Questo protocollo facilita l'isolamento e la coltura riproducibile a lungo termine degli epatociti di topo in un ambiente sandwich di collagene 3D per studiare la formazione di strutture canoniche e la sua risposta al trattamento in vitro. Una volta che la tecnica è stata padroneggiata, è un metodo rapido per ottenere grandi volumi di popolazione di epatociti di topo altamente vitale e pura per studi in vitro. A dimostrare la procedura sarà Lenka Sarnova, un tecnico del nostro laboratorio.
Il giorno prima dell'isolamento primario degli epatociti, aggiungere 100 microlitri di DMEM 10X, 485 microlitri di acqua distillata e 15 microlitri di un idrossido di sodio molare in 500 microlitri a quello di collagene a coda di ratto. Controllare il pH del collagene neutralizzato. Dovrebbe essere circa 7,5.
Utilizzando una punta di pipetta pre-refrigerata da 200 microlitri, stendere 100 microlitri della soluzione di collagene neutralizzata su ciascuno dei piatti di coltura in plastica di 3,5 centimetri di diametro sul ghiaccio e posizionare i piatti in condizioni di coltura standard durante la notte. La mattina dopo, reidratare gli strati di collagene con un millilitro di 37 gradi Celsius PBS per piatto per almeno tre ore a 37 gradi Celsius. Per isolare il fegato, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, posizionare il mouse anestetizzato su un tappetino di dissezione in posizione supina e rastremare gli arti inferiori e superiori al tappetino.
Tamponare l'addome con il 70% di etanolo e fare un'incisione a forma di V dall'area pubica ad ogni erlitro. Piegare la pelle sul petto per scoprire la cavità addominale e posizionare il tappetino sotto un microscopio sezionante. Spostare l'intestino tenue e il colon in direzione caudale per esporre l'IVC e caricare una siringa da due millilitri con 2,5 millilitri di soluzione Celsius di 37 gradi C.Collegare la siringa alla cannula e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di PBS per premere il fegato fino al diaframma.
Posizionare una sutura imbevuta intorno all'IVC appena sotto il fegato. Quindi, utilizzando una siringa per insulina dotata di un ago calibro 30 piegato ad un angolo di 45 gradi, iniettare 10 microlitri di 5.000 unità per millilitro di eparina nella vena del portale. Per cannucolare il fegato, utilizzare forbici microchirurgiche per fare una piccola incisione nell'IVC direttamente accanto al fegato e inserire la cannula nell'incisione.
Fissare la cannula in posizione con suture e due nodi chirurgici e tagliare la vena porta per consentire ai tamponi perfusionali di fluire dal fegato. Quindi deprimere lentamente lo stantuffo della siringa per perfondere il fegato con due millilitri della soluzione per un periodo di circa 15 secondi. Una volta che tutta la soluzione è stata consegnata, pre-riempire una pompa peristaltica con soluzione fresca di 37 gradi Celsius C e controllare l'apparato perfusione per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel sistema.
Scollegare con cura la cannula dalla siringa e collegare rapidamente ma con attenzione il tubo della pompa peristaltica in esecuzione alla cannula. Avviare immediatamente la perfusione a una portata di 2,5 millilitri al minuto. Dopo due minuti, passare alla soluzione D e continuare la perfusione per altri 10 minuti.
Alla fine della perfusione, raccogliere con cura il fegato in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione di 37 gradi Celsius E.To isolare gli epatociti primari, tenendo il fegato per la cannula, strofinare il tessuto intorno alla parete del tubo per bussare gli epatociti nel tampone. Quando tutto il tessuto è stato schiacciato, trasferire il liquame tissutale in un colino in nylon poro da 70 micrometri per filtrare le cellule isolate in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sedimentare le cellule epatiche mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 20 millilitri del 40%Percoll in DMEM.
Separare le cellule vive e morte per centrifugazione e rimospendare il pellet in 20 millilitri di soluzione E.Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, rimospendare il pellet in 10 millilitri di soluzione fresca E per il conteggio. Dopo il conteggio, regolare il conteggio primario degli epatociti a 3,75 per 10 alle cinque cellule vitali per millilitro del mezzo di coltura degli epatociti. Per coltura gli epatociti primari isolati nei panini di collagene 3D, utilizzare una pipetta da un millilitro per distribuire uniformemente due millilitri di cellule su ogni piatto di 3,5 centimetri di diametro rivestito di collagene.
Posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Durante l'incubazione, preparare 100 microlitri di collagene neutralizzato a coda di ratto una soluzione per piatto come dimostrato. Alla fine dell'incubazione, sostituire con cura le cellule medie e non attaccate con 100 microlitri di collagene neutralizzato per piatto e riportare le piastre nell'incubatrice di coltura cellulare per un'ora.
Quando il collagene si è solidificato, aggiungere con cura due millilitri di mezzo di coltura di epatociti freschi ad ogni piatto e riportare le colture nell'incubatrice per tre o otto giorni controllando le colture ogni giorno al microscopio. Per l'immunoetichettatura degli epatociti primari all'interno dei panini di collagene 3D, lavare accuratamente ogni panino con PBS a 37 gradi Celsius e fissare le colture con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS per piatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, lavare i piatti tre volte per 10 minuti in due millilitri di PBS integrati con 0,1% Tween 20 per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule con un millilitro di glicina molare 0,1 e 0,2%Tritone X-100 in PBS per un'ora a temperatura ambiente seguito da tre lavaggi in PBS più Tween 20 come appena dimostrato. Successivamente, utilizzare una punta di carico da 10 microlitri collegata a un vuoto per disturbare delicatamente lo strato superiore di collagene e bloccare qualsiasi legame non specifico con un millilitro di albumina di siero bovino al 5% in PBS Tween per due ore. Alla fine dell'incubazione, aggiungere gli anticorpi primari di interesse diluiti nella soluzione di blocco ad ogni piatto e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, lavare i piatti con tre lavaggi di 15 minuti in PBS Tween, seguiti dall'etichettatura con gli anticorpi secondari appropriati a 37 gradi Celsius per cinque ore. Al termine dell'incubazione, lavare le colture due volte con PBS Tween e una volta con acqua distillata come dimostrato prima di montare il piatto con mezzo di montaggio anti-dissolvenza per microscopia. Entro un giorno dalla semina in panini di collagene 3D, gli epatociti primari del topo formavano cluster e si auto-organizzavano in una rete approssimativamente regolare di canaliculi biliari.
Entro tre o sei giorni, gruppi da cinque a 10 cellule sono solitamente osservati con epatociti completamente polarizzati che formano una rete canalicolare. Il trattamento con farmaci che alterano la tossina o il citoscheletro provoca cambiamenti nel citoscheletro epatocito e nella larghezza, nella forma e nel numero dei canalicoli biliari. Sebbene il trattamento con etanolo mostri solo un lieve effetto sull'organizzazione della cheratina 8, aumenta la tortuosità e la distribuzione delle larghezze canalicolari biliari.
L'intensità del segnale della colorazione ZO-1 è diminuita nei canaliculi biliari trattati con etanolo rispetto ai controlli non trattati che suggeriscono una perdita di giunzioni di tipo dopo il trattamento con etanolo. L'inibizione della contrattilità dell'actomiosina con Blebbistatin induce la formazione di canaliculi biliari disordinati, spessi e arrotondati. Inoltre, il trattamento con acido okadaico inibisce le fosfatasi che influenzano fortemente le proprietà fisiche delle cheratine e con conseguente canaliculi biliari che sono significativamente ristretti rispetto ai controlli non trattati.
Inoltre, il trattamento con etanolo eleva significativamente i livelli di alanina e amminoammina aspartato che suggeriscono gravi lesioni epatocellulari mentre il trattamento con Blebbistatin non porta ad alcuna considerazione cambiamenti nei livelli di transaminasi e il trattamento con acido okadaico innesca lievi cambiamenti biochimici nell'alanina amminotransferasi ma nessun cambiamento nell'espressione dell'amminotransferasi aspartato. È importante continuare a lavorare relativamente rapidamente durante la cannulazione e all'inizio della perfusione ed evitare che le bolle entrino nel sistema di perfusione. I llysati cellulari possono essere raccolti in pozzi duplicati per proteine di interesse per determinare se durante il trattamento si verificano cambiamenti nell'espressione proteica e/o nelle fasi di attivazione.
