Ringraziamo il Magdi Yacoub Institute (MYI) per supportare l&#39;analisi di microscopia e progetti che coinvolgono riparazione cardiaca, i tecnici e il Direttore del nostro stabulario. Questo lavoro è stato sostenuto dalla British Heart Foundation (BHF), Progetto a PG/10/019. MPS è supportato dal MYI e BHF. TP è un BHF-Research Excellence Fellow. NR è un NH &amp; MRC in Australia Fellow.

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità internazionale (direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo) e nazionale (UK Home Office, Act del 1986) regolamenti. Le procedure qui descritte sono parte del nostro piano di lavoro sotto licenza autorità britanniche e non sono state intraprese a fini di registrazione. 1. Preparazione di cellule Questo protocollo descrive la preparazione di una linea cellulare specifica (rene embrionale umano, cellule HEK293) a scopo dimostrativo. Protocolli specifici di cellule devono essere impiegate per la coltivazione e alla fine differenziazione delle cellule staminali pluripotenti o adulte in linee cellulari specifici. <ol><li> Crescere le cellule in DMEM supporti (alto glucosio, 4.500 mg / L) contenente 1% di sodio piruvato, glutammina 2 mM, 1% antibiotico Pen / Strep e 10% siero fetale bovino (FBS). Un piatto di 10 centimetri dovrebbe essere normalmente diviso a 1:3 e mezzi completato fresco ogni due giorni. </li><li> Il trattamento di cellule leggermente con trypsin 1x e risospendere in mezzo DMEM come descritto in 1:1. </li><li> Contare le celle in una camera emocitometro e raccogliere 3 x 10 6 cellule in un tubo separato. </li><li> Centrifugare in un rotore secchio swing a 100 g per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con tampone fosfato sterile 2x. </li><li> Risospendere in PBS 1x ad una concentrazione di 10 6/50 pi per iniezione nel ventricolo sinistro del mouse immunodepleto. </li></ol> 2. Condizioni presurgical <ol><li> Mantenere topi immunodepleto (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) con palline sterili di cibo e acqua in un isolatore a temperatura controllata (22 ° C; Tabella 1) prima di ogni intervento chirurgico. </li><li> Eseguire un intervento chirurgico di topi immunodepleto sotto una cappa a flusso laminare. Pulire l&#39;area di lavoro con il 70% di etanolo e autoclave strumenti chirurgici (pinze e forbici). </li><li> Accendere rilievi di riscaldamento per la chirurgia e per il recupero. Rilievi di riscaldamento sono importantiper bloccare la diminuzione della temperatura corporea si verificano durante e dopo la chirurgia. </li><li> Mettere una gabbia pulita e autoclavato sulla rampa di recupero-riscaldamento. </li><li> Trasportare i topi nelle loro gabbie originali del sezionatore in sala operatoria in un sacchetto autoclavato sterile. </li><li> Pesare il mouse e in base al peso corporeo iniezione sottocutanea (sc) una soluzione contenente medetomidina e ketamina cloridrato diluito in soluzione salina sterile allo 0,9% per anestetizzare il mouse, come pure per rilassare la muscolatura (medetomidina 1 mg / kg; ketamina cloridrato 75 mg / kg). </li><li> Rimuovere il mouse dalla gabbia quando completamente anestetizzato (entro 1-2 minuti, nessun riflesso toe-pinch dopo stimolazione) </li><li> Applicare crema depilatoria sul lato sinistro del petto e la zona della gola. Dopo un congruo periodo di tempo (circa 2-5 minuti), rimuovere i capelli sciolti con un panno bagnato in acqua. </li><li> Posizionare il mouse sul pannello chirurgia in posizione supina. Dapunto di vista del chirurgo la posizione è verticale, coda verso il basso-testa. </li><li> Iniettare la soluzione analgesica a 0,1-0,2 mg / g diluito in soluzione fisiologica sterile (buprenorfina) nel sottocute arto posteriore e coprire la zona rasata con l&#39;asettica iodio povidone soluzione utilizzando un cotton-fioc. </li><li> Mettere a fuoco il microscopio (obiettivo 2.5X) sulla zona della gola. </li></ol> 3. Condizioni chirurgici <ol><li> Con le forbici spuntate fanno una linea mediana incisione cutanea ventrale di circa 0,5-1 cm di lunghezza leggermente al di sotto della cartilagine cricoide. Separare la pelle dal tessuto connettivo per visualizzare le ghiandole salivari. </li><li> Dividere le ghiandole salivari sulla loro divisione mediana naturale tirando contemporaneamente ogni lateralmente parte con pinza e magnetico divaricatore toracico ed esporre la trachea. </li><li> Tirare la lingua dolcemente verso il lato per esporre la laringe. Far scorrere il tubo di intubazione con cautela nella trachea. La punta del tubo è visibile attraverso il l visualizzatoarynx e trachea. È importante sottolineare che, se il tubo è in, ma non chiaramente visibile, è nell&#39;esofago. Rimuovere e cambiare la posizione della punta del tubo. </li><li> Collegare il tubo alla macchina di ventilazione. Impostare il volume della corsa a 200 ml e 150 ictus / min. Fissare il tubo di ventilazione sul pannello chirurgia con un nastro. </li><li> Con le forbici smussate e pinze, fare una coda verticale a testa 1 - 1,5 