Questa ricerca è stata finanziata dall'Istituto nazionale per generale Medical Science (NIGMS) (5605100122001), un componente del National Institutes of Health (NIH), così come Università del Nebraska a Kearney (UNK) estate studente ricerca programma (SSRP) e UNK Borsa di ricerca dello studente non laureato (URF).

1. preparazione di coloranti, buffer e Gel di agarosio
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni per la colorazione del DNA o la digestione del DNA macchiato.
	<ol>
<li>Preparare 1 x TE (Tris-HCl e acido etilendiamminotetraacetico acido; Soluzione tampone dell'EDTA) con 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA in un cilindro graduato o matraccio tarato. Conservare a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Rendere le aliquote di ogni tintura: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabella 1). 4 µ l di colorante di 1 mM in ambra scuro o 1,5 mL tubo nero e 36 µ l di 1 x TE, mescolare con la pipetta; Questa concentrazione rende una soluzione di tintura di 100 µM (40 µ l totale). Completare questo passaggio per ogni colorante. Conservare a 4 ° C. Nota: Evitare di esporre la tintura alla luce per prevenire photobleaching o degradazione del colorante.</li>
		<li>Preparare il tampone 1 utilizzando Bis-Tris-propano-HCl 10 mM, 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL di sieroalbumina bovina (BSA). Preparare 2 utilizzando 50 mM NaCl, tampone Tris-HCl 10 mM, 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL BSA. Preparare il tampone 3 utilizzando 50 mM acetato di potassio, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA. Ogni enzima avrà bisogno di uno di questi buffer specifici per funzionare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le seguenti soluzioni per elettroforesi del gel.
	<ol>
<li>Fare un 6x loading dye combinando bromofenolo 0,25% blu, 0,25% xilene cianolo, 15% Ficoll in dH2O. Store a temperatura ambiente.</li>
		<li>Per rendere un'agarosi 0,7% gel, pesare 0,07 g di agarosio gelificante alta di temperatura (HGT) in un matraccio di Erlenmeyer, aggiungere 100 mL di 1 x TAE tampone e porre un becher invertito in cima al pallone.<ol>
<li>Riscaldare la soluzione su un piatto caldo fino a quando le bolle cominciano a formarsi sul fondo della boccetta e galleggiante verso l'alto.</li>
			<li>Rimuovere la soluzione da piastra calda, lasciare raffreddare la soluzione fino a quando il pallone può essere toccato con una mano nuda e poi versare il gel in uno stampo di gel 24,5 cm x 21,8 cm con un pettine di gel per creare pozzi.</li>
			<li>Rimuovere le bolle vicino il pettine o sulla superficie del gel dal popping loro con un puntale e lasciare che il gel a solidificare per almeno 15 minuti. Questo può essere memorizzato in un frigorifero (4 ° C) avvolto in involucro di plastica per 1 settimana evitare l'essiccazione del gel o contaminazione. Per ulteriori informazioni su come eseguire un gel riferirsi a Lee et al. 33 . Nota: Utilizzare un pettine di gel con 30 singoli pozzetti. Beh ognuno dovrebbe essere 4,5 mm di larghezza con una profondità di 2 mm. L'altezza del pozzo dipenderà la quantità di gel versato nella casella.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 1 tampone x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizzando 40 mM Tris-HCl, acido acetico 20 mM e 1 mM EDTA. Conservare a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del DNA macchiato
<ol><li>
Macchia del DNA di lambda (300-800 ng) utilizzando differenti aliquote di coloranti. Ogni tintura (tabella 1) avrà sei differenti concentrazioni testate, per un totale di 48 reazioni a enzimi di limitazione. Il processo seguente delinea un set up per 1 reazione (Figura 1).
	<ol>
<li>Diluire il DNA di lambda usando 1 x TE a 100 ng / µ l. Conservare a 4 ° C. Fare una soluzione con un volume totale di 300 µ l.</li>
		<li>Macchia del DNA di lambda non metilato. Per ogni banda previsto dal digest, stimare 75-100 ng/band. Aggiungere la quantità appropriata di tintura per produrre concentrazioni di 1,9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng di DNA.</li>
		<li>Incubare per una notte (15h - 18h) a 4 ° C.</li>
		<li>Lasciare una reazione senza macchia per agire come un controllo25. Nota: Utilizzare non metilato del DNA per la reazione di digestione. Enzimi sensibili di metilazione non possono tagliare regioni metilate di DNA e daranno un aspetto di una digestione incompleta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione del dosaggio degli enzimi di limitazione
