Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Defense Medical College e da una borsa di ricerca per la salute e le scienze del lavoro per la ricerca sulle malattie intrattabili del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone.

Il protocollo sperimentale fu approvato dal Animal Research Committee del National Defense Medical College (n. 16058). Gli animali sono stati mantenuti su chow di laboratorio standard (CLEA Japan Inc, Tokyo, Giappone). Gli animali da laboratorio sono stati trattati in conformità con le linee guida degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Raccolta e separazione dei linfociti
NOTA: Poiché i linfociti devono essere freschi e non possono essere conservati, devono essere raccolti dai ratti per ogni esperimento. Inoltre, i linfociti intestinali-tropici devono essere raccolti direttamente dal dotto toracico dove circolano. Tutte le procedure dovrebbero essere completate entro 6 ore e tutti gli strumenti, i guanti e le superfici sono puliti. Al fine di mantenere gli animali in uno stato fisiologicamente stabile, tutti i fluidi salini e altri fluidi utilizzati nell'esperimento devono essere tenuti al caldo.
<ol><li>Formare un tubo di cannula (1 mm di diametro) come una curva di eparina (un raggio di circa 5 mm) dopo averlo imperniato in acqua calda (circa 80-90 °C) e fissarlo a una tavola di plastica usando nastro adesivo con qualche ora di anticipo.</li>
	<li>Anestetizzare un ratto Wistar maschio (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg / kg), Domitor (0,15 mg / kg) e Betulphar (2,5 mg / kg) e tagliare i peli del corpo dell'addome usando un tagliacapelli. Rimuovere saldamente i capelli dopo la rasatura in modo che i capelli non entrino nella cavità addominale.</li>
	<li>Dopo aver confermato che la profondità stabile dell'anestesia richiesta per la procedura si ottiene con il pizzico, fare un'incisione con forbici chirurgiche orizzontalmente dalla linea mediana all'area sottocostale sinistra. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni nel peritoneo parietale osservando i vasi sotto la luce.</li>
	<li>Avvolgere lo stomaco con garza bagnata e spostare delicatamente lo stomaco a destra all'esterno del corpo per rivelare gli organi retroperitoneali. Inserire una tacca tra i muscoli dell'eretore della colonna vertebrale e il tessuto adiposo usando forbici chirurgiche e separarli senza mezzi termini con le dita.</li>
	<li>Togliere con cura il tessuto connettivo attorno al dotto toracico. Il tessuto connettivo in eccesso aumenta con l'età. Esporre il condotto toracico da appena sotto i cru a sinistra del diaframma caudally fino a quando non era visibile una lunghezza di 20 mm del condotto toracico. Separare delicatamente le aderenze tra il dotto toracico e l'aorta utilizzando pinzette di precisione o tamponi di cotone bagnati.<ol>
<li>Eseguire attentamente questo processo perché alcuni ratti hanno arteriole ramificate dall'arteria addominale che attraversano il dotto toracico o un dotto toracico corto a causa di una posizione più elevata del plesso linfatico (piccoli dotti toracici che si diffondono come ragnatele). Evitare il contatto non necessario con il dotto toracico per evitare di indurre edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare una legatura di una corda (seta 3-0) sul condotto toracico appena sotto i cru a sinistra del diaframma. Il dotto toracico caudale viene disteso.</li>
	<li>Fare un foro (5 mm di diametro) nella parete addominale pugnalando il tagliente delle forbici chirurgiche, passare il tubo di cannula curva a forcina e ligare il tubo sul muscolo iliopsoas in un certo punto. Riempire il tubo di cannula con soluzione salina normale contenente 10 U/mL di eparina.</li>
	<li>Dopo aver posizionato una corda (seta 3-0) sotto il dotto toracico disteso, pugnalare il dotto toracico con il bordo affilatamente tagliato di un tubo di cannula, cannularlo verso la coda di circa 5 mm e ligare il dotto toracico con tubo di cannula per la fissazione.</li>
	<li>Per fornire salina per prevenire la disidratazione, creare un foro (3 mm di diametro) sulla parete anteriore dell'antro dello stomaco usando pinzette di precisione e passare il tubo di silicio (2 mm di diametro) al duodeno attraverso l'anello pilorico. Dopo aver ricucito una ferita e mantenuto gli animali nelle gabbie di Bollman, inizia a infondere saline cariche di zucchero nel duodeno di ogni topo dal tubo di silicio ad una portata di 3 mL / h. Coprire l'intera gabbia con un tovagliolo di carta per tenerlo caldo.</li>
