Large Loops</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

Der Kortex Säugetier-Gehirne ist Parcellated in verschiedene Unterkonstruktionen oder Module. Kortikale Module in der Regel liegen parallel zu den kortikalen Blatt und können durch bestimmte histochemische und immunhistochemischen Methoden abgegrenzt werden. In dieser Studie stellen wir eine Methode zu den Kortex von Säugetier-Gehirne zu isolieren und zu glätten, um Abschnitte Parallel zu den kortikalen Blatt zu erhalten. Wir weitere Highlight ausgewählt histochemische und immunhistochemischen Methoden, diese zu verarbeiten abgeflacht tangential Abschnitte um kortikalen Module zu visualisieren. Wir führen im somatosensorischen Cortex von verschiedenen Säugetieren Cytochrom-Oxidase Histochemie um Körper Karten oder kortikale Module aus verschiedenen Teilen des Körpers des Tieres zu offenbaren. In der medialen entorhinalen Kortex, ein Gebiet, wo Rasterzellen generiert werden, nutzen wir immunhistochemischen Methoden um Module von genetisch bedingten Neuronen zu markieren, die auf mehrere Arten in einem Raster in der kortikalen Blatt angeordnet sind. Insgesamt bieten wir ein Rahmen zu isolieren und bereiten Ligawechsel kortikale Abschnitte abgeflacht und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden in einer Vielzahl von Säugetier-Gehirne zu visualisieren.

Wir erhalten abgeflachten kortikale Abschnitte des somatosensorischen Kortex in einer Vielzahl von Gehirn und verarbeitet sie für Histochemie Cytochrom-Oxidase, die Somatotopic-Module für verschiedene Körperteile zu visualisieren. Diese vergleichende Ansatz ermöglicht es, studieren die evolutionären Kräfte dieser Form Kortex, z.B.hoch konservierte Darstellung der Mystacial Tasthaare in Nagetieren und Lagomorpha als Fässer21 (Abb...

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Aufrufe.  Humboldt University of Berlin. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Serie: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

Zusammenfassung

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Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen