Gli autori desidera ringraziare Otterbein University per Undergraduate Student Research Fellowships e Student Research Fund Awards GVK e SGK; e il memoriale di Professore Gilbert E. Mills Otterbein dotato sabbatico programma Award e il dipartimento di biologia e la ricerca di facoltà di Scienze della terra e la borsa di studio dotato Award per JAB. Il fondo di corno dotato studente ricerca Jane nelle scienze e Bert è stato assegnato a GVK e SGK. Gli autori vorrebbero anche Duquesne University Undergraduate programma borse di studio finanziato GVK e SGK con gratitudine. Gli studenti universitari ricerche ex Juniata College, Ryan Johnson e Lindsey Draper ha contribuito le immagini di microscopia per figure 2 e 3, rispettivamente.

1. preparare gli strumenti, terreni di coltura, soluzioni e capsule di Petri
<ol><li>Stuzzicadenti di autoclave in un becher da mL 50 coperti con carta stagnola per mantenere sterile.</li>
	<li>Sterilizzare tutti i prodotti secchi che saranno utilizzati (suggerimenti, bastoni, vetreria, ecc.) in autoclave. Nota: attenzione! Seguire tutte le indicazioni di sicurezza per il modello di autoclave utilizzato. Autoclavi rappresentano un rischio per gli effetti, ustioni da contatto con superfici calde, materiali e media e a vapore. Per sicurezza autoclave, vedi "Corretto uso di autoclavi"34.</li>
	<li>
Preparare la MS agar (mannitolo soia farina (SFM))14 a crescere culture.
	<ol>
<li>Aggiungere 5 g di farina di soia e 5 g di agar in bottiglia da 1L.</li>
		<li>Sciogliere 5 g di mannitolo in 250 mL di acqua di rubinetto e versare nel matraccio contenente la farina di soia e l'agar.</li>
		<li>Aggiungere un tappo di schiuma e stagnola per l'apertura della boccetta e autoclave a 121 ° C, 15 psi per almeno 30 min. Attenzione: Questo mezzo si riduce facilmente. Utilizzare un pallone che può contenere almeno quattro volte il volume effettivo di agar MS essere sterilizzato nell'autoclave. Pentola a pressione standard può essere utilizzata al posto di un autoclave con simili considerazioni di sicurezza. In alternativa, un forno a microonde può essere utilizzato per sterilizzare materiali e mezzi se ad un'autoclave non è possibile35,36. Insegnanti delle scuole superiori si consiglia inoltre di collaborare con i locali scuole o Università per accedere in autoclave forniture.</li>
		<li>Media freschi fino a quando è abbastanza comodo da maneggiare. Fare attenzione a non raffreddarlo troppo a lungo perché agar solidifica a temperature inferiori a 50 ° C.</li>
		<li>Versare MS agar dal pallone in Petri sterili fino alla parte inferiore di ogni scatola di Petri è circa la metà piena (circa 25 mL di media per ogni piatto di Petri). Lasciar per solidificare prima di utilizzare piastre di agar. Conservare le piastre di agar in un sacchetto di plastica a temperatura ambiente fino a quando necessario. Nota: Piastre di Agar possono anche essere conservati in frigorifero, soprattutto se gli antibiotici sono necessari in media.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. striscia Streptomyces sulle piastre per propagazione
<ol><li>Ceppi di Streptomyces striscia sulle piastre di agar MS alle singole colonie utilizzando un metodo standard, come il quadrante inoculare il metodo come mostrato in Sanders, 201237. Nota: Un'ansa da inoculo o stuzzicadenti sterili possono essere utilizzati. Opzionale: Altri mezzi di comunicazione sono comunemente usati per le specie di Streptomyces , come R2YE e minimo di media14.</li>
	<li>Incubare le piastre a 30 ° C.</li>
	<li>Restreak piastre selezionando una singola Colonia ogni 4 – 6 giorni. Come età di colonie che diventano inclini a mutazione casuale.</li>
</ol>3. creare scorte miceliari glicerolo per deposito batterica
Nota: Miceliari scorte possono essere create per tutti i ceppi di Streptomyces , tra cui whi bld ceppi e altri mutanti inerente allo sviluppo che sono in grado di completare la sporulazione.
<ol><li>Macerare 15 – 20 colonie in 200 – 500 µ l di glicerolo 20% utilizzando un applicatore sterile tassello di legno.</li>
	<li>Trasferire l'impasto di colonie macerati in una provetta di cultura congelatore 1,5 mL, utilizzando una micropipetta o una pipetta sterile. Nota: Le basi di utilizzo della micropipetta sono coperti altrove38.</li>
	<li>Aggiungere sufficiente glicerolo 20% per rendere il volume finale 1 mL e mescolare delicatamente. Conservare i campioni a-80 ° C. Nota: attenzione! Usare guanti di sicurezza criogenico e un camice da laboratorio per proteggere la pelle dal contatto con il freddo estremo. In alternativa, un congelatore a-20 ° C può essere utilizzato con potenziale riduzione del tempo di conservazione a lungo termine. Evitare eccessiva di congelamento e scongelamento per estendere la redditività.</li>
</ol>4. creare scorte di Spore di glicerolo per ceppi in grado di sporulazione
Nota: Scorte di Spore sono preferibili per la redditività a lungo termine ma solo sono fattibili per i ceppi che sono in grado di completare la sporulazione.
<ol><li>
Sviluppa 100 µ l di materiale macerato (dal punto 3.1) su una piastra di agar per ottenere un prato confluente di crescita37. Nota: Placcatura di diffusione è mostrato in Sanders37 (modifica: un giradischi non è richiesto.). La piastra può essere attivata con una mano mentre con l'altra mano per spostare il diffusore in modo dolce e indietro movimento tutti i supporti di agar.<ol>
<li>Pipettare 100 µ l di micelio macerato al centro di una piastra di agar di MS.</li>
		<li>Sterilizzare un vetro o metallo strumento di diffusione parzialmente sommergendo in etanolo al 70% e passando il diffusore una volta lentamente attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per accelerare l'evaporazione dell'etanolo. Attenzione: L'etanolo è altamente infiammabile. Non posizionare il supporto a stella fiammeggiante in etanolo o consentire il fiammeggiante goccia di etanolo per cadere il piatto di etanolo. In alternativa, utilizzare un tampone di cotone sterile monouso per diffondere i batteri sulla piastra, che non richiede alcuna etanolo o fiamma.</li>
		<li>Disabilita l'agar MS piastra con una sola mano, mentre usando un retro e indietro scopante per inoculare la piastra con la spatola sterile.</li>
		<li>Incubare per 5 – 7 giorni a 30 ° C fino a quando il ceppo è ben sporulato. Nota: Tempi di incubazione variano a seconda della specie e ceppo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di soluzione fisiologica sterile (0,8% NaCl) al centro di un prato confluente di cellule di Streptomyces che ha subito la sporulazione.</li>
	<li>Raccogliere le spore strofinando delicatamente la superficie del micelio con una sterile inoculando loop (o un batuffolo di cotone), lentamente spostandosi verso il bordo del prato.</li>
	<li>Dispensare la soluzione fisiologica contenente spore in una provetta conica da 15 mL. Vortice vigorosamente per rompere le catene di spore in singole celle.</li>
	<li>Centrifugare a temperatura ambiente per 5 min a circa 2.500 x g.</li>
	<li>Dispensare il surnatante e scartare. Disperdere il pellet di spora di agitazione vigorosa vortice nella piccola quantità di liquido residuo.</li>
	<li>Risospendere le spore in 1 mL di glicerolo 20% disegnando la soluzione su e giù con una pipetta.</li>
	<li>Trasferire lo stock di spora di glicerolo in una provetta di congelatore 1,5 mL. Conservare a-80 ° C. Attenzione: Usare guanti di sicurezza criogenico e un camice da laboratorio per proteggere la pelle dal contatto con il freddo estremo. In alternativa, un congelatore a-20 ° C può essere utilizzato con potenziale riduzione della redditività nel tempo di immagazzinamento a lungo termine. Evitare eccessiva di congelamento e scongelamento per estendere la redditività.</li>
</ol>5. eseguire la mutagenesi
<ol><li>Eseguire mutagenesi basato sui risultati auspicati a cui fa riferimento l' Introduzione e recentemente rivisto da Baltz, 201639. Nota: Alcuni esperimenti che phenotyping non richiederà di mutagenesi, come l'intento di identificare nuove specie dall'ambiente. Metodi di mutagenesi casuale includono l'uso di un trasposone8,9,10,11,12,13, radiazione UV o sostanze chimiche14. Sito-diretta mutagenesi15,16,17,18,19,20 tecniche possono essere utilizzate per creare specifiche mutazioni puntiformi, delezioni, o altri tipi di mutazioni.</li>