	<li>Fissare il tubo di cannula al foro al centro del coperchio di un tubo conico da 50 ml su ghiaccio contenente 6 Eparina U/ml, siero bovino fetale al 10% e mezzo RPMI 1640 (pH 7.4; vedi tabella dei materiali) e raccogliere linfociti del dotto toracico (TDL) sul ghiaccio. Fare attenzione a non contattare la punta del tubo alla parete del tubo conico per evitare l'occlusione del tubo cannulato a causa della formazione di coaguli di fibrina all'interno del tubo. Il liquido linfatico (circa 20 mL) di cui circa 1,0 x 108~ 109 linfociti può essere ottenuto in 6 ore. Per ottenere i linfociti in anestesia completa, viene monitorato il piano di anestesia e il flusso linfatico viene osservato in modo appropriato. Gli stessi anestetici vengono aggiunti alla stessa dose circa 3 ore dopo che i ratti sono stati messi nella gabbia di Ballman per ottenere continuamente anestesia profonda per 6 ore.</li>
</ol>2. Etichettatura dei linfociti con carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFDSE)
<ol><li>Sciogliere il CFDSE(Tabella dei Materiali)nel solfossido di dimetile (DMSO) a 15,6 mM (500 μg di CFDSE sciolto in 60 μL di DMSO).</li>
	<li>Incubare i linfociti (1 x 108~109) in 50 mL di RPMI 1640 con 50 μL di soluzione CFDSE per 30 min a 37 °C come descritto in precedenza10.</li>
</ol>3. Configurazione sperimentale per studi microvascolari
<ol><li>Anestetizzare ratti riceventi (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) e Betulphar (2,5 mg/kg) e confermare la profondità dell'anestesia con il pizzico. Bagnare l'addome prima di toeleggiare la pelliccia per ridurre al minimo la contaminazione dei capelli. Quindi aprire l'addome del ratto Wister ricevente tramite un'incisione della linea mediana.</li>
	<li>Metti un topo su una piastra portatile in acciaio inossidabile (circa 120 x 300 mm) con un foro rettangolare intorno al centro coperto da uno scivolo di vetro (24 x 50 mm). Scegli circa 10 cm del segmento ileale inclusi i PP per l'osservazione.</li>
	<li>Mantenere l'intestino il più caldo possibile e umido con soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) riscaldata a 37 °C. Immergere la garza che viene utilizzata per coprire l'intestino tenue con PBS.</li>
	<li>Pur dando anestesia continua con isoflurane al 2 % (vedi tabella dei materiali), mettere lo scivolo sul palco del microscopio e scegliere le aree adatte per l'osservazione del microcircolo nei PC in cui alcuni veicoli pesanti attraversano il serosa. Le dimensioni dei PC variano; quelli più grandi sono adatti per l'osservazione del microcircolo utilizzando CLSM. L'intestino tenue non è dritto in alcuni punti; un segmento rettilineo lungo almeno 2 cm senza alcuna tensione è adatto per l'osservazione.</li>
	<li>Coprire il segmento intestinale adiacente e mesentere con cotone assorbente imbevuto di PBS. Posizionare il segmento intestinale tra due batuffoli di cotone arrotolati e posizionarlo il più lontano possibile dal corpo del topo per evitare che venga vibrato dal battito cardiaco e dalla respirazione del topo.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 1 ml, iniettare lentamente (oltre 1 minuto) TDL con etichetta CFSE (1 x 108 cellule) nella vena giugulare dei ratti riceventi. Una rapida iniezione endovenosa può influenzare la circolazione sistemica.</li>
</ol>4. Microcircolazione dei linfociti
<ol><li>Monitorare continuamente i TDL nella microvascolarizzazione dei PC utilizzando il CLSM e registrare su un computer per 3 ore utilizzando la fotografia time-lapse a intervalli di 30 s. La profondità dal serosa all'HEV dei PS è di circa 25 μm, consentendo l'osservazione dello stroma e dei vasi linfatici capillari a una profondità di 30 μm.</li>
	<li>Iniettare Texas Red-dextran (25 mg/kg) nella vena giugulare di ogni ratto ricevente per macchiare il flusso sanguigno e Hoechest 33342 (5 mg/kg) per macchiare i nuclei cellulari.</li>
	<li>(Facoltativo) Per quantificare la dinamica dei linfociti, definire i linfociti aderenti agli HEV per più di 30 secondi come "linfociti adesivi" e linfociti che emigrano dagli HEV allo stroma come "linfociti migratori". Quindi calcolare la percentuale media di migrazione (linfociti migratori / linfociti adesivi + linfociti migratori) per campo visivo (circa 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo descritto un protocollo per la raccolta di linfociti intestinali-tropici ingenui e l'osservazione della loro migrazione nei PC di ratto. Queste procedure possono rivelare come i linfociti si muovono nella microvascolarizzazione dei PC e consentire di confrontare visivamente la loro dinamica in una condizione normale o medicata. L'osservazione diretta di queste dinamiche ha molto merito di ottenere un indizio per la modifica immunologica da parte di alcuni farmaci, anche se il periodo osservazionale è limitat...

