Ringraziamo Paquette Rebecca per l&#39;assistenza con la preparazione dei reagenti. MPM è supportato da una borsa di Ruth L. Kirchstein predoctoral dal National Institutes of Health e il sostegno di borse di GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) anche dal National Institutes of Health.

1. Trasferimento adottivo di cellule: Vena caudale o iniezione intraoculare sono entrambi metodi adeguati per l&#39;introduzione di cellule tracker-etichettati o proteina fluorescente che esprimono linfociti. In questo video. dimostriamo trasferimento adottivo di cellule per iniezione coda vena. a. Materiale Cellule T CD4 + sono etichettati con 1,4 CFSE mM per 30 minuti a 37 º C, lavate due volte e risospese in 100 ml di RPMI-1640. Le cellule vengono caricati in una siringa da insulina sterile 28 gauge per l&#39;iniezione. Il numero di celle utilizzate dipende l&#39;esperimento viene fatto. Tipicamente, 5 milioni di cellule T sono sufficienti per una semplice visualizzazione delle cellule T. Un dispositivo di immobilizzazione roditore per il mouse è necessaria per evitare danni per l&#39;animale e per te stesso. b. Protezione degli animali Il mouse è fissato per il trasferimento adottivo lentamente appoggio l&#39;animale nel dispositivo di immobilizzazione roditori (vedi video) e chiudere l&#39;estremità aperta del tubo delicatamente lo stantuffo. Non lasciare andare la coda di topo durante questo processo, come alcuni animali più piccoli può girare intorno all&#39;interno del dispositivo di immobilizzazione. Questo metodo impedisce l&#39;animale da ferire se stesso e di muoversi durante l&#39;iniezione. Durante l&#39;installazione del dispositivo di immobilizzazione roditore, non spingere il pistone in là di quanto necessario per mantenere l&#39;animale dal salto in avanti. Inoltre, non spingere il pistone contro l&#39;animale, e non lasciare l&#39;animale nel dispositivo di immobilizzazione per un periodo prolungato di tempo. c. Visualizzazione della vena caudale Tirare delicatamente la coda verso di voi in modo che sia leggermente avvolto sopra il dito indice e tenuto contro l&#39;interno del dito con il pollice. Identificare le vene coda situate ai due lati della coda verticale. La visualizzazione è facilitato dal riscaldamento della coda con acqua calda e pulendoli giù con etanolo. d. L&#39;iniezione di cellule Quando la vena è stato localizzato, inserire la siringa conica rivolta verso l&#39;alto ad un parallelo angolo basso alla vena. Una volta in vena, lentamente spingere il pistone, se siete in vena ci dovrebbe essere alcuna resistenza all&#39;iniezione. Se non vi è alcuna resistenza, rimuovere la siringa e riprova in una posizione diversa. Se siete in vena, lentamente spingere il pistone fino a quando l&#39;iniezione è completa. La coda non deve diventare disteso durante l&#39;iniezione. Se lo fa, ciò significherebbe che l&#39;ago non è in vena. E &#39;possibile &quot;perdere&quot; la vena durante l&#39;iniezione. In questo caso, rimuovere l&#39;ago e provare l&#39;iniezione in un punto diverso. Se avete bisogno di tentare più di una iniezione, è meglio spostare la coda in alto verso il corpo del mouse dal sito di iniezione originale. Pianificare in anticipo per questa possibilità a partire distalmente sulla coda per darti spazio per un altro tentativo di trasferimento adottivo. e. Post-iniezione considerazioni Dopo l&#39;iniezione è stata completata, un piccolo riflusso di sangue dalla vena si verificherà. Premere delicatamente il sito di iniezione con un panno pulito, pulire fino a quando il sanguinamento si arresta. Togliere lo stantuffo e lasciare che l&#39;animale camminare in avanti, fuori dal dispositivo di immobilizzazione, mentre delicatamente aggrappato alla coda. Verificate sempre col vostro comitato animali cura e protocolli di utilizzare animali per garantire che siano conformi. E &#39;importante praticare questa tecnica più volte prima di tentare l&#39;esperimento vero e proprio. 2. Linfonodale isolamento Isolamento dei linfonodi per due immagini fotoni richiede la rimozione accurata del linfonodo corretta dal tessuto circostante. a. Selezione e l&#39;ubicazione dei linfonodi periferici Selezione dei linfonodi per l&#39;imaging dipenderà dagli obiettivi sperimentali. Essere a conoscenza di infezione locale o iniezione-drenante linfonodi, e selezionare il nodo appropriato per l&#39;imaging. L&#39;articolo di Van den Broeck et al. Descrive la posizione e la morfologia dei linfonodi murini in dettaglio 3. In questo video, ci dimostrano l&#39;asportazione di sei grandi nodi linfatici periferici che sono adatti per l&#39;isolamento di cellule o di imaging. b. Linfonodale rimozione: Tenete a mente l&#39;integrità del tessuto durante la rimozione dei linfonodi. Fare attenzione a non rompere la capsula o in qualsiasi modo danneggiare la struttura dei linfonodi. Perdita di integrità strutturale del linfonodo comprometterà l&#39;esperimento. Se necessario, rimuovere il grasso dalla superficie del linfonodo con multa dissettore (# 5 Dumont) sotto un microscopio da dissezione. I linfonodi non dovrebbe avere alcun grasso residuo sulla superficie del nodo, in modo da oscurare imaging dispersione della luce. Escissione corretta dei linfonodi è anche una tecnica importante per la pratica prima del primo esperimento reale. 3. Linfa NodImaging e installazione e considerazioni Il linfonodo deve essere assicurato alla fase di imaging, che in questo caso consiste in una camera di incasso. Riscaldato, ossigeno perfusi media è pompato nella camera da un lato utilizzando una pompa peristaltica e riscaldatore in linea, ed esce attraverso un canale verso il basso classificato in una camera di raccolta con un tubo a vuoto in un pallone di raccolta dei rifiuti. Nel nostro sistema, il linfonodo è immerso in 37 ° C media e super-perfusi con medici di grado CarboGen (5% CO 2, 95% O 2). La temperatura dei media perfusione dovrebbero essere registrati come vicino al linfonodo come è possibile. Il vostro sistema particolare può richiedere variazioni della portata media e scenografia per ospitare la fase di microscopio e obiettivo. a. Linfonodi configurazione di imaging: Come mostrato nel video, siamo sicuri del linfonodo dal primo allegando, midollare rivolto verso il basso (per l&#39;immagine T o zone a cellule B mediante un microscopio verticale) ad un coprioggetto di plastica, tagliato a misura appropriata. E &#39;importante utilizzare una colla non tossica dei tessuti (usiamo VetBond ™ di 3M Corporation). Il coprioggetto è fissato nei media che scorre mettendo una goccia di grasso al silicone sulla parte inferiore del vetrino, poi aderendo questo alla base in vetro della camera di imaging. b. 2-Photon Imaging considerazioni: Diversi fattori possono causare linfociti per fermare in movimento: temperatura troppo alta o troppo bassa; potenza del laser in eccesso; compressione o altri danni ai linfonodi, e la mancanza di ossigeno. Danni dovuti ad eccessiva potenza del laser o temperature&gt; ~ 39 ° C è irreversibile. Se le cellule sono debole, che è meglio per aumentare il guadagno del rivelatore o la cella di etichettatura protocollo piuttosto che utilizzare un laser di potenza superiore per visualizzare le cellule. Ottimizzazione di etichettatura o espressione di proteine ​​fluorescenti può essere richiesto per portare la fluorescenza al di sopra del livello di autofluorescenza di fondo. Con guadagno ragionevole e le impostazioni di potenza del laser, circa un due di turno della fluorescenza di sopra del basale (misurato mediante citometria di flusso) è ragionevole per la visualizzazione della cella. Sintonizzabile con due fotoni laser, la lunghezza d&#39;onda utilizzata per l&#39;eccitazione dovrebbe essere un po &#39;meno del doppio del singolo fotone massima eccitazione del fluoroforo essere ripreso. In due-fotone esperimenti usando più di una etichetta o proteina fluorescente che può essere necessario sperimentare con la lunghezza d&#39;onda di eccitazione utilizzato per trovare le impostazioni ottimali per entrambe le etichette. Eccitazione a due fotoni può essere utilizzato anche per le strutture collagene endogeno immagine sfruttando le intrinseche blu generazione di seconda armonica. Generazione di seconda armonica (SHG) si verifica quando due fotoni si combinano all&#39;interno di un materiale ed emettere un singolo fotone del doppio della frequenza dei fotoni originale. Nel tessuto, a due fotoni di eccitazione si verifica quando la luce laser incidente è perpendicolare ad una struttura proteica altamente ordinata come il collagene. Questioni pratiche relative a due fotoni di imaging sono stati discussi in anteprima su 4, 5.