cm a lunga incisione cutanea sopra la zona torace sinistro. </li><li> Allentare la pelle dagli strati di tessuto / muscolari connettivo e delle maggiori e minori muscoli pettorali senza incisioni. </li><li> Eseguire toracotomia tra la terza e la quarta costola come segue: <ol><li> Perforare lo strato muscolare intercostale da pizzicare e graffi con le piccole, pinze arrotondate. </li><li> Una volta che lo strato di muscolo intercostale è perforato, posizionare il divaricatore petto per aprire al massimo la cavità toracica. Le parti superiori e medie del ventricolo sinistro (LV) con il suo padiglione auricolare sovrastante (atrio) sonoora visibile. </li></ol></li><li> Preparare una siringa di precisione con le cellule. La siringa deve essere in grado di erogare una quantità di volume di 10 ul per ogni iniezione. Cast un ago G 30 sulla punta della siringa. </li><li> Fissare con nastro una piccola cannula di plastica (da un introcan-W 20 G) sul ferro, lasciando esposto 1 mm compresa l&#39;estremità aperta dell&#39;ago. Ciò evitare che l&#39;ago perforante tutta la parete del ventricolo sinistro e iniettando le cellule nella cavità ventricolo sinistro. </li><li> Con l&#39;aiuto di un obiettivo 5X, visualizzare in questo ingrandimento del ventricolo sinistro e iniettare le cellule nella parete ventricolare sinistra in 5 posizioni differenti (ogni iniezione fornirà 10 ul per un totale di 106 cellule iniettata). Se l&#39;iniezione è successo, una superficie bianca e l&#39;assenza di importanti controlavaggio delle cellule saranno visibili (se l&#39;iniezione non ha avuto successo, l&#39;animale sarebbe escluso da analisi funzionale). </li><li> Rimuovere il divaricatore. Chiudere la parete toracica by allegando i due costole separate con due punti di sutura di seta 6-0. </li><li> Idratare i muscoli pettorali e la pelle con una punta di cotone intriso di PBS 1x e delicatamente mettere i muscoli della schiena nella posizione originale con le pinze. </li><li> Chiudere la pelle con 3-4 punti di sutura di seta 6-0. Suturare l&#39;incisione della gola con 2-3 punti di sutura per chiudere la pelle. </li><li> Iniettare atipamezolo (1 mg / kg concentrazione finale) per ripristinare gli effetti anestetici. </li><li> Non appena il topo inizia a respirare autonomamente, estrarre il tubo dalla trachea e mettere il mouse sul lato destro. Il mouse si prevede di recuperare in pochi minuti. </li><li> Quando il mouse comincia a girare e camminare, metterlo in gabbia recupero calda (piccola gabbia IVC, con chiusura superiore filtrata) per un&#39;ora. </li><li> Lasciare gli animali durante la notte in una scatola riscaldata controllata (37 ° C). </li><li> Riempire un piatto con acqua e cibo pellet per sostenere la ripresa durante i primi due giorni dopo l&#39;intervento. </li></ol> Dieci cuori iniettati con cellule e 10 di controllo cuori non iniettati sono analizzati istologicamente come segue: <ol><li> Eseguire analisi delle cellule innestate 1 settimana dopo l&#39;iniezione (figure 1 e 3). <ol><li> Dopo l&#39;eutanasia per overdose di isoflurano, profumato i cuori con 20 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) per fissare il tessuto. Disidratare il tessuto fissato in percentuali crescenti di etanolo (dal 70-100%) e incorporare in blocchi di paraffina. </li><li> Sezione cuori in paraffina con un microtomo a 5 micron e macchia con ematossilina ed eosina per l&#39;analisi morfologica. </li><li> Visualizza tessuto connettivo mediante colorazione tricromica di Masson. </li><li> Analizzare le immagini al microscopio scanner per diapositive (Figure 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizzare l&#39;intero cuore in asse corto utilizzando un microscopio scanner per diapositive digitali (Figures 1B e 1C). </li></ol></li><li> Dopo le analisi di cui sopra, Deparaffinare i tessuti cardiaci in xilene, reidratare immergendo esemplari discendente percentuali di etanolo (dal 100% acqua) e di processo per microscopia elettronica a scansione (SEM) come segue: <ol><li> Incubare blocchi deparaffinate con 1% di acido tannico in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora. </li><li> Disidratare i campioni in percentuali crescenti di etanolo (25-100%). </li><li> Campioni secco con HMDS (esametildisilazano). </li><li> Montare gli esemplari di Stubbs con Acheson Argento Dag e cappotto con oro-palladio. </li><li> Visionare campioni in modo analitico microscopio elettronico a scansione (Figura 2B). </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, abbiamo mostrato come eseguire intramiocardico iniezione di cellule nei cuori murini. Come prova di questa metodologia, abbiamo utilizzato cellule HEK293. E &#39;importante sottolineare che le cellule HEK293 non vengono utilizzate in studi di terapia cellulare e, pertanto, i risultati di questo manoscritto non sono appropriati per la traduzione diretta di un approccio terapeutico. Tuttavia, il fatto che le cellule HEK293 non sono cellule contrattili e non transdifferenziare in altri tipi cellulari...

