Questo protocollo funziona con campioni provenienti da cuori umani e animali, anche dopo ore di trasporto. Fino a 200 miociti per milligrammo possono essere isolati da fette di tessuto tagliate con vibratome. L'analisi elettrofisiologia, strutturale e biochimica dei cardiomiociti, aiuta a scoprire e comprendere meglio i meccanismi delle malattie cardiache.
Dopo aver riempito un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri, con 20 millilitri di soluzione di taglio a freddo, posizionare il campione di tessuto nel piatto di coltura. Mantenere il piatto di coltura su un piatto raffreddato a 4 gradi Celsius. Tieni presente che i campioni di tessuto viventi degli animali e soprattutto degli esseri umani sono potenzialmente infettivi.
Utilizzare forbici o bisturi, per rimuovere il tessuto fibrotico in eccesso e il grasso epicardiale, dal campione. Per un'elaborazione ottimale del vibratoma di campioni di tessuto più grandi, utilizzare il bisturi per tagliare otto cubi millimetri dal tessuto. Per campioni più piccoli da biopsie, questo non è necessario.
Si può identificare l'epicardio con lo strato di grasso epicardiale. Dopo aver rimosso il grasso in eccesso, posizionare il blocco di tessuto, nel piatto, con l'epicardio rivolto verso il basso. Per prepararsi all'incorporamento dei tessuti, far bollire 400 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione in dieci millilitri di soluzione di taglio.
Riempire una siringa da dieci millilitri con il gel di agarosio sciolto a caldo. Sigillare la siringa e posizionare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti, per consentire all'agarosio di equilibrare. Usando le forcep, spostare il campione di assetto in un piatto pulito di coltura tissutale da 35 millimetri, con l'epicardio rivolto verso il basso.
Quindi, rimuovere il liquido in eccesso dal campione, con un tampone sterile. Fissare il campione contro il movimento, tenendolo con le forcette. E svuotare la siringa di agarosio sopra di essa, assicurandosi di immergere completamente l'esemplare.
Posizionare immediatamente il piatto sul ghiaccio e lasciare solidificare l'agarosio per 10 minuti. Montare una lama di rasoio inutilizzata sul porta lama del vibratomo. Se possibile, calibrare il vibratoma, regolando la deflessione Z della lama.
Utilizzare un bisturi per asportare un blocco di tessuto di agarosio che si adatta al supporto del campione del vibratomo. Per garantire la stabilità, assicurarsi che il tessuto sia ancora sufficientemente immerso nell'agarosio. Con margini di agarosio, di almeno otto millimetri.
Applicare un sottile strato di colla cianoacrilato sul supporto del campione. E premere delicatamente il blocco di tessuto di agarosio, sul supporto. Costruisci un bagno vibratomo, con soluzione di taglio.
Quindi, riempire il serbatoio di raffreddamento esterno del vibratomo con ghiaccio frantumato, per mantenere una temperatura da quattro a sei gradi Celsius, durante tutto il processo di taglio. Posizionare il portapenne, contenente il blocco di tessuto di agarosio, nel bagno del vibratomo. Utilizzando le impostazioni del vibratoma descritte nel manoscritto, generare fette spesse 300 microlitri.
È fondamentale creare sezioni in epicardio parallelo perché è così che le fibre di cardiomiocita sono allineate nella parete ventricolare. Altrimenti, ci saranno troppi danni. Utilizzare un microscopio a luce standard, per controllare l'allineamento dei cardiomiociti e delle fette di tessuto.
Per evitare di danneggiare il tessuto, tenere l'agarosio, invece del tessuto stesso. Una fibra di cardiomiocita, dovrebbe essere allineata uniformemente e i miociti, non dovrebbero essere contratti. Posizionare una piastra termica sullo shaker di laboratorio e scaldarla a 37 gradi Celsius.
Avviare lo shaker di laboratorio a 65 giri/min. Sciogliere la proteinasi in due millilitri della prima soluzione. E sciogliere la collagenasi, in due millilitri della prima soluzione.
Ma non mescolare la proteinasi e la collagenasi. Aggiungere cloruro di calcio alla soluzione di collagenasi, per una concentrazione finale, di cinque micromolari. Incubare entrambe le soluzioni a 37 gradi Celsius.
Utilizzare le forcep per trasferire una fetta di tessuto in un piatto pulito di coltura tissutale da 60 millimetri. Con cinque millimetri di soluzione di taglio pre-refrigerata. Tenendo il piatto sul ghiaccio o su una piastra fredda, rimuovere con cura l'agarosio dal tessuto, usando una lama o una forza.
Per eseguire il lavaggio iniziale delle fette di tessuto, posizionare un piatto pulito di coltura tissutale da 35 millimetri sulla lama di calore. E riempirlo, con due millimetri di soluzione pre-riscaldata uno. Trasferire una o due fette di tessuto sul piatto preparato.
Quindi utilizzare una pipetta di un millimetro, per le fasi di lavaggio. Dopo aver lavato le fette, rimuovere la soluzione uno dal piatto e aggiungere due millilitri della soluzione proteicasi. Incubare le fette per 12 minuti sulla lama di calore, con lo shaker a 65 giri/min.
