Questo lavoro è stato supportato dal National Science Fund per illustri giovani studiosi (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), programma di Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Sostegno di formazione della Commissione Gaofeng medicina clinica Grant (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programma di vela di Shanghai (18YF1413000) e programma di innovazione post-laurea di Bengbu Medical College (Byycx1722). Ringraziamo il dottor Erhe Gao per il suo aiuto precedente nel nostro laboratorio.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Istituto. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschii di C57BL/6J (8-10 settimane di età). Topi sono stati alloggiati in condizioni esenti da patogeni a 24 ° C ± 4 ° C, con un ciclo luce/buio di 12 h, con libero accesso all'acqua e cibo.
1. preparazione della soluzione di Adenovirus
<ol><li>All'arrivo della soluzione purificata dell'adenovirus, conservare la soluzione in un congelatore a-80 ° C. Nota: L'iniezione dell'adenovirus è stato effettuato in topi praticabili. Per garantire la sterilità del vettore dell'adenovirus, l'adenovirus (codifica luciferasi, VDR o shRNA targeting VDR) sono stati preparati e purificato commercialmente9,10.</li>
	<li>Il giorno di apertura, estrarre la soluzione purificata dell'adenovirus (3 x 1010 placca formando unità [pfu] /mL) dal congelatore-80 ° C e scongelare l'adenovirus vettore soluzione sul ghiaccio.</li>
	<li>Mettere su una maschera facciale, guanti sterili e abito sterile.</li>
	<li>Preparare un 50-µ l siringa Hamilton che è stato sterilizzato il giorno prima dell'operazione. Nota: Per la sterilizzazione, la siringa Hamilton era avvolto in una garza e disposto in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto. È stata selezionata la modalità di "Sterilizzazione per il solido" e sterilizzazione è stato avviato premendo il pulsante "start".</li>
	<li>Dopo lo scongelamento completo della soluzione purificata dell'adenovirus, spruzzare nella provetta contenente la soluzione dell'adenovirus con 75% di etanolo e spostare la soluzione dell'adenovirus in cappa sterile a flusso laminare.</li>
	<li>In una cappa a flusso laminare sterile, aspirare 50 µ l di soluzione dell'adenovirus utilizzando la siringa senza ago, seguita da pignoramento di un ago 30g alla siringa Hamilton Hamilton.</li>
	<li>Tenere la siringa con l'ago 30g verso l'alto e spingere delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando l'ago è riempito con la soluzione dell'adenovirus (confermato dalla comparsa delle prime gocce di soluzione dalla punta dell'ago). Nota: Ci vogliono circa 45 µ l di soluzione per riempire l'ago 30g, così ora quasi nessuna soluzione è visibile nella siringa.</li>
	<li>Utilizzare la siringa preparata sopra per aspirare accuratamente un altro 30 µ l di soluzione di adenovirus e mettere la siringa senza bloccare con un massimo di sul ghiaccio per un utilizzo successivo.</li>
</ol>2. l'anestesia e la preparazione operativa
<ol><li>Aggiungere 20 mL isoflurano in un vaporizzatore di isoflurano e connettersi il vaporizzatore di isoflurane una bombola d'ossigeno.</li>
	<li>Aprire il rubinetto e lasciare che l'ossigeno flusso dal serbatoio di ossigeno per il vaporizzatore di isoflurane. Mantenere il tasso di flusso di ossigeno a 2 L/min tramite un monitor di flusso di ossigeno nel vaporizzatore isoflurano.</li>
	<li>Indurre l'anestesia del mouse con isoflurano 4% a 100% di ossigeno (2 L/min) per 2 min in una gabbia di plastica collegata al vaporizzatore di isoflurane.</li>
	<li>Estrarre il mouse anestetizzato dalla gabbia in plastica e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona in cappa sterile a flusso laminare e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% a 100% di ossigeno (2 L/min) tramite un cono di naso.</li>
	<li>Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.</li>
	<li>Applicare la crema oftalmica sterile per ogni occhio per proteggere le cornee da essiccazione.</li>
	<li>Radere il torace e l'addome superiore. Applicare la crema depilatoria commercialmente disponibile al sito rasato per 1 min, rimuovere la crema depilatoria e restanti pelliccia con garze bagnate.</li>
	<li>Sterilizzare il sito chirurgico (parte inferiore sinistra del torace) con 3 scrub di iodio-clorexidina basata antisettico (ad es. entoiodine). Coprire il sito chirurgico con un telo sterile.</li>
</ol>3. intramiocardico iniezione dell'Adenovirus nel cuore del topo
<ol><li>Togliere i guanti e mettere su un nuovo paio di guanti sterili.</li>
	<li>Sterilizzare il forcipe, un emostato micro-zanzara, un paio di forbici chirurgiche, e un porta-aghi il giorno prima dell'operazione in un'alta temperatura/alta pressione Sterilizzatore (vedi passo 1.4 Nota).</li>
	<li>Fare un'incisione della pelle 0,5 centimetri lungo la linea che collega il xifoideo e del axilla. Senza mezzi termini di sezionare le pettorali grandi e minori pettorali con pinze e una pinza emostatica micro-zanzara.</li>
	<li>Esporre gli spazi intercostali ritraendo le pettorali grandi e minori pettorali. Perforare e aprire il quarto spazio intercostale (o il più ampio spazio intercostale di osservazione) con una pinza emostatica micro-zanzara.</li>
	<li>Spingere il cuore verso l'incisione di esternare il cuore con il dito indice della mano non dominante premendo delicatamente contro il lato destro della parete di cassa.</li>
	<li>Dolcemente fissare il cuore esternalizzato con il dito indice e il pollice della mano non dominante.</li>
	<li>Iniettare un totale di 30 µ l di soluzione di adenovirus nel miocardio del ventricolo sinistro in tre siti (parete ventrale, dorsale e laterale del ventricolo sinistro) tramite la siringa Hamilton riempita con adenovirus (Figura 1) con la mano dominante.</li>
	<li>Dopo il completamento dell'iniezione, posizionare immediatamente il cuore nuovamente dentro lo spazio intratoracico.</li>