<ol><li>
Digest macchiato del DNA con un enzima di limitazione per determinare se questo enzima può digerire precolorato DNA (Figura 1).
	<ol>
<li>Il giorno seguente, aggiungere 20 U di enzima di restrizione, 3 µ l di buffer appropriato (tabella 2) e acqua distillata, acqua filtrata e sterilizzati in autoclave per un totale di 30 µ l. Per ogni reazione enzimatica, scegliere il buffer con la massima efficienza di taglio, che può essere trovata sul sito Web del produttore.</li>
		<li>Porre le reazioni in un bagno di acqua alla temperatura di attività enzimatica ottimale, elencati nella tabella 2 per 6 enzimi utilizzati nella Maschmann et al., per 2-4 h (tabella 2)25.</li>
		<li>Fermare la reazione aggiungendo 2 µ l di 0,5 M EDTA, pH 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting macchiato del DNA in un Gel di agarosio
<ol><li>Rimuovere i lati dallo stampo gel 24,5 cm x 21,8 cm (punto 1.2.2) e inserire la vaschetta di elettroforesi del gel il gel. Versare 2,5 L di 1 x TAE tampone nella casella. Rimuovere attentamente il pettine di gel il gel, così i pozzi sono accessibili33.</li>
	<li>Pipettare le reazioni degli enzimi di limitazione su una pellicola di plastica e combinare ogni reazione con 6x loading dye. Per ogni soluzione di reazione, aggiungere 1 µ l di 6x loading dye per 5-6 µ l di soluzione di DNA (1x). Pipettare quindi le reazioni (contenente la tintura di caricamento, < 18 µ l) nei pozzetti.</li>
	<li>Mescolare 1 µ l di 1 kb ladder, 9 µ l di 1 x TE e 2 µ l di 6x loading dye. Caricare la soluzione nei pozzetti che fiancheggiano le altre soluzioni.</li>
	<li>Coprire la vaschetta del gel con carta scura blu o nero o tessuto. Collegare la vaschetta del gel alla rete di alimentazione, impostare l'alimentazione a 30 V ed eseguirlo durante la notte (15-20 h). Spegnere le luci, mentre il gel è in esecuzione, per evitare photocleavage del DNA con etichettato.</li>
	<li>La mattina successiva disattivare l'alimentazione. Prendere il gel utilizzando il vassoio e trasferirlo in un contenitore con 45 il bromuro di etidio µ l e 1 L di 1 x TAE tampone. Conservare il contenitore a temperatura ambiente al buio o copertina in carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce. Lasciate che la macchia per almeno 45 minuti a temperatura ambiente in gel. Attenzione: Utilizzare il bromuro di etidio con guanti e occhiali di protezione. Quando si pulisce il contenitore contenente soluzione di bromuro di etidio e gettando via il gel, consultare le linee guida di smaltimento tuo stati per determinare come trattare con bromuro di etidio usati; Inoltre, altre macchie possono essere utilizzati invece di bromuro di etidio.</li>
</ol>5. il Gel di agarosio di imaging
<ol><li>Collocare il gel su un transilluminatore luce blu, che emette la massima resa luminosa tra 400-500 nm. Scattare foto con la fotocamera collegata alla stazione. Attenzione: Assicurarsi di utilizzare il coperchio per l'illuminatore e indossare occhiali protettivi prima di attivare la sorgente di luce. Nota: Questo passaggio può essere completato anche utilizzando qualsiasi sorgente di luce UV o uno scanner standard del gel.</li>
	<li>Visualizza le immagini di ImageJ trascinando il file per la barra di stato di ImageJ e l'immagine si aprirà.</li>
	<li>Determinare il tasso di digestione per l'esperimento confrontando le bande sul gel per il modello di gel previsto in silico . Per determinare il tasso di digestione, il numero di band sperimentali è diviso per il numero atteso di DNA bande24,25. Se il modello di band DNA digerito sperimentale ha il modello previsto, il tasso di digestione è 1. Se il modello ha frammenti di più del previsto, il tasso di digestione è maggiore di 1. Se il modello ha meno frammenti del previsto, il tasso di digestione è minore di uno.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per digerire fluorescente contrassegnati del DNA (Figura 1), una serie di passaggi sono necessari. In primo luogo, il DNA è macchiato con un fluorocromo durante la notte. DNA può essere incubato con dimeri cianina per un breve periodo di tempo; Tuttavia, Carlsson et al trovato che DNA creato bands doppie per ogni dimensione del DNA a causa di colorazione incompleta20. Per risolvere questo problema, il DNA può essere macchiato durante la no...