</ol>6. confrontare e registrare l'aspetto visivo
<ol><li>Prendere nota della morfologia di Colonia per ogni mutante rispetto al ceppo selvaggio-tipo dopo striature tutti i ceppi come al punto 2. Confrontare il nuovo isolato a quello di una specie ben studiata, come s. coelicolor o s. venezuelae, quando che caratterizzano la nuova specie di Streptomyces . Nota le caratteristiche (Figura 1) come forma di base, superficie della Colonia (fuzzy, calvo, rugosa, ecc.), opacità, elevazione e pigmentazione (distinguere tra micelio vegetativo, micelio aerea e/o mezzo circostante).</li>
	<li>Etichettare un agar MS piatto e striscia ceppi wild-type e mutanti in modelli di Cuneo (Figura 1). Fare attenzione che il ceppo non tocca un altro ceppo per evitare la contaminazione incrociata. Si noti la data e l'ora che ceppi sono striature sulla piastra. Incubare le piastre a 30 ° C.</li>
	<li>Luogo coltivato di Petri colorata o carta bianca per omogeneizzare lo sfondo. Scrivere su carta il nome del ceppo, data, temperatura di incubazione e ora da primo piatto striature. Prendere immagini digitali della piastra con le informazioni di quest'ultime scritte sullo sfondo carta in modo che la confusione è ridotto al minimo. Nota: La scrittura può essere ritagliata dalla fotografia in un secondo momento se deve essere utilizzato per la preparazione di figura.</li>
</ol>7. eseguire la microscopia di contrasto di fase
<ol><li>Sterilizzare una pinzetta lavaggio in etanolo al 70% e quindi passando attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per far evaporare l'etanolo. Lasciare per raffreddare.</li>
	<li>Sterilizzare le lamelle lavaggio in etanolo al 70% e quindi permettendo ad asciugare in una capsula di Petri sterile.</li>
	<li>
Preparare un vetrino coprioggetti ascensore della crescita batterica da esaminare.
	<ol>
<li>Pick up un coprioggetto sterile con pinzette sterili e inserire il vetrino coprioggetto su una piastra di agar MS dove la crescita batterica è densa. Premere sulla parte posteriore del vetrino coprioggetto delicatamente con le pinzette per garantire sufficiente trasferimento delle spore batteriche e aerea micelio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pick up il coprioggetto dalla piastra e posizionarlo in modo che il lato con il materiale cellulare è rivolto verso la superficie di un vetrino da microscopio, con un calo di 15 µ l di glicerolo al 50% preparato in acqua per il montaggio. Ridurre le bolle di aria posizionando il coprioggetto verso la diapositiva con un'angolazione di 45° e lasciarlo cadere il glicerolo di 50%.</li>
	<li>(Opzionale) Guarnizione con clear nail polacco per la conservazione della diapositiva.</li>
	<li>
Eseguire microscopia di contrasto di fase come descritto da Frohlich40 a vari intervalli di tempo durante i cicli di vita. Nota: Formazione immagine ripetuta consente un'analisi più completa e la capacità di rilevare ritardi nello sviluppo. Ripetere in modo indipendente le osservazioni per garantire accuratezza e riproducibilità.<ol>
<li>Posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio e aggiungere una goccia di olio da immersione al centro del vetrino coprioggetti. Ruotare la fase X 100 obiettivo in inserire e impostare la torretta del condensatore per l'impostazione corretta di fase "corrispondenti". Mettere a fuoco l'immagine utilizzando solo la manopola di regolazione fine, una volta che la lente dell'obiettivo è a contatto con l'olio.</li>
		<li>Esaminare i diversi campi di vista per discernere le differenze evidenti e coerente tra ceppi mutanti e wild type, ad esempio la possibilità di spore di forma, dimensione di spora e forma e numero complessivo di spore (Vedi Figura 2). Nota: Alternative alla microscopia a contrasto di fase includono interferenza differenziale contrasto (DIC) microscopia40 e semplici tecniche di colorazione per utilizzano con microscopi campo luminoso41, come la colorazione viola di cristallo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. eseguire la microscopia a fluorescenza
<ol><li>Sterilizzare una pinzetta lavaggio in etanolo al 70% ed eseguendo quindi attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen.</li>
	<li>Pick up un coprioggetto sterile con pinzette sterili e posto su una piastra di agar MS dove è evidente la crescita batterica. Toccare la parte posteriore del coprivetrino delicatamente con le pinzette per garantire sufficiente trasferimento delle spore batteriche e filamenti aeree.</li>
	<li>Pick up il coprioggetto dalla piastra e posizionarlo in modo che il lato con il materiale cellulare è rivolto verso l'alto, il cartoncino per la facilità nella manipolazione del coprivetrino.</li>
	<li>Inondare il coprioggetto con metanolo ghiacciato (~ 300 µ l per un vetrino coprioggetto di 20 x 20 mm2 ) e lasciate asciugare completamente. Attenzione: Il metanolo è un agente mutageno. Evitare il contatto diretto con la pelle.</li>
	<li>Lavare il vetrino coprioggetto tre volte in soluzione salina tampone fosfato (PBS)42 delicatamente erogazione e rimuovendo la soluzione.</li>
	<li>Aggiungere 15 µ l di 100 μg/ml ioduro di propidio e/o 10 μg/mL frumento-germe-agglutinina coniugata con isotiocianato di fluorescina (WGA-FITC) realizzato in glicerolo al 50% per un vetrino da microscopio con etichetta. Nota: Ioduro di propidio macchie di rosso per rilevare la posizione cromosomica del DNA mentre WGA-FITC macchie verde della parete cellulare del DNA.</li>
	<li>Invertire il vetrino coprioggetto faccia in giù sulla goccia di colorante fluorescente su vetrino. (Facoltativamente) sigillare con smalto trasparente per la conservazione della diapositiva.  Come le tinture sono sensibili alla luce, incubare per 15 minuti in una stanza buia o poco illuminata.</li>
	<li>Osservare i vetrini sotto una lente di obiettivo X 100 utilizzando un contrasto di fase o microscopio DIC equipaggiato con cubetti di eccitazione di epifluorescenza per ioduro di propidio ('Texas Red' filtro impostato o 535/617 nm eccitazione/emissione massimi) e FITC (FITC filtro impostato o 490/525 nm maxima di eccitazione/emissione).</li>
	<li>Porre il vetrino sul palco e messa a fuoco utilizzando le manopole di regolazione grossolana e fine.</li>
	<li>Osservare la fluorescenza come illustrato altrove43.</li>
	<li>Utilizzare un pacchetto di software di analisi immagine gratuito che può aiutare nell'identificazione delle spore con bassa intensità di fluorescenza44.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui presentiamo i protocolli per i ricercatori di Streptomyces per avviare studi includendo i passaggi necessari per propagare ceppi e preparare scorte per l'archiviazione a lungo termine di inizio. Descriviamo quindi i protocolli per la caratterizzazione visiva e microscopiche di ceppi di Streptomyces . Alcuni passi iniziali tipici nei mutanti inerente allo sviluppo che phenotyping sono: 1) esame visivo delle colonie mutante rispetto al wild-type colonie su agar; 2) microscopia di contrasto di fase; e 3) microscopia di fluorescenza di sporogenic IFE aeree. Sulla base del fenotipo visualizzato in questi tre passaggi, una varietà di tecniche può essere impiegata per discernere ulteriormente il fenotipo di un particolare ceppo.
Gli esperimenti iniziali phenotyping sono comunemente usati per caratterizzare nuove specie, identificare mutanti di interesse, parzialmente caratterizzare mutanti e cominciare a discernere il ruolo tipico di un gene particolare basato sul fenotipo di un mutante identificato. I metodi descritti qui sono già stati utilizzati in laboratori di identificare e caratterizzare un'ampia varietà di Streptomyces mutanti, compresi quelli con difetti nella divisione cellulare48,49, di insegnamento universitario 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulazione55,56, micelio aerea formazione57,58, produzione antibiotica59, secondo messaggero segnalazione47e segregazione del cromosoma 60. queste tecniche sono i primi passi fondamentali per determinare il fenotipo dei mutanti in generale e rivelare una grande quantità di informazioni importanti circa il ruolo dei geni di interesse. I metodi possono essere facilmente esteso ad altre specie di Streptomyces e sono già stati utilizzati per descrivere i ceppi di S. griseus, S. venezuelae, S. scabbiae molti altri streptomycetes. I protocolli dei video descritti qui sono tenuti a servire come una risorsa importante per i ricercatori di nuovi entrare in campi di ricerca di Streptomyces , come nella zona del drug discovery. Questo include nuovi istruttori che lavorano per combattere la crisi di resistenza agli antibiotici ed educare il numero incalcolabile di nuovi ricercatori di studente universitario, unendo gli sforzi di crowdsourcing dell'iniziativa mondo piccolo.
Le tecniche qui descritte possono essere facilmente adattate per uso in classe college e scuole superiori oltre a laboratori di ricerca, utilizzando le modifiche descritte nel video e testo. Gli studenti in un modulo di microscopia di anno primo presso un piccolo liberal arts college sono stati in grado di inoculare ceppi, scattare fotografie digitali dei ceppi coltivato su agarizzati ed eseguire la microscopia di fluorescenza e contrasto di fase, che culminarono con la presentazione di un portfolio di Multi-rivestiti figure alla fine del modulo 3 settimana, che rappresenta 15 h di lavoro in laboratorio. Circa 160 studenti del primo anno erano responsabili per la fenotipizzazione iniziale di 320 mutanti trasposone romanzo. Studenti universitari ricerche alle tre istituzioni hanno partecipato la fenotipizzazione iniziale di ulteriori mutanti e la successiva caratterizzazione di molti dei ceppi. I dati completi ottenuti in un periodo relativamente breve di tempo, illustrano il valore dei protocolli descritti qui. Centinaia di altri mutanti è stati archiviati sotto forma di scorte miceliari glicerolo per futuri caratterizzazione.
In seguito gli esperimenti iniziali descritti qui, una varietà di metodi può essere impiegata per estendere la qualità delle informazioni relative al ceppi di interesse. Se la mutazione è sconosciuta, un metodo di genotipizzazione dovrebbe essere impiegato per determinare il tipo e/o la posizione della mutazione. Ad esempio, la mutagenesi casuale trasposone del selvaggio-tipo cromosoma6,7,8,9,10,11,12,13 traduce in colonie che devono essere sottoposti a schermate fenotipiche iniziali come quelle descritte sopra. Quindi il percorso del trasposone dovrebbe essere identificato usando una tecnica come inversa della polimerasi reazione a catena (iPCR)61. Determinare il genotipo di mutanti recentemente scoperte è un passo importante dopo caratterizzazione iniziale.
Alcuni comunemente utilizzati metodi avanzati per analisi phenotyping successivi che possono essere richiamati in aula esplorato attraverso ulteriori ricerche includono la proteina fluorescente verde (GFP) codifica per determinare gli schemi di localizzazione per la proteina di interesse, analisi di espressione genica quali real time PCR quantitativa (qPCR) e pattern di espressione genica globale di selvaggio-tipo contro mutante tramite sequenziamento di RNA (RNA-seq). Fenotipizzazione competenze sono anche necessari per l'analisi di complementazione genetica. In un esperimento di complementazione, la copia di selvaggio-tipo di un gene è stato introdotto in un ceppo mutato per determinare se l'allele appena aggiunto può compensare la perdita di funzione dell'allele mutato. Confrontando il fenotipo del ceppo accompagnato a quello parentale sia il mutante originale, ceppo selvaggio-tipo è necessaria.

Streptomycetes sono batteri Gram-positivi, filamentosi terreno conosciuti per la loro capacità di produrre una varietà di metaboliti secondari, tra cui oltre due terzi degli antibiotici disponibili in commercio, anche come anti-tumorali, farmaci anti-HIV e anti-parassitari 1. S. coelicolor è il membro più geneticamente caratterizzato del genere2,3 ed è la specie utilizzata nei metodi descritti qui. S. coelicolor ha un complesso ciclo di vita che inizia con germinazione di una spora singola, procedendo a un vasto, ramificazione micelio vegetativo che cresce nel terreno di agar. Come procede il ciclo di vita, si formano filamenti aeree che rompere la tensione superficiale del micelio substrato e infine si dividono in lunghe catene di cellule che sono in definitiva convertite in spore mature, grigio-pigmentato. Dispersione di queste spore neonate costituisce l'inizio del prossimo ciclo di vita4.
A causa del suo complesso di differenziazione, S. coelicolor serve come un eccellente modello per lo studio di sviluppo batterico. Storicamente, le mutazioni provocare blocchi per i due principali fasi di sviluppo e producono fenotipi distinti visual. I mutanti (calvo) bld sono bloccati per la formazione di micelio aerea e risultato nella mancanza di un micelio aerea fuzzy, impartendo un aspetto di Colonia "calvo". Mutanti inibita in formazione della spora e maturazione sono indicati come mutanti whi (bianco) perché riescono in genere a produrre livelli di selvaggio-tipo del pigmento grigio spora e il micelio aereo rimane bianco. Altri interessanti mutanti sono inibite in produzione antibiotica, divisione cellulare, segregazione del cromosoma o altri processi importanti4,5.
