Name: a syngeneic pancreatic cancer mouse model to study the effects of irreversible electroporation
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation at JoVE.com

RRW ha ricevuto sostegno per questo lavoro da un assegno di ricerca traslazionale collaborativo finanziato dal C3 San Diego Padres pedale la causa (#PTC2017).

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati seguendo che questo protocollo deve essere approvato dal rispettivo istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da IACUC UCSD.
1. procurarsi animali destinatari
Nota: La linea cellulare 4580 KPC-Luc è stata stabilita da un tumore che presenta in un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse (KPC), che è un modello geneticamente costruito del PC su uno sfondo di C57BL/6. Il vantaggio di questa linea cellulare è che esso esprime costitutivamente luciferasi-attivazione del monitoraggio di tumore in Modelli ortotopici. Tuttavia, altre linee cellulari possono anche essere utilizzati, purché siano compatibili con il background genetico dei topi destinatari.
<ol><li>Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.</li>
	<li>Scegli l'età (6 - 10 - settimana-vecchi topi consigliati) e sesso degli animali utilizzati secondo l'ipotesi e la linea cellulare utilizzato.</li>
</ol>2. coltura cellule
<ol><li>Uso Dulbecco s modified medium (DMEM) di eagle: miscela nutriente F12 (50: 50) supporti contenenti 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (media di sviluppo completo) per far crescere cellule 4580 KPC-Luc.</li>
	<li>Se congelato, scongelare le cellule 4 giorni prima dell'impianto del tumore.</li>
	<li>Crescere le cellule a 37 ° C con 5% CO2% e 95% di umidità in condizioni asettiche.</li>
	<li>Tripsinizzano le cellule con 0,25% tripsina per 5 min a 37 ° C prima che raggiungano > confluency di 80% e neutralizzare la tripsina aggiungendo due volte il volume dei mezzi di crescita completa. Nota: Queste cellule non stabilire i tumori in modo efficiente in topi se vengono utilizzati al 100% confluency o se essi sono attraversate per più di 12 volte. Quindi, si consiglia di congelare le cellule alle precedenti passaggi sotto confluency di ottimale.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro e procedere per induzione del tumore in se un numero sufficiente è presente (0,5 - 1 x 106 cellule/mouse). In caso contrario, espandere le cellule per un passaggio più fino a numeri di cellulare adeguata sono ottenuti.</li>
</ol>3. induzione di tumori SQ
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: P1000 e P100 pipette e puntali, siringa da 1 mL, 25G aghi, matrice della membrana basale (BMM), media basale di DMEM, 1,5 mL provette da centrifuga. Mantenere tutto il materiale sterile e freddo (4 ° C) fino alla fine della procedura. Anche tenere tosatrici e tamponi imbevuti di alcool pronto per l'uso di animali.</li>
	<li>Tripsinizzano (secondo passaggio 2.4) e contare le celle e risospendere li ad una concentrazione di 2-4 x 107 cellule/mL di DMEM freddo.</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di 100% BMM fare una sospensione cellulare finale in 50% BMM. Il volume finale dovrebbe ammontare a 50 µ l di sospensione cellulare per ogni mouse richiesto. Preparare 10% in eccesso per ospitare lo spazio morto nella siringa e per eventuali errori di pipettaggio.</li>
	<li>Aliquotare la sospensione in 550 volumi µ l in provette da 1,5 mL Centrifuga messo in ghiaccio.</li>
	<li>Trattenere gli animali (6 - settimana-vecchio maschi topi C57BL/6) utilizzando un dispositivo di ritenuta o manualmente. Nota: In alternativa, topi possono essere anestetizzati con isoflurano 2,5% in gas di ossigeno ad un flusso di 2 L/min utilizzando un vaporizzatore di precisione.</li>
	<li>Il sito di iniezione, che è preferibilmente su un fianco sopra una gamba, utilizzando un clipper la barba. Pulire con un batuffolo imbevuto di alcool, nel sito di iniezione due volte.</li>
	<li>Disegnare 250 µ l di sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1-2 x 107 cellule/mL in siringa 1 mL fredda e rimuovere eventuali bolle d'aria muovendo il pistone su e giù. Inserire un ago 25G nella siringa e assicurarsi di riempire lo spazio all'interno dell'ago.</li>
	<li>Inserire delicatamente l'ago sotto la pelle verso il corpo vicino ai fianchi, assicurandosi che l'ago non perforare la cavità peritoneale o la muscolatura degli arti con un'angolazione di 30°.</li>
	<li>Appiattire l'ago parallelo al corpo e appiattire le rughe sulla pelle. Iniettare lentamente 50 µ l di sospensione cellulare. Tenere l'ago al sito di iniezione per 10 s per consentire il BMM a solidificare per evitare eventuali perdite.</li>
	<li>Estrarre lentamente l'ago tenendolo parallelo senza alcun movimento laterale. Pulire il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool delicatamente e rilasciare il mouse nella sua sede. Nota: Se il mouse è stato anestetizzato durante la procedura, monitorare l'animale fino a quando si riacquista i suoi riflessi di raddrizzamento.</li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore usando regolarmente pinze fino a 5 mm di diametro.</li>