	<li>Manualmente è possibile evacuare l'aria nello spazio intratoracico premendo delicatamente la parete toracica verso il sito di incisione della pelle. Nota: Evacuazione di aria riuscita può essere evidenziato da sbattimento dei pettorali grandi e minori pettorali causate da aria espulsa.</li>
	<li>Chiudere la pelle da sutura orizzontale materasso con una sutura in seta 5-0. Nota: Le pettorali grandi e minori pettorali devono non essere suturati, perché essi sono solo senza mezzi termini dissecati e loro strutture anatomiche sono intatte nel corso dell'operazione.</li>
</ol>4. postoperatorio Management
<ol><li>Amministrare buprenorfina (3 mg/kg) due volte al giorno tramite iniezione sottocutanea per ridurre il dolore post-operatorio per le prime 48 h dopo l'operazione11.</li>
	<li>Dopo l'operazione, immediatamente mantenere i topi su una piastra di calore (37 ° C) fino a che completamente ha recuperato. Posizionare il mouse indietro alla gabbia dopo recupera completamente.</li>
	<li>Sterilizzare l'usate Hamilton siringa e l'ago della siringa 30 G in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto (vedere la nota di passaggio 1.4). Raccogliere l'ago della siringa sterile 30 G in un contenitore di sharps.</li>
</ol>5. in Vivo Imaging per la misurazione cardiaca Luciferase espressione
<ol><li>Il giorno 5 dopo l'iniezione dell'adenovirus, preparare una soluzione stock fresca di luciferina a 15 mg/mL in soluzione salina tamponato fosfato di Dulbecco (DPBS). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 µm.</li>
	<li>Intra-peritoneally iniettare i topi svegli con la soluzione di luciferina a 150 mg/kg di peso corporeo.</li>
	<li>Accendere il sistema di imaging.</li>
	<li>Dopo automatico auto-test del sistema di imaging, selezionare la modalità di imaging come "Luminescente" e definire le seguenti impostazioni: esposizione: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Eccitazione: Blocco; Emissione: aperta.</li>
	<li>A 10 min dopo l'iniezione di luciferina, anestetizzare i topi iniettando cloralio idrato (300 mg/kg di peso corporeo). Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.</li>
	<li>Fissare i topi anestetizzati su un piatto riscaldato imaging in posizione prona, con il petto diretto verso la macchina fotografica.</li>
	<li>Raccogliere immagini (1 immagine per ogni mouse) e quantificare l'intensità dei segnali dal disegno di regioni di identica misura circolare di interesse (ROI) intorno al petto.</li>
	<li>Dopo la raccolta di immagini, sacrificare i topi e raccogliere i tessuti come accennato nella sezione seguente.</li>
</ol>6. raccolta di tessuti
<ol><li>In diversi momenti dopo l'iniezione di virus (Figura 1B), anestetizzare i topi con 4% isoflurane e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% tramite un cono di naso e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona.</li>
	<li>Fare un'incisione ventrale del midline nel collo anteriore. Esporre l'arteria carotica comune di destra ritraendo i muscoli omohyoid e sternocleidomastoideo.</li>
	<li>Sacrificare i topi da sezionare l'arteria carotica comune di destra e drenare il sangue.</li>
	<li>Fare un'incisione ventrale del midline nell'addome. Tagliare le costole da entrambi i lati della gabbia toracica lungo la linea emiclaveare e transetto il diaframma.</li>
	<li>Esporre il cuore sollevando il xifoideo. Trovare l'aorta ascendente e rimuovere delicatamente il tessuto adiposo perivascolare.</li>
	<li>Incannulare l'aorta e retrogradely irrorare il cuore con un ago 30g attaccato ad una siringa da 1 mL riempita con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo aspersione, asportare il cuore e dividerlo nei ventricoli destro e sinistro. Asportare il fegato, il polmone e la milza.</li>
	<li>Dopo due lavaggi in PBS freddo (4 ° C), memorizzare tutti i tessuti raccolti separatamente in flaconcini criogenici in azoto liquido.</li>
</ol>7. determinazione dell'espressione della proteina
<ol><li>Preparare il tampone di omogeneizzazione aggiungendo cocktail inibitore della proteasi nel tampone di lisi commercialmente disponibili ad un rapporto di 1: 100. Calcola il volume totale in base al numero di campioni da elaborare. Mantenere il buffer di omogeneizzazione preparati a 4 ° C per un uso successivo.</li>
	<li>Estrarre i tessuti dal serbatoio di azoto liquido. Pesare il tessuto sulle scale di alta precisione (circa 60 mg per ogni pezzo di tessuto).</li>
	<li>Trasferire il tessuto ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Immediatamente aggiungere 200 µ l di tampone di omogeneizzazione e preraffreddate sfere d'acciaio di 1,5 mm (4 ° C) nel tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Fissare i tubi del microcentrifuge preraffreddato (4 ° c) portalampade in metallo in un tessuto automatico macchina per la frantumazione e iniziare omogeneizzazione avviando la macchina con le seguenti impostazioni: frequenza: 70 Hz; tempo: 120 s.</li>
	<li>Dopo omogeneizzazione, centrifugare l'omogeneizzato (16.000 × g, 4 ° C) e attentamente trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 mL nuova con una pipetta 100 µ l.</li>
	<li>Aggiungere carico buffer soluzione (5x) alla proteina del surnatante in un rapporto di 1:4 e denaturare la proteina a 100 ° C per 5 min.</li>
	<li>I livelli di espressione della proteina nel cuore ed altri tessuti dell'organo sono ulteriormente monitorati mediante Western blot (rappresentante risultati sono mostrati in Figura 2 e Figura 3) secondo il protocollo descritto in precedenza12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il rapporto attuale dimostra una tecnica modificata per iniezione intramiocardica di vettori virali per la manipolazione del gene cardiaco, che è stato modificato da un metodo per l'induzione di infarto miocardico da Gao et al. 13 attualmente, in vivo caratterizzazione delle funzioni dei geni specifici più spesso coinvolgono la generazione di Ko o topi transgenici3,14,15,<su...