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 e BOBO-3; Tabella 1) è utilizzata in un'ampia varietà di esperimenti dove la visualizzazione del DNA è richiesto1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famiglia di dimero cianina è ampiamente usata a causa del loro rendimento quantico, sensibilità e alta affinità per il DNA molecole18,19,20. Cianina dimero tinture hanno grande selettività per il DNA a doppio filamento e quando intercalate hanno un aumento di 100 a 1000 volte di fluorescenza21. Piridinio coloranti (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 e TOTO-3) hanno una lunghezza d'onda di emissione che loro quinolium tingere (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 e POPO-3) controparti (tabella 1)22. Inoltre, è alto il rendimento quantico per dimeri cianina intercalato nel DNA (0.2 - 0.6)22. Tuttavia, usando un enzima per determinare il profilo di metilazione di una molecola di DNA2 o tratto23 di una molecola di DNA già macchiata con colorante fluorescente richiede un metodo per determinare quali enzimi saranno digerire DNA macchiato. Qualsiasi tipo di colorante che si intercala nel DNA o qualsiasi enzima che dà un modello distinguibile del substrato del DNA può essere utilizzato per questo metodo.
Meng et al. in primo luogo determinato il tasso di digestione del DNA precolorato attraverso elettroforesi del gel usando una varietà di differenti tinture24. Maschmann et al ha ricercato nel più profondo di guardare la famiglia TOTO di coloranti. Sia determinato il tasso di digestione del DNA macchiato per vedere se DNA tinto con un colorante specifico potrebbe essere digerito con un enzima di restrizione25. Altri metodi di studio effetti vincolanti di coloranti intercalate con DNA usando la pinzetta ottica26 o NMR27. Entrambi i metodi richiede attrezzature specializzate; mentre questo metodo consente di apparecchiature che hanno maggior parte dei laboratori di biologia molecolare per determinare se un colorante interferisce con una digestione degli enzimi di limitazione.
Inoltre, in altri metodi per misurare la lunghezza di una data molecola, mappatura ottico ha molecole di DNA non colorati su una superficie di forma allungata e digerito il DNA per determinare il tratto e le dimensioni dei frammenti. Intercalazione di tintura ha dimostrato di aumentare la lunghezza del contorno di molecole di DNA fluorescente macchiati e a seconda del colorante usato, le lunghezze di contorno sono diversi21. Questo metodo è stato utilizzato in una varietà di genomi1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Tuttavia, se le molecole sono state pre-tinto, a seconda del colorante e l'enzima, l'enzima può non essere in grado di tagliare il DNA colorato con un colorante specifico. Pertanto, questo metodo determina se DNA tinto con un colorante specifico può essere digerito con un enzima. Inoltre, a seconda della concentrazione del colorante e la tintura utilizzata, la mobilità del DNA bande in un gel migrerà più lentamente del DNA nativo a causa lo svolgimento parziale della spina dorsale del DNA per fare spazio per la tintura da inserire tra coppie di basi32 .
Tuttavia, a volte questi coloranti possono parzialmente o completamente per inibire l'azione di alcuni enzimi di restrizione7,24. Ciò è probabilmente dovuto ad un cambiamento strutturale nel DNA causato tramite il collegamento della tintura fluorescente, che può impedire l'enzima di riconoscere la sua sequenza specifica. Comprendere come queste tinture influenzano gli enzimi di limitazione può aiutare negli esperimenti dove è richiesto il profilo di metilazione o il tratto di DNA macchiato.