</ol>4. induzione di tumori di Orthotopic
<ol><li>Preparare i materiali richiesti. Autoclave la chirurgica strumenti come forbici, bisturi, aghi driver e punta e pinze a punta piatta. Mantenere utile suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante occhio, garza di cotone, soluzione di iodio povidone 10%, teli chirurgici, termofori, buprenorfina e agenti anestetici.</li>
	<li>Eutanasia di un mouse di donatore (preferibilmente dello stesso sfondo richiesto per il modello ortotopico) che trasportano un tumore SQ KPC utilizzando una camera di riempimento lento CO2 . Asportare il tumore SQ attentamente in condizioni sterili in una cappa di BSL-2 usando pinze sterili e microforbici poco prima dell'impianto ortotopico. Durante l'asportazione del tumore fare attenzione a non forare la cavità peritoneale e lavare il tumore immediatamente con 2 scambi di PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzando il bisturi sterile, tritare il tumore asportato in 1 mm3 pezzi, metterli su una piastra Petri contenente freddo sterile DMEM media basale e conservare il ghiaccio fino al momento dell'impianto.</li>
	<li>Amministrare il destinatario mouse 0.05 - 1 mg/kg buprenorfina analgesico SQ, 30 min prima della chirurgia.</li>
	<li>Anestetizzare i topi destinatari con isoflurano 2-3% in ossigeno (2 L/min) utilizzando un vaporizzatore di precisione (o altri agenti anestetici). Tenere il topi su un 37 ° C riscaldamento pad per l'interezza della procedura. Applicare il lubrificante per gli occhi per evitare il disseccamento. Prova la profondità dell'anestesia da mancanza di sorprendente riflesso inizialmente e confermare l'anestesia chirurgica aereo dalla mancanza del pedale riflesso a un pizzico di delicata punta. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura chirurgica.</li>
	<li>Posizionare il mouse sul dorso e girare delicatamente al suo lato destro in modo che il lato sinistro dell'addome è esposto. Rimuovere i capelli addominali del mouse usando la crema depilatoria e pulire con una garza per garantire che capelli gratis non entra l'incisione di post addome. Preparare l'addome di sinistra per chirurgia usando 3 cicli di iodio povidone 10% seguita da salviettine imbevute di alcool per disinfettare la pelle.</li>
	<li>Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione trasversa o obliqua di 1.5 cm nella pelle, 1 cm a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica, leggermente mediale alla milza. Quindi, estendere l'incisione attraverso la muscolatura addominale, l'incisione superficiale sovrastante di mirroring.</li>
	<li>Individuare la milza usando piatta con punta forcipe e delicatamente esternare e dalla cavità addominale. Ritrarre la milza utilizzando un applicatore di cotone sterile e trovare la coda del pancreas attaccato al fondo della milza.</li>
	<li>Utilizzando le pinze a punta piatta, ritrarre lateralmente la coda del pancreas.</li>
	<li>Prendere un tumore finemente macinate pezzo dal mouse donatore con la punta di un ago di sutura sterile di belle (6-0) e la posizione utilizzando pinze sterili.</li>
	<li>Mentre delicatamente di retrazione lateralmente il coda/corpo del pancreas, inserire l'ago di sutura contenente il frammento di tumore nella coda del pancreas. Passare la sutura lentamente attraverso il tessuto, che tiene il tumore a contatto con la coda del pancreas. Applicare una o due suture supplementari a seconda dell'orientamento del frammento rispetto il tessuto.</li>
	<li>Rimuovere completamente l'ago dal tessuto e mantenere il pancreas/milza esteriorizzata per un supplemento di 60 s durante l'ispezione per eventuali segni di emorragia o di perdita. Quindi, di interiorizzare delicatamente nella cavità addominale utilizzando forcipe smussato.</li>
	<li>Chiudere la muscolatura addominale utilizzando una sutura riassorbibile 6-0 sia con una cucitura continua o interrotta e la pelle sovrastante utilizzando un 3-0 a 6-0 suturare interrotti non assorbibili. Interrompere l'anestesia a questo punto.</li>
	<li>Consentire il mouse per recuperare nella sua gabbia a casa con libero accesso al cibo e acqua. Posizionare la gabbia su un rilievo di riscaldamento per facilitare il recupero. Monitorare i segni vitali quali la respirazione, aspersione ecc., durante il processo di recupero.</li>
	<li>Confermare i segni del riflesso di raddrizzamento una volta recupera il mouse, e poi tornare la gabbia può regolare alloggiamento.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h dopo l'intervento chirurgico e ogni 8-12 h dopo la procedura se necessario per i segni di dolore.</li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore usando un bioluminescenza in vivo imaging system (Vedi la Tabella materiali).<ol>
<li>Seguire la crescita del tumore da imaging a partire il giorno 4 dopo l'impianto ortotopico ed eseguire due volte a settimana di imaging.</li>
		<li>Il giorno dell'imaging, amministrare (iniezione intraperitoneale) 30 mg/kg D-luciferina per un anestetizzati (2-3% isoflurane in ossigeno (2 L/min)) destinatario mouse 10 min prima di formazione immagine.</li>
		<li>Immagine per l'attività luciferasica utilizzando l'impostazione di luminescenza senza alcun filtro di emissione per un minimo di 5 s esposizione in un imager di luminescenza con piatto riscaldato gratuito auto-fluorescenza e pur mantenendo l'anestesia per i topi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. IRE dei tumori SQ
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: quadrato onda electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi (matrice dell'ago contro pinzette-trode) e adattatori. Mantenere sterile suture (non assorbibile 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante di occhio, garza di cotone, buprenorfina e anestetici nelle vicinanze.</li>
	<li>Sterilizzare la pinzetta o aghi elettrodi di matrice utilizzando la sterilizzazione a gas. Sterilizzazione in autoclave non è raccomandato. Utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro per sterilizzare gli elettrodi fra gli animali.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/Kg per i topi del tumore-cuscinetto 30 min prima della procedura.</li>
	<li>Procedura 4.4-4.5 per con successo inducono anestesia in topi una volta che l'impianto SQ tumore raggiunge 5 mm di diametro.</li>
	<li>Posizionare il mouse anestetizzato su un lato per accedere il tumore SQ sul fianco. Rimuovere i capelli utilizzando clippers e pulire la pelle usando un batuffolo imbevuto di alcool.</li>
	<li>Per i tumori SQ, utilizzare matrice 2 aghi elettrodi. Elevare la pelle direttamente sotto il sito del tumore usando il forcipe e inserire gli elettrodi attraverso la pelle parallela al corpo assicurandosi che non penetrano nella cavità peritoneale. Una volta attraverso la pelle, posizionare gli elettrodi in modo tale che essi staffa il tumore.</li>
	<li>Programma electroporator a consegnare 100 µs impulsi ad una frequenza di 1 Hz a 1.500 V/cm per un totale di 150 impulsi. Consegnare gli impulsi utilizzando il comando a pedale. Separare ogni set di 10 impulsi di 10 s, al fine di consentire la dissipazione di calore e confermare la corretta posizione degli elettrodi. Nota: Senza l'uso di agenti paralitici, topi verificherà le contrazioni muscolari con IRE che possono causare lo spostamento degli elettrodi se non manualmente fissata.</li>
	<li>Rimuovere gli elettrodi dopo il dosaggio completo, che non devono superare i 200 Record s. consegnata la tensione effettiva, che viene visualizzato sulla electroporator. Consentire i topi recuperare dopo IRE secondo passi 4,14-4,16.</li>
</ol>6. IRE di Orthotopic tumori
Nota: IRE di orthotopic tumori coinvolge un secondo ambulatorio di sopravvivenza sul mouse stesso che richiede un'autorizzazione speciale da IACUC locale prima di iniziare.
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: autoclave gli strumenti chirurgici come forbici, bisturi, aghi driver, puntato forcipe e piatta con punta forcipe. Tenere i seguenti nelle vicinanze pure: suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, occhio lubrificante, garza di cotone, 10% soluzione di iodio povidone, teli chirurgici, termofori, onda quadra electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi e loro adattatori, buprenorfina e anestetici.</li>
	<li>Valutare i topi per la crescita del tumore di orthotopic da in vivo imaging (Vedi punto 4.17) iniettando 30 mg/kg di D-luciferina intraperitonealmente. Nota: I tumori di orthotopic sono ideali per IRE trattamento 8-10 giorni dopo l'impianto quando i tumori sono chiaramente visibili e ancora confinato al pancreas può essere visto sulle immagini di luminescenza di Luciferase (Vedi i Risultati rappresentante).</li>
	<li>Procedura 4.4-4.9, per individuare il tumore impiantato. Se il tumore non è facile da individuare, utilizzare pinze dal naso smussate per spostare lo stomaco e la milza delicatamente per identificare il tumore.</li>
	<li>Esternare il tumore con il forcipe dal naso smussato e catturare il tumore strettamente con gli elettrodi di platino di pinzette-trode. Consegnare gli impulsi di elettroporazione come programmato nel passaggio 5.7 utilizzando il electroporator onda quadra in set di 10 impulsi controllati dall'interruttore a pedale.</li>
	<li>Mantenere il tumore esteriorizzato per almeno 60 post s IRE per monitorare eventuali segni di emorragia. Reinserire il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione come descritti (passaggi precedenti 4,13-4,16) e monitorare il mouse fino a quando si recupera.</li>
	<li>Monitorare gli effetti delle IRE sulla crescita del tumore usando la formazione immagine in vivo luciferasi secondo passo 4,17.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno alcuna informazioni finanziarie rilevanti.