La malattia cardiaca è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo1,2. La mancanza di strategie terapeutiche efficaci per circostanze life-threatening di cuore compreso l'infarto miocardico e insufficienza cardiaca attira intensa esplorazione di pathomechanisms sottostante e l'identificazione di nuove opzioni terapeutiche3. Per queste esplorazioni scientifiche, manipolazione del gene specifico è ampiamente usato4,5. Manipolazione del gene cardiaco può essere ottenuta utilizzando la nucleasi di attivatore-come effettore potente trascrizione (TALEN) l'editing genomico e cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) strumenti, o di consegna del materiale genetico ectopici (ad es., vettori del virus portatori di geni che codificano per le proteine di interesse)6. Se l'editing genomico permette modifiche precise e spaziotemporali genoma in topi vivi, è ancora una pratica molto tempo e laborioso6. In alternativa, la manipolazione del gene specifico di vettore del virus o interferire piccolo consegna complesso RNA (siRNA) sono regolarmente eseguita6.
Consegna di vettore di virus nel cuore di topo adulto è raggiunto da circa due strategie: iniezione sistemica o locale. Iniezione sistemica di cardiotropi sierotipo di adenoassociati come AAV9 è non invadente per gene specifico cardiaco manipolazione7. Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente alta di vettore necessarie per trasduzione efficiente e l'espressione genica e può provocare significative trasduzione del nontarget organi quali il muscolo e fegato7. Iniezione di virus locale avviene mediante iniezione intramiocardica o intracoronary consegna7. Consegna intracoronary conduce ad una distribuzione più uniforme del virus all'interno del cuore rispetto all'iniezione intramiocardica. Tuttavia, gli svantaggi di questa tecnica sono il lavaggio rapido fuori di vettori virali per la circolazione sistemica e la trasduzione in organi del nontarget8e relativo requisito di dispositivi per la misurazione della pressione durante il funzionamento. Al contrario, consente di iniezione intramiocardica migliore ritenzione del virus nel miocardio nonché consegna sito specifico, ma non riesce a distribuire uniformemente virale vettore7. Piccoli animali, consegna intracoronary è tecnicamente difficile da eseguire, mentre sistemica AAV9 iniezione e iniezione intramiocardica sono più comunemente praticato4,5,7. Anche se iniezione sistemica è facile da eseguire, iniezione intramiocardica convenzionali richiede la toracotomia e la ventilazione meccanica, provoca vasto danno di tessuto e richiede tempo.
In questo rapporto, abbiamo descritto un metodo facile, risparmio di tempo e altamente efficiente per iniezione intramiocardica. L'adenovirus codifica luciferasi e VDR o shRNA VDR, il targeting è stato iniettato per modificare l'espressione genica cardiaco. Una volta imparato, questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali nel cuore del mouse.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