Vari protocolli di recapito cella sono stati testati in modelli murini e ratto di malattie cardiovascolari con l&#39;obiettivo di tradurre l&#39;efficienza, l&#39;efficacia e la sicurezza di questa procedura sperimentale in pazienti umani. In piccoli cuori roditori, la consegna delle cellule intramiocardico è il metodo più fattibile di consegna delle cellule 1,2, mentre nel anterograda cuore di ratto 3 e retrograda 4 intracoronarica infusione di cellule può essere utilizzato anche. Entrambi i metodi hanno dei limiti e vantaggi. Invio delle cellule per via intracoronarica presenta vantaggi rispetto iniezione intramuscolare diretta nel promuovere la diffusione cella globale 3, ma ha anche il rischio di causare embolia coronarica 3,5. Limiti di consegna intramiocardico sono associati a danni meccanici, infiammazione acuta, e infarto del danno 6,7. Negli esseri umani, cellule per la riparazione cardiaca sono forniti da iniezione intramiocardico attraverso un epicardico endocardiaca o chirurgicaavvicinarsi o per via arteriosa intracoronarica 8. Iniezione per vie transvascolare è adatto nei pazienti con infarto miocardio acuto e riperfusione, ma potrebbe non essere possibile nel caso di occlusioni totali o scarsa flusso all&#39;interno dei vasi del territorio effettuata 9. Iniezione diretta nella parete ventricolare mediante iniezione transendocardial o transepicardial è tecnicamente fattibile a seconda dello stato di salute del paziente. Infatti, è stato dimostrato che questa tecnica è sicura 10,11, sebbene iniettabile transepicardial è necessario un intervento chirurgico a torace aperto e per transendocardial avvicina una mappatura elettrofisiologica per ciascun paziente è necessario differenziare siti di vitale ischemica o sfregiato miocardio 9. È importante sottolineare che in studi di terapia cellulare la scelta della migliore cella da trapiantare è ancora oggetto di indagine. Analisi a breve termine (4 settimane) hanno mostrato che l&#39;iniezione di cellule staminali cardiache definite come cardiosfere <sup&gt; 12 o cellule di popolazione lato dal midollo osseo 13 indotta recupero funzionale cardiaca in murini 14 e ratto 15 modelli di infarto del miocardio diminuendo le dimensioni della cicatrice e la morte cellulare. Il trapianto allogenico di cardiosfere in un topo modello di infarto infarto senza immunosoppressione è stato trovato per essere sicuro, ha promosso la rigenerazione cardiaca, e migliorato la funzione del cuore attraverso la stimolazione dei meccanismi di riparazione endogena 15. Lin-/c-kit + adulte cellule progenitrici nel cuore hanno dimostrato di essere auto-rinnovano, clonogenica, e multipotenti in vitro e in vivo, e quando iniettato in un cuore ischemico ratto ricostituito ampie porzioni della parete miocardica ferito 16 e aveva l&#39; capacità di formare conduttivo e di dimensione intermedia arterie coronarie 17. Questi dati promettenti alimentato fase I e II di sviluppo clinico nell&#39;uomo: l&#39;iniezione di cellule staminali mesenchimali autologhe e allogeniche (MSC) 18, cardiosfere 19o c-Kit positivi cellule staminali cardiache (CSC) 20 nei cuori umani ischemici ogni hanno mostrato effetti benefici in funzione cardiaca in studi a lungo termine. Tuttavia, la vasta follow-up a lungo termine e retrospettiva meta-analisi hanno dimostrato che la terapia con cellule staminali offre benefici significativi per alcuni pazienti, ma non in altri con una serie di risultati imprevedibili 21. E &#39;possibile che queste limitazioni richiederanno la progettazione di specifici protocolli di consegna delle cellule per ogni individuo e ogni malattia. Nei modelli topi e ratti, studi a lungo termine hanno rivelato che l&#39;iniezione di cellule non migliora ulteriormente la funzione cardiaca (12 mesi). Infatti, innesti di cardiomiociti staminali embrionali umane derivate da cellule (hESC-CM) sono stati in gran parte isolate dal miocardio ospite da uno strato di tessuto fibrotico 22,23. Risultati simili sono stati osservati dopo il trapianto di mioblasti scheletrici intramiocardico nel cuore di topi infartuati 24. Furthermore, la capacità a lungo termine di MSC allogeniche per conservare la funzione nel cuore infartuato è stato limitato dal passaggio da un immunoprivileged ad uno stato immunogenica dopo la differenziazione 25. Prendendo in considerazione le sfide e le prospettive di cui sopra, vi mostriamo qui come consegnare le cellule mediante iniezione intramiocardico nei topi. Osserviamo che le cellule senza cardiomiociti proprietà contrattili non sono collegati con il miocardio host e una massa coesiva con una barriera fibrotica sottile. Anche se in alcuni casi questo risultato può essere vantaggioso, la seguente analisi può essere utile per capire come attecchimento delle cellule può essere modulata per generare strutture del miocardio funzionalmente collegate pure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Precedenti studi hanno dimostrato che la consegna delle cellule promuove la funzione cardiaca miglioramento da rilascio di citochine e fattori che aumentano la rivascolarizzazione del tessuto cardiaco e la sopravvivenza cellulare. Inoltre, ulteriori osservazioni rivelato che le cellule staminali specifici, come le cellule staminali cardiache, cellule staminali mesenchimali e cardiosfere hanno la possibilità di integrare nel miocardio circostante differenziando in cardiomiociti, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. Qui vi presentiamo i materiali ei metodi per fornire in modo affidabile le cellule noncontractile nella parete del ventricolo sinistro del mouse immunodepleto. Le fasi salienti di questa procedura microchirurgica coinvolgono l&#39;anestesia e analgesia iniezione, intubazione endotracheale, incisione per aprire la cassa ed esporre il cuore e la consegna di cellule da un ago sterile da 30 gauge e una siringa di precisione microlitro. Trasformazione del tessuto costituito da raccolta cuore, embedding, sezionamento e colorazione istologica ha mostrato che l&#39;iniezione di cellule intramiocardico prodotto un piccolo danno nella zona epicardico, nonché nella parete ventricolare. Noncontractile cellule sono state mantenute nella parete miocardica di topi immunocompromessi ed erano circondati da uno strato di tessuto fibrotico, probabilmente per proteggere dalla pressione cardiaca e carico meccanico.