Nel nostro metodo, DNA è stato macchiato con un fluorocromo di interesse e si digerisce con un enzima di restrizione. Quindi il DNA è stato electrophoresed su un gel, imaging, ed è stato misurato il tasso di digestione degli enzimi di limitazione. Gli enzimi di restrizione sono stati scelti in base al modello di taglio su un gel. Troppe fasce causato sovrapposizione delle bande di DNA e troppo poche band non ha dato un quadro completo della molecola del DNA. C'è un posto dolce per essere in grado di determinare il profilo della molecola del DNA digerito; Pertanto, essa dipenderà il DNA usato e l'enzima. Un vantaggio di questo metodo è la sua semplicità; richiede solo attrezzature utilizzate in una restrizione digestione ed elettroforesi su gel.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualizzazione del DNA per la microscopia di fluorescenza utilizza una varietà di coloranti come cianina coloranti. Questi coloranti sono utilizzati a causa della loro alta affinità e sensibilità per il DNA. Al fine di determinare se le molecole di DNA sono integrale dopo il completamento dell'esperimento, è necessario un metodo per determinare se le molecole macchiate sono integrale dalla digestione del DNA con enzimi di restrizione. Tuttavia, macchiato DNA può inibire gli enzimi, quindi è necessario un metodo per determinare quali enzimi si potrebbe utilizzare per fluorocromo macchiato del DNA. In questo metodo, il DNA è macchiato con una tintura di cianina durante la notte per consentire la tintura e il DNA per equilibrare. Prossimo, tinto il DNA è digerito con un enzima di restrizione, caricato in un gel ed electrophoresed. La band di digerire DNA sperimentali vengono confrontate con un digest in silico per determinare l'attività degli enzimi di limitazione. Se c'è lo stesso numero di bande come previsto, la reazione è completa. Più del previsto indicare digestione parziale e meno bande indicano la digestione incompleta. Il vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e utilizza attrezzature che uno scienziato avrebbe bisogno per un enzima di limitazione di analisi e di elettroforesi del gel. Una limitazione di questo metodo è che gli enzimi disponibili per la maggior parte degli scienziati sono enzimi commercialmente disponibili; Tuttavia, potrebbe essere utilizzati qualsiasi enzimi di restrizione.

Al fine di determinare che se un colorante intercalante interesserà un enzima di restrizione digestione del DNA, l'ordine corretto delle operazioni deve essere seguita (Figura 1). Una volta che il DNA è macchiato e si digerisce con un enzima specifico, può essere scattata una foto del gel per determinare il numero di frammenti e la loro dimensione (Figura 2). Al fine di determinare l'efficienza di enzima, il numero totale di b...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.

Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K Views.  University of Nebraska - Kearney. Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.

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DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Ricerca

Biochimica

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunologia e infezioni

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genetica

Cattura della conformazione cromosomica (3C) per la ricerca e l'insegnamento universitari

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autore in primo piano: Ottenere una A con le 3C: Acquisizione della conformazione cromosomica per gli studenti universitari  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Studio delle interazioni TRF1/2 con il DNA telomerico utilizzando il saggio a singola molecola

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Tecniche avanzate a singola molecola per lo studio delle interazioni proteina-DNA telomerico

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

Riepilogo

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In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola