Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nello studio delle interazioni ospite-patogeno consentendo l'esame dell'espressione codificante, non codificante e dell'RNA virale coinvolta nella risposta dell'amminoacido ospite e di come un agente patogeno può influenzare le funzioni biologiche dell'ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che presenta un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di mRNA e RNA non codificante da librerie RNAseq ridotte di globina da un singolo campione di sangue intero. A dimostrare la tecnica sarà Sarah Anderson, una tecnico del mio laboratorio.
Inizia centrifugando le provette del sangue a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere otto millilitri di acqua priva di RNasi al pellet. Chiudere i tubi e vortice il pellet fino a quando non viene visibilmente sciolto, quindi centrifugare i tubi a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente per recuperare il pellet.
Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, scartare il supernatante e salvare il pellet. Per isolare l'RNA totale, iniziare pipettando 300 microlitri di tampone legante di lisi al pellet. Dopo il vortice, trasferire la miscela da ogni tubo a un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri etichettato.
Aggiungere 30 microlitri di additivo omogeneizzato dal kit di isolamento miRNA. Vortice i tubi e posizionare sul ghiaccio per 10 minuti. Lavorando in una cappa aspirante, rimuovere i tubi dal ghiaccio e aggiungere 300 microlitri del reagente cloroformio fenolo acido dal kit e dal vortice per mescolare di nuovo.
Dopo aver centrifugato a 10.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura la fase acquosa in un nuovo tubo. In base alla quantità di recupero acquoso rispetto al passaggio precedente, aggiungere 1,25 volte il volume di etanolo al 100% al fago acquoso in ogni tubo e pipetta da mescolare. Preparare tubi di raccolta freschi contenenti una cartuccia filtrante per ogni campione.
Pipetta circa 675 microlitri della miscela lysate-etanolo sulla cartuccia del filtro. Centrifugare brevemente a 10.000 volte G per passare il liquido attraverso il filtro. Scartare il flusso.
Ripetere la miscela lysate-etanolo aggiungendo al filtro e alla centrifugazione fino a quando non è stata completamente utilizzata. Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio uno dal kit alla cartuccia filtrante. Centrifugare brevemente per tirare la soluzione attraverso i filtri.
Scartare il flusso e conservare le stesse cartucce filtranti e i tubi di raccolta. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavaggio due-tre a ciascuna cartuccia filtrante. Dopo aver centrifugato di nuovo, scartare il flusso e ripetere il passaggio di lavaggio.
Per rimuovere qualsiasi liquido residuo dalle cartucce filtranti, ruotarle di altri 60 secondi. Trasferire le cartucce in tubi di raccolta freschi. Aggiungere 100 microlitri di acqua preriscaldata senza nucleasi di 95 gradi Celsius al centro di ogni cartuccia filtrante.
Centrifugare le cartucce per circa 20-30 secondi alla centrifuga da tavolo alla massima velocità. Per preformare l'ibridazione con oligo di riduzione della globina, prima denaturare l'RNA aggiungendo ogni campione estratto in un tubo di reazione senza nucleasi a parete sottile da 0,2 millilitri. Posizionare i tubi in un ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti.
Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio per ottenere una qualità ottimale dell'RNA. Mentre i tubi si stanno raffreddando, preparare 400 microlitri di miscela di oligo di riduzione della globina 10X e tampone di ibridazione oligo 10X in un tubo a due millilitri. Per rendere la miscela di ibridazione, aggiungere sei microgrammi di campione di RNA, due microlitri della miscela di oligo di riduzione della globina 10X, un microlitro di tampone di ibridazione oligo 10X e acqua priva di nucleasi a un volume finale di 10 microlitri per ogni tubo di reazione a parete sottile a parete sottile da 0,2 millilitri.
Posizionare i tubi nel ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio. Per eseguire la digestione RNasi H, diluire prima la RNasi H 10X in una X RNasi H con un tampone X RNasi H.