In questo studio, abbiamo dimostrato un modello di topo immunocompetenti per PC che può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'IRE sulla crescita del tumore. Attualmente, IRE è utilizzata come una tecnica di ablazione non termico solo in altamente selezionati pazienti localmente avanzati del PC che non dispongono di progressione di malattia a distanza dopo mesi di terapia preoperatoria. Suo uso è stato limitato quindi perché la maggior parte dei pazienti con localmente avanzato PC sviluppare malattia metasta...

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PC) è proiettato a diventare la seconda causa principale delle morti del cancro negli Stati Uniti intorno 20201. La stragrande maggioranza dei pazienti diagnosticati con il PC alla fine muoiono dalla malattia metastatica a distanza2. Il microambiente di PC è notoriamente immunosopressivo e chemioresistente. Relativo stroma desmoplastico contiene una scarsità di cellule T effettrici (anti-tumorale) e una prominenza dei leucociti immunosoppressori, tra cui i macrofagi associati al tumore (TAM), cellule mieloidi soppressore derivate (MDSC) e cellule T regolatorie (Treg)3 . Questi sono alla base della necessità di sviluppare strategie multimodali che neutralizzano questi effetti del microambiente.
IRE è stata sviluppata come un metodo non-termica di ablazione del tumore. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE non causa necrosi coagulativa rapida ma invece si traduce in graduale apoptotica delle cellule morte4. D'importanza per i tumori pancreatici, IRE non è vulnerabile agli effetti di "dissipatore di calore" e può essere eseguita proprio accanto a vasi sanguigni5. Questa tecnologia ha spazio di 510 (k) dalla FDA6 ed è attualmente utilizzata clinicamente, per i pazienti selezionati con cancro pancreatico resecabile localmente avanzato o borderline. La più grande serie pubblicati di IRE per PC7, la sopravvivenza mediana dei pazienti sottoposti a IRE era approssimativamente doppia la sopravvivenza dei pazienti trattati con chemioterapia moderna da solo senza resezione8,9.
Parecchi studi hanno dimostrato che l'ablazione termica induce una risposta immunitaria sistemica in altri tipi di tumore (rivisto in Chu et al. 10). l'ablazione di radiofrequenza (RFA) in modelli animali del tumore comporta aumentata delle cellule di T si infiltra11,12, compreso un aumento in cellule attivato natural killer (NK) epatocellulare cancro pazienti13, 14e una diminuzione in immunosopressiva Treg nel polmone cancro pazienti15. Un numero molto inferiore di studi hanno esaminato immunitario, microambiente e danno risposte a IRE16. IRE ha dimostrata di stimolare una risposta immunitaria sistemica in modelli di topi immunocompetenti in cui la crescita di osso omoplastico secondario (controlaterale) renale delle cellule è stato ridotto o evitata con IRE di un tumore primario due settimane precedenti17. Essi hanno anche osservato che i topi immunocompetenti richiesto meno tensione per regressione completa che ha fatto topi immunocompromessi. È stato ipotizzato che potrebbe causare IRE presentazione antigenica migliorata rispetto alla necrosi coagulativa di ablazione termica, ma questo non è stato specificamente studiato.
Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC dalla linea cellulare KPC-Luc 4580 (regalo da J.J. Yeh presso University of North Carolina), che è stato derivato da un tumore sviluppatosi in un maschio LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, per studiare gli effetti locali e sistemici di IRE18,19. Questa linea cellulare che esprime luciferasi è immunogenico e anche cancerogeni in topi C57BL/6 immunocompetenti quando iniettato SQ o orthotopically e produce in modo affidabile le metastasi del fegato quando iniettato nella milza. Abbiamo utilizzato un generatore di impulsi programmabile onda quadra per consegnare 100 µs impulsi di energia elettrica ad un rapporto di tensione/distanza di 1.500 V/cm utilizzando una sonda di allineamento di due aghi (separati da 5 mm) o platino pinzette-elettrodi ai tumori SQ o ortotopico, rispettivamente, in topi di modellare gli effetti di IRE in un piccolo animale.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 square wave electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 needle array electrode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Safety foot switch</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezer-trode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&amp;nbsp;45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>19090646</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC1292810</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferrin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse strain C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>000664/Black 6</td><td></td></tr><tr><td>Cell line (KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab at University of North Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol )</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Digital calipers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels, Sterile</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Suture Needle, 45 cm, Size 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Suture Needle, 45 cm, Size 4-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Warming Pad&amp;nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Hair Clipper</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drape</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