Lavare le fette di tessuto altre due volte, con due millilitri di soluzione preri warmed uno. Quindi, rimuovere la soluzione uno dal piatto e aggiungere due millilitri di soluzione di collagenasi. Incubare le fette per almeno 30 minuti sulla lama di calore, con scuotimento a 65 giri/min.
Dopo 15 minuti di incubazione, controllare la presenza gratuita di miociti individuali, esaminando il piatto al microscopio leggero. Continuare a controllare ogni cinque minuti, fino a quando i singoli miociti non sono visibili. Quindi, alt digestione lavando le fette due volte, con due millilitri di soluzione pre-riscaldata due.
E riempire il piatto, con due millilitri di soluzione due. Estrarre con cura le fibre della fetta di tessuto, usando forcelle fini. Continuare a lavorare con attenzione, per evitare di danneggiare i cardiomiociti.
E pipetta più volte, con un solo uso oltre la pipetta. Quindi, confermare che i cardiomiociti a forma di asta si sono separati, esaminando il piatto, al microscopio leggero. Riposizionare il piatto sulla piastra termica a 37 gradi Celsius e agitare scuotendo.
Aggiungendo soluzioni di 10 millimolare e 100 millimolare di cloruro di calcio, aumentare lentamente la concentrazione di calcio della sospensione tissutale da cinque micromolari a 1,5 millimolari. Quando l'aumento di calcio è completo, utilizzare le flesse per rimuovere eventuali blocchi di tessuto non digeriti rimanenti. In primo luogo, fermare l'agitazione della sospensione.
Successivamente, utilizzando una pipetta da 1000 microliter, rimuovere lentamente 1/3 della soluzione, dalla parte superiore della sospensione. Evitare l'aspirazione dei cardiomiociti. Quindi aggiungere 700 microlitri della soluzione tre, alle cellule.
Dopo 10 minuti di agitazione, ripetere questi passaggi di lavaggio. Trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. E permettere ai cardiomiociti di sedimentare a temperatura ambiente, per un minimo di 10 minuti e un massimo di 30 minuti.
Rimuovere completamente il supernatante. E rimospendare il pellet in soluzione di tirolo modificata o il tampone di sperimentazione desiderato. Utilizzando un microscopio a luce, verificare la qualità della cella.
Dal 30 al 50% dei cardiomiociti deve essere a forma di asta, liscia senza croste di membrana. E display, chiare striature incrociate. Per verificare l'efficienza di isolamento, il protocollo è stato applicato al miocardio del ratto.
E rispetto all'isolamento attraverso la perfusione coronarica e l'isolamento, da piccoli pezzi di tessuto. Una percentuale inferiore di cellule a forma di asta è stata osservata quando si utilizza il protocollo, quindi dopo l'isolamento per perfusione. Ma il numero totale era ancora alto.
Al contrario, l'isolamento dai pezzi di tessuto, ha prodotto meno cellule a forma di asta. Citometria del flusso, è stato utilizzato per confrontare quantitativamente i risultati. L'isolamento dei cardiomiociti dalle fette tissutali, non raggiunge la resa ottenuta per perfusione coronarica.
Ma fornisce rese significativamente più elevate rispetto all'isolamento dei miociti, dai pezzi di tessuto. Successivamente, il protocollo è stato applicato al miocardio umano. L'isolamento dalle fette miocardici, ha prodotto numeri di Hyde e una grande proporzione di miociti umani a forma di bastone.
E solo una piccola percentuale di cardiomiociti arrotondati. L'isolamento dalle fette del miocardio, ha comportato un numero sorprendentemente più elevato di miociti a forma di bastone, rispetto all'isolamento dai pezzi di tessuto. La quantificazione fotometrica ha confermato una vitalità del miocita sostanzialmente più elevata dopo l'isolamento dalle fette del miocardio.
Le cellule umane, isolate con il protocollo descritto, possono essere sottoposte ad analisi strutturali. Colorazione alfa actina, ha rivelato un denso modello di linea Z regolare e una lunghezza media del sarcomero di 1,92 micrometri, nei cardiomiociti a riposo. Colorazione LTCC e RyR, ha mostrato che l'ammasso chiaro è co-localizzato vicino alla membrana cellulare e ai tubuli T.
I cardiomiociti isolati erano eccitabili e potevano essere utilizzati per studi sull'elettrofisiologia cellulare o sull'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione. Azione potenziale forma e durata, era nella gamma riportata da altri, per i cardiomiociti ventricolari, dal cuore umano in fallimento. I transitori di calcio registrati dalla scansione delle linee vocali di Khan, mostrarono un chiaro upstroke dopo la stimolazione.
E, un rapporto segnale/rumore accettabile. L'accorciamento del cardiomiocita per contrazione può essere visto dalla deflessione del bordo inferiore della cella. A causa dell'elevato numero di cardiomiociti isolatori ottenuti da questo protocollo, la coltura cellulare è possibile.
Ciò può consentire il trasferimento genico, i test farmacologici e l'ingegneria tissutale dei cardiomiociti umani. Un'applicazione importante, è la verifica dei risultati, dai modelli animali nelle cellule umane. L'insufficienza cardiaca è una sindrome clinica con opzioni terapeutiche molto limitate.
Il miglioramento delle tecniche di isolamento dei cardiomiociti aiuterà a identificare gli obiettivi cellulari per la diagnosi e le terapie future.