Preparare la miscela di reazione RNasi H combinando due microlitri di tampone di RNasi 10X, un microlitro di inibitore della RNasi e due microlitri di una X RNasi H e cinque microlitri di acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione RNasi H ai campioni di ibridazione di riduzione della globina e mescolare accuratamente. Digerire questa reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi raffreddare a quattro gradi Celsius.
Interrompere la digestione aggiungendo un microlitro di EDTA molare 0,5 al tubo e trasferire l'intero contenuto del tubo in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Subito dopo, aggiungere 80 microlitri di acqua priva di RNasi, 350 microlitri di tampone di lisi, quindi 250 microlitri di etanolo al 100% a ciascun tubo e mescolare bene mediante pipettazione. Trasferire ogni campione da 700 microlitri in una cartuccia di filtro di eluizione separata posta in un tubo di raccolta a due millilitri per raccogliere il flusso.
Centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore e quindi scartare il flusso. Posizionare le stesse cartucce filtranti di eluizione in nuovi tubi di raccolta a due millilitri. Per lavare le membrane della cartuccia del filtro, aggiungere 500 microlitri del tampone di lavaggio delicato alle cartucce filtranti e centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore.
Scartare il flusso. Quindi, utilizzando gli stessi tubi di raccolta, aggiungere 500 microlitri di 80%etanolo alle cartucce filtranti. Centrifuga per due minuti a 8.000 volte G e superiore.
Scartare entrambi i tubi flow-through e collection e salvare le colonne di rotazione dell'eluizione. Posizionare ogni colonna di rotazione dell'eluizione in un nuovo tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga a tutta velocità per cinque minuti con il coperchio aperto sulle cartucce filtranti per asciugare le membrane della colonna di rotazione e prevenire il riporto dell'etanolo.
Dopo aver scartato i tubi di raccolta, posizionare ogni cartuccia di filtro essiccata in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 14 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente al centro della membrana della cartuccia filtrante. Per elutare l'RNA, centrifugare i tubi per 60 secondi a tutta velocità e quindi continuare con ulteriori valutazione e preparazione dell'RNA.
Il campione impoverito di globina può ora essere diviso e utilizzato per preparare le piccole librerie di RNA non codificanti, così come l'mRNA impoverito di ribo e le lunghe librerie di RNA non codificanti. Dopo aver preparato le librerie di espressioni dei campioni di sangue intero impoveriti di globina e ribo-impoveriti utilizzando questo protocollo, il riepilogo dell'esecuzione del file di elettroforesi ha mostrato un campione di libreria impoverito di globina con numeri di integrità dell'RNA che variava da 6,3 a 9,2. Questo si dimostrò un miglioramento rispetto ad altri studi che usavano metodi di esaurimento della globina e erano in grado di ottenere numeri RIN solo a sei o quasi.
La riduzione della pre-globina e la post-globina di un singolo campione di sangue intero suino hanno mostrato che i rapporti di concentrazione da 260 a 280 nanometri sono o superiori a due. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti elettroferogrammi a base di chip di campioni di libreria di mRNA di sangue intero impoveriti di globina e ribo prima della messa in comune e del sequenziamento. Per le librerie di mRNA, l'elettroferogramma rappresentativo ha un picco di circa 280 coppie di basi.
Per i piccoli ncRNA gli elettroferogrammi rappresentativi basati su chip contengono un intervallo di picchi da circa 100 a 400 coppie di basi. I picchi a circa 143 coppie di basi corrispondono ai miRNA, e i picchi a circa 153 coppie di basi corrispondono ai piRNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare ai tubi di ghiaccio immediatamente dove indicato.
Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione dovrebbero essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'espressione differenziale, i cambiamenti epigenetici e il loro effetto sulle vie e sui processi biologici. Non dimenticare che lavorare con il reagente fenolo-cloroformio è estremamente pericoloso e devono essere prese precauzioni come lavorare in una cappa aspirante. Inoltre, quando si maneggiano sangue intero o organismi infettivi, il lavoro deve essere eseguito in un armadietto di sicurezza biologico prima di un'attivazione dell'organismo infettivo.