a syngeneic pancreatic cancer mouse model to study the effects of irreversible electroporation

Cancro del pancreas (PC), una malattia che uccide circa 40.000 pazienti ogni anno negli Stati Uniti, ha eluso con successo diversi approcci terapeutici che le strategie immunoterapeutiche promettente. Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non termica che induce la morte delle cellule tumorali senza distruzione delle strutture adiacenti collagene, consentendo in tal modo la procedura deve essere eseguita nei tumori molto vicino ai vasi sanguigni. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE risultati nella morte cellulare apoptotica graduale, insieme a necrosi immediata ablazione indotto ed è attualmente in uso clinico per i pazienti selezionati con PC localmente avanzato. Un ablativo, non bersaglio procedura specifica come IRE può indurre una miriade di risposte nel microambiente tumorale. Pochi studi hanno affrontato gli effetti di IRE sulla crescita del tumore in altri tipi di tumore, ma nessuno si sono concentrati sul PC. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC in cui sottocutaneo (SQ) e orthotopic tumori possono essere trattati con successo con IRE in un ambiente altamente controllato, facilitando le varie routine di post di studi longitudinali. Questo modello animale serve come un sistema robusto per studiare gli effetti dell'IRE e modi per migliorare l'efficacia clinica di IRE.

Abbiamo seguito la procedura descritta sopra e generato tumori SQ sul 5-6 settimana vecchio tipo selvatico C57BL/6 topi inoculati con 1 x 106 cellule con 50% BMM. Quando le dimensioni del tumore ha raggiunto 5-6 mm di diametro, alcuni dei topi sono stati sacrificati, i loro tumori sono stati asportati e impiantato orthotopically in un destinatario topi C57BL/6. IRE è stata effettuata 10 giorni dopo l'impianto come illustrato nella timeline nella Figura 1</...

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A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non-termica utilizzata per il trattamento del cancro del pancreas localmente avanzato. Essendo una tecnica relativamente nuova, gli effetti di IRE sulla crescita del tumore sono capiti male. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo che facilita lo studio degli effetti dell'IRE su cancro del pancreas.