Abbiamo iniettato HEK293 cellule, che sono distinguibili dalle cellule del cuore per la loro diversa morfologia (figura 1), con una forma di ciottoli rispetto ai cardiomiociti allungati (Figura 1A). Cellule HEK293 sono stati più reattivi a ematossilina colorante (colore blu) rispetto ai cardiomiociti (colore rosa), probabilmente a causa del loro elevato contenuto di nucleare (Figura 1A). Per distinguere ulteriormente le cellule iniettate dal tessuto ospite, cellule HEK...

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Consegna cellula intramiocardico in modelli murini di malattie cardiovascolari, come ipertensione o infarto del miocardio, è ampiamente utilizzato per testare il potenziale terapeutico di diversi tipi di cellule in studi rigenerativi. Pertanto, una descrizione dettagliata e una chiara visualizzazione di questa procedura chirurgica contribuiranno a definire i limiti ei vantaggi di cellule cardiovascolari analisi terapeutici in piccoli roditori.

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Views.  Imperial College London.  Consegna cellula intramiocardico in modelli murini di malattie cardiovascolari, come ipertensione o infarto del miocardio, è ampiamente utilizzato per testare il potenziale terapeutico di diversi tipi di cellule in studi rigenerativi. Pertanto, una descrizione dettagliata e una chiara visualizzazione di questa procedura chirurgica contribuiranno a definire i limiti ei vantaggi di cellule cardiovascolari analisi terapeutici in piccoli roditori. 

Video: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

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Medicina

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Riduzione del ventricolo sinistro stress di parete e di miglioramento della funzione in mancanza di Cuori con Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modello murino di dall&#39;arteria femorale Wire Injury con impianto di una Perivascolare Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Affettare e coltivare i cuori di maiale in condizioni fisiologiche

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Consegna intramiocardica ritardata di cellule staminali dopo l'infortunio di ricottamento ischemia in un modello Murine

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Trapianto intramiocardico di idrogel iniettabili a carico MSC dopo infarto del miocardio in un modello murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...