Le chiazze di Peyer (PPs) sono costituite da centinaia di follicoli linfoidi nella lamina propria dell'intestino tenue. I PP sono divisi in follicoli, la regione interfollicolare e centri germinali situati nella parte inferiore dei follicoli, dove i linfociti sono stimolati dalla presentazione dell'antigene. Non ci sono vasi linfatici afferenti e gli antigeni invadono la lamina propria dal lume intestinale attraverso lo strato cellulare epiteliale. La regione epiteliale che copre i follicoli linfoidi è chiamata epitelio associato al follicolo, all'interno del quale le cellule M intervallate specializzate assuppongono gli antigeni mucosi. Le cellule M assupiscono antigeni dal lato luminale e gli antigeni vengono quindi catturati dalle cellule dendritiche e presentati verso linfociti ingenui che fluiscono nei PPs attraverso l'endotelio di alte venute endoteliali (HEV)1. I PP svolgono un ruolo importante nell'immunità intestinale e sono correlati con la fase iniziale dell'infiammazione. Molte interazioni molecolari coinvolgono l'ingresso di linfociti agli organi linfoidi secondari (SLO), comprese le molecole di adesione, le chemiochine2,3e la sfingosina-1-fosfato4; pertanto, ci sono molti obiettivi terapeutici attesi. Pertanto, osservare la dinamica dei linfociti all'interno dei PPs ci consente di intravedere la fase molto precoce dell'infiammazione ed esaminare l'utilità di diversi farmaci promettenti.
Il metodo qui si concentra sulla migrazione dei linfociti nei PS, che include diverse procedure (cannulazione nel dotto toracico5 e raccolta di linfociti e osservazione a lungo termine dopo l'iniezione nei linfociti raccolti). Poiché queste procedure sono complesse ed è stato difficile capire esattamente come ogni procedura è stata eseguita nelle relazioni precedenti, abbiamo menzionato qui alcuni suggerimenti per ottenere un'osservazione di successo. Ad esempio, la cannulazione dei tubi nel condotto toracico era molto difficile e il tasso iniziale di successo della cannulazione era inferiore al 50%. Tuttavia, abbiamo migliorato il metodo e raggiunto un tasso di successo superiore all'80%. Abbiamo menzionato alcuni altri suggerimenti in questo manoscritto che sono necessari per l'osservazione riuscita per consentire la valutazione quantitativa della migrazione transendoteliale dei linfociti in diverse condizioni.
Nei rapporti precedenti, era difficile comprendere i cambiamenti tridimensionali nel tempo, come l'iniezione endovenosa di inchiostro indiano per macchiare la struttura vascolare di PPs6, o il microscopio era monofocale7. Negli ultimi anni, un metodo osservazionale che utilizza alcuni animali transgenici proteici a fluorescenza fotoconvertibili come i topi Kaede ha chiarito i movimenti cellulari sistematici in vivo8. L'altro studio ha chiarito l'arresto indipendente del CD69 dell'uscita dei linfociti dai PPs9. Abbiamo utilizzato la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) a causa della sua elevata capacità analitica. Ora possiamo facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione e usarle per analizzare la dinamica dei linfociti.
In questa relazione, abbiamo dimostrato una serie di metodi per valutare la migrazione dei linfociti nei PC. In primo luogo, abbiamo mostrato metodi raffinati di cannulazione del dotto toracico per raccogliere i linfociti. In secondo luogo, abbiamo migliorato i metodi osservativi in diversi modi per mantenere organi oggettivi ogni volta che è possibile sotto osservazione microscopica, consentendoci di ottenere immagini di alta qualità per 3 ore. In terzo luogo, abbiamo quantificato i movimenti cellulari della migrazione dei linfociti per valutare gli effetti di alcuni farmaci. Questi protocolli modificati contribuiranno allo sviluppo di valutazioni dell'immunologia mucosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

I linfociti ingenui ricircolano dal sangue ai tessuti linfoidi in condizioni fisiologiche ed è comunemente riconosciuto come un fenomeno importante nell'immunità intestinale. Lo stroma degli organi linfoidi secondari, come le chiazze di Peyer (PS) o i linfonodi mesenterici, sono dove i linfociti ingenui percepisce gli antigeni. I linfociti ingenui circolano attraverso il flusso sanguigno per raggiungere alte venute endoteliali, il portale di ingresso nei PC. Si stima che alcuni immunomodulatori influenzino la migrazione dei linfociti, ma la valutazione precisa della dinamica del microcircolo è molto difficile e stabilire un metodo per osservare la migrazione dei linfociti in vivo può contribuire al chiarimento dei meccanismi precisi. Abbiamo perfezionato il metodo di raccolta dei linfociti dal condotto linfatico e osservando la dinamica dettagliata dei linfociti intestinali-tropici nei PC di ratto. Abbiamo scelto la microscopia a scansione laser confocale per osservare i PC di ratto in vivo e l'abbiamo registrata utilizzando la fotografia time-lapse. Ora possiamo ottenere immagini chiare che possono contribuire all'analisi della dinamica dei linfociti.

Raccolta di linfociti dalla linfa Per preparare il ratto alla cannulazione del dotto toracico, fare un'incisione nel dotto toracico teso, come mostrato nella figura 1, quindi mantenere il ratto nella gabbia di Un Bollman, come mostrato nella figura 2.
Quando i linfociti sono ben raccolti, possiamo ottenere circa 20 mL / 6 h di liquido linfatico contenente circa 107~ 108/ mL linfociti. Tra i TD...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Views.  National Defense Medical College. Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

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Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, T2D results in elevated blood glucose levels. The "gold-standard" in assessing insulin sensitivity is a hyperinsulinemic-euglycemic clamp or insulin clamp. In this procedure, insulin is infused at a constant rate resulting in a drop in blood glucose. To maintain blood glucose at a constant level, exogenous glucose (D50) is infused into the venous circulation. The amount of glucose infused to maintain homeostasis is indicative of insulin sensitivity. Here, we show the basic clamp procedure in the chronically catheterized, unrestrained, conscious rat. This model allows blood to be collected with minimal stress to the animal. Following the induction of anesthesia, a midline incision is made and the left common carotid artery and right jugular vein are catheterized. Inserted catheters are flushed with heparinized saline, then exteriorized and secured. Animals are allowed to recover for 4-5 days prior to experiments, with weight gain monitored daily. Only those animals who regain weight to pre-surgery levels are used for experiments. On the day of the experiment, rats are fasted and connected to pumps containing insulin and D50. Baseline glucose is assessed from the arterial line and used a benchmark throughout the experiment (euglycemia). Following this, insulin is infused at a constant rate into the venous circulation. To match the drop in blood glucose, D50 is infused. If the rate of D50 infusion is greater than the rate of uptake, a rise in glucose will occur. Similarly, if the rate is insufficient to match whole body glucose uptake, a drop will occur. Titration of glucose continues until stable glucose readings are achieved. Glucose levels and glucose infusion rates during this stable period are recorded and reported. Results provide an index of whole body insulin sensitivity. The technique can be refined to meet specific experimental requirements. It is further enhanced by the use of radioactive tracers that can determine tissue specific insulin-stimulated glucose uptake as well as whole body glucose turnover.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp is the "gold standard" for the assessment of insulin action. Insulin is infused at a constant rate stimulating glucose uptake. The amount of exogenous glucose infused to counter this drop is indicative of insulin sensitivity. Here the procedure is performed on a conscious, unrestrained rat.

Iperinsulinemico-euglicemico pinza nei topi

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, ...

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Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

L&#39;angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Impianto di hiPSC-derivato del muscolo cardiaco patch dopo lesione del miocardio in un modello della cavia

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes methods for the fabrication of the high platform, establishes a rat model of asthma and measures changes in respiratory function using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system.

Agopuntura in un modello di ratto di asma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

L'approccio microscopico transcanale nella chirurgia delle staffe rivisitato

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Reimpianto microscopico dell'amputazione del glande peniena dovuta alla circoncisione

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Resezione microscopica della cisti per il trattamento di pazienti con diagnosi di cisti epididimica

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...