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K Views.  University California San Diego. Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non-termica utilizzata per il trattamento del cancro del pancreas localmente avanzato. Essendo una tecnica relativamente nuova, gli effetti di IRE sulla crescita del tumore sono capiti male. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo che facilita lo studio degli effetti dell'IRE su cancro del pancreas.

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel therapies in pancreatic cancer. Tumor onset is variable in the KPC model between 8 weeks and several months. Therefore, non-invasive imaging tools are required to screen for tumor onset and monitor for response to treatment. To address this issue, different approaches have emerged over the last years. High resolution ultrasound has major advantages such as non-invasiveness, fast session times and a high image resolution without radiation exposure. However, ultrasound in mice is not trivial and sufficient anatomical knowledge and practical skills are required to successfully perform high resolution ultrasound in preclinical pancreatic cancer models. With the following article, a detailed hands-on guide for abdominal ultrasound in murine models with a particular focus on endogenous pancreatic cancer models is presented. Furthermore, a summary of common mistakes and how to avoid them is provided.

This article describes the utilization of high-resolution ultrasound in genetically engineered pancreatic cancer mice. The primary aim is to provide a detailed instruction for detection and evaluation of endogenous pancreatic tumors.

Utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione per Monitor l'inizio del tumore e la crescita nei modelli geneticamente del cancro del pancreas

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Un modello ortotopico di topo resezionale del cancro al pancreas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts to Model Pancreatic Cancer

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a very complex disease characterized by a heterogeneous tumor microenvironment made up of a diverse stroma, immune cells, vessels, nerves, and extracellular matrix components. Over the years, different mouse models of PDAC have been developed to address the challenges posed by its progression, metastatic potential, and phenotypic heterogeneity. Immunocompetent mouse orthotopic allografts of PDAC have shown good promise owing to their fast and reproducible tumor progression in comparison to genetically engineered mouse models. Moreover, combined with their ability to mimic the biological features observed in autochthonous PDAC, cell line-based orthotopic allograft mouse models enable large-scale in vivo experiments. Thus, these models are widely used in preclinical studies for rapid genotype-phenotype and drug-response analyses. The aim of this protocol is to provide a reproducible and robust approach to successfully inject primary mouse PDAC cell cultures into the pancreas of syngeneic recipient mice. In addition to the technical details, important information is given that must be considered before performing these experiments.

Syngeneic mouse orthotopic allografts of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) recapitulate the biology, phenotypes, and therapeutic responses of disease subtypes. Owing to their fast, reproducible tumor progression, they are widely used in preclinical studies. Here, we show common practices to generate these models, injecting syngeneic murine PDAC cultures into the pancreas.

Allotrapianti ortotopici singeneici di topo per modello di cancro del pancreas

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a very complex disease characterized by a heterogeneous tumor microenvironment made up of a diverse stroma, ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Medicina

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Contrasto dinamico migliorato risonanza magnetica di un modello ortotopico cancro del pancreas mouse

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Bioluminescent Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model: A Non-invasive Technique to Monitor Cancer Progression in Mice

Source: Chai, M. G., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50395/" target="_blank">Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
This video demonstrates an orthotopic model of pancreatic cancer that utilizes Matrigel for localized cell delivery and&#160;in vivo&#160;bioluminescence imaging for non-invasive monitoring of tumor progression. The orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and could be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Modello murino di carcinoma pancreatico ortotopico bioluminescente: una tecnica non invasiva per monitorare la progressione del cancro nei topi

Source: Chai, M. G., et al. Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
This video demonstrates an ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Orthotopic Homograft Tumor Transplantation: A Technique to Generate Pancreatic Tumor Mouse Models

Source: An, X. et al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/57460/" target="_blank">Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry</a>. J. Vis. Exp. (2018)
The video explains a stepwise surgical method for orthotopic implantation of a tumor fragment from a cancerous donor to the pancreas of a non-cancerous recipient mice for development of pancreatic cancer. Orthotopically implanted PDAC could recapture the tissue microenvironment of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models more accurately.

Trapianto di tumore omotrapianto ortotopico: una tecnica per generare modelli murini di tumore pancreatico

Source: An, X. et al.&#160;Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. ...