Nonostante la scoperta di molti geni dello sviluppo in specie di Streptomyces , ci sono molti più ritiene che esistano basata sulla mancanza di saturazione degli schermi mutanti. I nostri laboratori continuano ad identificare nuovi geni dello sviluppo utilizzando un sistema di mini-trasposone che abbiamo costruito. Nuovi ceppi mutanti isolati negli esperimenti di mutagenesi casuale con nostro trasposone subiscono la selezione fenotipica per identificare il possibile ruolo di ogni nuovo di gene scoperto6,7. I metodi per batterica phenotyping descritti qui sono rilevanti per mutanti di Streptomyces isolati da trasposoni mutagenesi8,9,10,11,12, 13 e altri metodi casuali, quali chimica e ultravioletti (UV) mutagenesi14, come pure la costruzione diretta di mutazioni come delezioni del gene utilizzando recombineering15,16 o CRISPR-Cas9 (cluster regolarmente intervallate brevi palindromi ripetizioni) genoma tecnologia17,18,19 e mutazioni puntiformi20di editing.
Come antibiotico-resistenza tra i patogeni diventa sempre più prevalente, l'esigenza di nuovi antibiotici diventa sempre più urgente21,22. "L'iniziativa piccolo mondo" (o SWI) è un efficace di scienza, tecnologia, ingegneria e matematica (STEM) apprendimento23 e ricerca di strategia24 per combattere la resistenza agli antibiotici attraverso il crowdsourcing di studenti universitari e di più recentemente studenti delle scuole superiori. Sostenuto corsi di lavoro include l'identificazione di nuovi microbi del suolo che producono nuovi antibiotici (http://www.smallworldinitiative.org). Si ritiene che delle principali fonti di antibiotici da scoprire continuerà ad essere la specie di Streptomyces trovato in una vasta gamma di suolo e acqua habitat25,26,27,28, 29,31. Recentemente, il nostro laboratorio e il lavoro di altri hanno scoperto e caratterizzato segnalazione geni in specie di Streptomyces che regolano la morfologia e lo sviluppo, tra cui produzione antibiotica7,32, 33. Cambiamenti nell'espressione di questi geni provocano un cambiamento nella quantità e la tempistica di antibiotici prodotti. Fenotipizzazione qualificati di nuove specie e nuovi mutanti Antibiotico-produrre continuerà ad essere importante. Come nuovi istruttori e studenti diventano maggiori contributori al campo del drug discovery, formazione in phenotyping batterica è necessario per il successo di questi individui inesperti. Inoltre, questi esperimenti sono trattabili per high school staminali o laboratori di formazione di microbiologia dell'Università. Essi rappresentano una dimostrazione dei principi base di genetici microbici in un laboratorio di insegnamento impostazione.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes sono batteri filamentosi terreno appartenenti al phylum Actinobacteria che si trovano in tutto il mondo e producono una vasta gamma di antibiotici e di altri metaboliti secondari. Coelicolor degli streptomiceti è una specie ben caratterizzata, non patogeni che è favorevole a una varietà di analisi in laboratorio. I metodi phenotyping descritti qui utilizzano S. coelicolor come un modello streptomycete; Tuttavia, i metodi sono applicabili a tutti i membri di questo genere di grandi dimensioni, nonché alcuni attinomiceti strettamente correlati. Fenotipizzazione è necessario caratterizzare nuove specie di Streptomyces identificato nell'ambiente, ed è anche un primo passo fondamentale nella caratterizzazione dei ceppi mutanti recentemente isolati di Streptomyces. Competenza in phenotyping è importante per i molti nuovi ricercatori che stanno entrando in campo della ricerca di Streptomyces , che comprende lo studio di sviluppo batterico, divisione cellulare, la segregazione del cromosoma e secondo messaggero di segnalazione. Il crowdsourcing recente di antibiotico scoperta attraverso l'isolamento di nuovi microbi del suolo ha provocato una maggiore necessità di formazione in phenotyping per istruttori nuovi nel campo della ricerca di Streptomyces e loro college o high school gli studenti. Questo manoscritto descrive metodi di propagazione di ceppo batterico, deposito e caratterizzazione attraverso l'esame visivo e microscopica. Dopo aver letto questo articolo, nuovi ricercatori (laboratori di microbiologia istruzione e cittadini scienziati) dovrebbero essere in grado di manipolare ceppi di Streptomyces e iniziare esperimenti di caratterizzazione visiva.

Fenotipizzazione iniziali esperimenti sono necessari per la caratterizzazione di ceppi e nuove specie e possono essere utilizzati come un approccio gratuito alla filogenesi e gli esperimenti di ibridazione DNA-DNA che vengono utilizzati per la caratterizzazione di nuove specie. Streptomyces mutanti risultanti da metodi di mutagenesi casuale come chimici, UV, o mutagenesi transposon in genere vengono identificati attraverso schermi diretti, visivo su piastre di agar. Colonie di Streptomyces sono esaminati per i cambiamenti nel fenotipo in confronto il ceppo selvaggio-tipo, parentale. Ad esempio, un micelio aereo colorato leggero potrebbe indicare un livello inferiore di pigmento grigio causato da un difetto in sporulazione, o la mancanza di un aspetto sfocato è indicativa di un blocco nella formazione aerea micelio (Figura 1). Molti streptomycetes producono antibiotici pigmentati in micelio vegetativo o agar circostanti. S. coelicolor produce due antibiotici pigmentati come pure due quelle incolori. Actinorhodin è un antibiotico blu-pigmentato e undecylprodigiosin è un antibiotico pigmentate rosso45. Ceppi che sono stati sottoposti a schermi di Colonia visiva iniziale vengono propagate da striature per singole colonie.
A seguito di identificazione visiva di potenzialmente interessanti, mutanti, ceppi sono sottoposti ad esame microscopico. Contrasto di fase microscopia è particolarmente adatta per esaminare Streptomyces mutanti per difetti di sviluppo, utilizzando il ceppo selvaggio-tipo come controllo (Figura 2). Wild type S. coelicolor colonie in genere producono un micelio aereo di circa due giorni di crescita a 30 ° C su agar MS e lunghe catene di spore da tre giorni di crescita. Il ciclo di vita progredirà leggermente più lento o più veloce su altri tipi di supporti. È imperativo che i mutanti analizzati sotto le stesse condizioni di crescita come il tipo selvaggio quando trarre conclusioni circa i difetti inerenti allo sviluppo e ritardi. Mutanti Calvi possono produrre spore dopo prolungata crescita su agarizzati. Una classe di mutanti denominati mutanti bianchi potrebbero essere ritardati o per formazione della spora, mostrano una riduzione l'abbondanza di spore prodotte, producono spore con difetti di forma o nella taglia, o semplicemente produrre i livelli più bassi del pigmento spora matura, grigio46 . Altri mutanti studiati finora possono essere ritardate o accelerate nella progressione del ciclo di vita come i mutanti colpiti per l'accumulo di molecole (ad es., ciclico-di-GMP47) di segnalazione.
Un semplice follow-up per la tecnica di microscopia chiara sopra descritta è microscopia di fluorescenza usando lo ioduro di propidio per macchia cromosomica del DNA nucleoids e dell'agglutinina germe di grano fluorescente contrassegnati a macchiare la parete cellulare dei setti di sporulazione. Spore manca un cromosoma sarà priva l'ioduro di propidio rosso colorazione, mentre le spore che contengono meno del DNA di solito può essere identificato se essi sembrano diminuiti macchiatura (Figura 3). Agglutinina germe di grano può essere usato per macchiare la parete cellulare e possono essere osservate differenze nella parete cellulare colorazione modelli (cioè, difetti di divisione delle cellule). Nella Figura 4 il selvaggio-tipo ceppo di S. venezuelae, una specie che recentemente viene utilizzata come un altro modello streptomycete a causa del suo ciclo di vita e la capacità di sporulare in liquido45, più veloce è stato macchiato con WGA-FITC delucidare la matrice di scala-come dei setti di divisione che in genere si vedono presto durante la sporulazione.
Le strategie di fenotipizzazione iniziale descritte qui dovrebbero comportare quanto segue: 1) identificazione di ceppi mutanti di interesse per ulteriori studi; 2) acquisito conoscenza circa il mutante recentemente identificato ed il ruolo potenziale del gene, che è stato mutato; 3) la formulazione di una successiva serie di passaggi successivi sperimentale che può essere utilizzato per chiarire ulteriormente il ruolo del gene in questione. Nel caso di un streptomycete recentemente identificata dall'ambiente, il ricercatore otterrà conoscenza della potenziale nuova specie rispetto ai già caratterizzato specie di Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Figura 1: La fotografia di una piastra di agar rappresentativi dimostrando fenotipi macroscopica Colonia di S. coelicolor. La piastra di agar viene illustrato lo sfocato, grigio aspetto visivo del micelio aereo per selvaggio-tipo S. coelicolor ceppo MT1110 (WT) rispetto ai vari mutanti di inserimento casuale trasposone con fenotipi inerente allo sviluppo. Mutanti sono carenti sia un micelio aereo [calvo (bld)] o un micelio aereo con pigmentazione ridotta spora [bianco (whi)]. Mutanti di trasposoni sono stati generati utilizzando mini-Tn5 per inserimento mutagenesi6,7. I ceppi sono stati coltivati su agar MS per 5 giorni a 30 ° C. Capsula di Petri diametro 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Figura 2: Micrografie di contrasto di fase mostrando un rappresentante aerea filamento per S. coelicolor bianco mutante ceppi contenenti mutazioni di inserimento casuale trasposone. (A) mostrato è un filamento aerea di tipo wild rappresentativo che ha subito sincrone, regolarmente distanziati divisioni cellulari, producendo in modo uniforme a forma e dimensioni di spore (MT1110). (B–F) I pannelli restanti mostrano i fenotipi microscopici notevolmente differenti di vari mutanti bianchi che sono stati isolati tramite mutagenesi casuale trasposoni. Pannello B Mostra un filamento aereo che non ha subito la sporulazione, ma invece ha prodotto aree sporgenti all'interno il filamento. Le frecce lunghe in C, Ded F indicano anormalmente grandi spore che sono caratteristici dei mutanti, MIC42, MIC43 e TH49. La breve freccia nel pannello D indica un esempio di un vano di lisato spora. Pannello E Mostra i parzialmente ristretti scomparti più piccoli che sono tipiche delle catene di spore prodotte dal mutante TH10. I ceppi sono stati coltivati su agar MS per 5 giorni a 30 ° C. I mutanti sono estranei a quelli mostrati nella Figura 1. Una spora di wild-type è circa 1,1 µm sull'asse lungo. Barra della scala = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Figura 3: Rappresentante micrografie risultati S. coelicolor mutante cromosoma fenotipi segregazione. (A) A diagramma rappresentazione Mostra il tipico aspetto di colorazione selvaggio-tipo, regolarmente distanziati per una catena di spore (ogni spora contiene DNA cromosomico) rispetto al modello di macchiatura intermittente per un mutante che visualizza un cromosoma difetto di segregazione. (B) ogni coppia di pannelli Mostra la spora stessa catena osservata dall'immagine di contrasto di interferenza differenziale (DIC) sulla sinistra e un'immagine di propidio ioduro-ha macchiato di fluorescenza è mostrata a destra. Il fenotipo di selvaggio-tipo (a, b) viene confrontato con due mutanti di inserimento casuale trasposone (c, d ed e, f). Le frecce indicano le spore privo di DNA. I ceppi sono stati coltivati su agar MS per 5 giorni a 30 ° C. I mutanti mostrati sono estranei a quelli in Figura 1 e Figura 2. Barra della scala = 1 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Figura 4: Micrografo di fluorescenza del ceppo selvaggio-tipo S. venezuelae macchiato con WGA-FITC. (A) A diagramma di un filamento aereo apparirà liscio con non rientri e nessun segno visibile di sporulazione utilizzando la microscopia a contrasto di fase in confronto con la matrice di scala-come di macchiatura della parete cellulare che indica una fase iniziale di sporulazione ha cominciato in quello stesso filamento utilizzando WGA-FITC sotto microscopia di fluorescenza. (B) micrografie di selvaggio-tipo S. venezuelae. (un) filamenti aeree liscio sono presenti tra le catene di spore. (b) entro il micelio mostrato nel pannello un, uno aerea filamento in una fase iniziale nello sviluppo possiede una scala-come matrice di deposizione della parete cellulare. Le frecce indicano la formazione regolarmente distanziati di croce-pareti macchiate dalla WGA-FITC che si sviluppano in modo sincrono all'interno di un singolo filamento aereo come subisce sporulazione inerente allo sviluppo-collegata. Il ceppo è stato coltivato su agar MYM MYM (Maltose, Estratto di Yest, Estratto di alt M) per 38 h a 30 ° C. Barra della scala = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Presentiamo qui i ricercatori per avviare phenotyping per il genere di batteri Streptomycesfarmacologicamente importante protocolli per il debuttante.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.7K Views.  Otterbein University. Presentiamo qui i ricercatori per avviare phenotyping per il genere di batteri Streptomycesfarmacologicamente importante protocolli per il debuttante.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Ricerca

Genetica

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biochimica

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Biologia dello sviluppo

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

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Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Immunologia e infezioni

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Riepilogo

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