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	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

In questo protocollo video vi mostriamo le procedure per il trasferimento di cellule adottivi e nodo isolamento linfa e la preparazione necessaria per la motilità dei linfociti di imaging in un linfonodo periferico. Due fotoni di imaging ha diversi vantaggi rispetto di imaging confocale in entrambi i tessuti espiantati (qui) e nei preparati intravitale. In particolare, l&#39;uso di raggi infrarossi eccitazione riduce al minimo la dispersione della luce e permette l&#39;imaging con ~ 300 micrometri sotto la capsula del linfonodo e più profondo in alcuni tessuti 4. Inoltre, multi-fotone di eccitazione è limitato al punto focale dell&#39;obiettivo, riducendo al minimo lo sbiancamento foto e danni ai tessuti da parte del piano focale. Come per ogni nuova tecnica, invece, a due fotoni imaging non è una panacea e suoi limiti e le insidie ​​potenziali devono essere tenuti a mente 5. Tra questi è il requisito che - ad eccezione dei segnali intrinseci quali di seconda generazione armonica di collagene le cellule di interesse devono essere marcate con sonde estrinseci o per espressione di proteine ​​fluorescenti. L&#39;impressione è così creato che queste cellule marcate sono il nuoto in un vuoto nero e che in realtà sono immersi in, e interagire con un ambiente complesso di elementi strutturali e una miriade di altri senza etichetta, le cellule invisibili. Nei sei anni dall&#39;introduzione di due fotoni di imaging per l&#39;immunologia, questa tecnica ha permesso ai ricercatori di affrontare annose domande da visualizzare direttamente nei processi intatti i tessuti viventi compresi interazioni cellula-cellula, la motilità cellulare e la localizzazione, vie di segnalazione cellulare e cellule citotossiche uccidendo eventi. Il campo si è rapidamente evoluta al di là iniziale descrizioni fenomenologiche, e le analisi quantitative con modelli al computer e simulazione stanno iniziando a dare un senso di come i movimenti apparentemente caotici cellulare e le interazioni all&#39;interno di linfonodi portare ad una risposta immunitaria efficace. Questo progresso è a un riesame in una recente pubblicazione 1, che elenca oltre 100 articoli che descrivono l&#39;applicazione della microscopia a due fotoni per immunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

Due fotoni di imaging ha rivelato una coreografia elegante della motilità e interazioni cellulari all&#39;interno del linfonodo in condizioni basali e l&#39;avvio di una risposta immunitaria 1. Qui, vi presentiamo i metodi per il trasferimento adottivo di cellule T etichettati, l&#39;isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati come descritto per primo nel 2002 2. Immagini a due fotoni di cellule immunitarie richiede che le cellule sono marcate, sia per colorazione con un colorante inseguitore cellulare o esprimendo una proteina fluorescente. Dimostriamo la procedura di trasferimento adottivo di cellule derivate da topi iniettando donatore nella vena della coda di un animale destinatario, dove hanno sede gli organi linfoidi in circa 15-30 min. Illustriamo l&#39;isolamento di un linfonodo e descrivono metodi per assicurare un corretto montaggio del linfonodo asportato. Altre considerazioni, quali una corretta ossigenazione dei media perfuso, la temperatura e potenza del laser sono discussi. Infine, vi presentiamo le immagini video in 3D di CD4 + cellule T naive espositrici motilità allo stato stazionario a 37 ° C.

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Due fotoni di imaging ha scoperto la motilità dei linfociti e interazioni cellulari all&#39;interno del linfonodo in condizioni basali e durante una risposta immunitaria 1. In questo studio dimostriamo trasferimento adottivo di cellule T, l&#39;isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.1K Views.  University of California, Irvine (UCI).  Due fotoni di imaging ha scoperto la motilità dei linfociti e interazioni cellulari all'interno del linfonodo in condizioni basali e durante una risposta immunitaria 1. In questo studio dimostriamo trasferimento adottivo di cellule T, l'isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati. 

Video: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Ricerca

Biologia

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imaging funzionale del grasso bruno nei topi con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell&#39;orecchio medio e l&#39;analisi istologica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuntura dello spazio di Bowman in topi nei paraggi 2 Photon microscopia

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissezione del sacco endolinfatico da topi

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...