Manipolazione del gene specificamente nel cuore potenziare significativamente l'inchiesta di malattia cardiaca pathomechanisms e loro potenziale terapeutico. In vivo consegna specifico gene comunemente viene ottenuta tramite consegna o sistemica o locale. Iniezione sistemica tramite vena caudale è facile ed efficiente nel manipolare l'espressione genica cardiaca utilizzando virus adeno-associato ricombinante 9 (AAV9). Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente elevata di vettore per la trasduzione efficiente e può provocare la trasduzione del gene di organo del nontarget. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e risparmio di tempo di iniezione intramiocardica per in vivo manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia (senza ventilazione), senza mezzi termini sono stati sezionati i muscoli pettorali maggiori e minori, e il cuore del topo è stato rapidamente esposti dal manuale esternalizzazione attraverso una piccola incisione presso il quarto spazio intercostale. Successivamente, l'adenovirus codifica luciferasi (Luc) e del recettore della vitamina D (VDR) o short hairpin RNA (shRNA) VDR, il targeting è stato iniettato con una siringa Hamilton nel miocardio. Successivi in vivo imaging ha dimostrato che quel luciferase era correttamente overexpressed in particolare nel cuore. Inoltre, l'analisi Western blot ha confermato la sovraespressione di successo o silenziamento di VDR nel cuore del mouse. Una volta imparato, questa tecnica può essere utilizzata per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali quali nanogel nel cuore del mouse.

Il protocollo di esperimento e alcuni dei passaggi chiavi per il metodo segnalato sono mostrati nella Figura 1. 5 giorni dopo l'iniezione intramiocardica di luciferasi codifica dell'adenovirus (Adv-luc), in vivo imaging in adv-luc iniettato topi indicato robusta sovraespressione di luciferasi specificamente nel cuore (Figura 2A, B), che era confermato da analisi Western blot (Figura ...

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K Views.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Ricerca

Medicina

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genetica

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Biologia dello sviluppo

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autore in primo piano: Transgenesi delle cellule cardiache per lo screening genico rapido

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Legatura dell'arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing