La conoscenza della biodisponibilità del ferro è essenziale per la valutazione della qualità nutrizionale del ferro negli alimenti. Il biotest sulle cellule Caco-2 è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza critica di ricerca. Questo saggio biologico è un approccio economico e ad alto rendimento per determinare la biodisponibilità del ferro da diete diverse.
Può essere utilizzato per caratterizzare i fattori che influenzano la biodisponibilità del ferro e perfezionare gli obiettivi dello studio in vivo. A dimostrare la procedura sarà Yongpei Chang, un tecnico di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare le cellule Caco-2 per 7-10 giorni e, una volta che sono disponibili cellule sufficienti, seminare le cellule in un pallone non rivestito di collagene.
Quindi far crescere le cellule in fiaschi per sette giorni e cambiare il mezzo a giorni alterni. Il settimo giorno usa le celle per seminare le piastre multi-pozzetto. Seminare le cellule Caco-2 ad una densità di 50.000 cellule per centimetro quadrato in sei piastre rivestite di collagene.
Aggiungere DMEM integrato con HEPES, FBS e soluzione antibiotica antimicotica all'1% alle piastre. Quindi incubare per 12 giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Continua a cambiare il mezzo almeno ogni due giorni su un programma giornaliero coerente.
Quindi preparare il mezzo essenziale minimo integrato con tubi, soluzione antibiotica antimicotica, idrocortisone, insulina, selenio, triiodotironina e fattore di crescita epidermico. Sostituire il terreno di coltura con due millilitri di questo terreno preparato. Il giorno successivo, sostituirlo con un millilitro del mezzo essenziale minimo a pH 7.
Ora crea un anello di inserimento sterilizzato utilizzando un O-ring in silicone dotato di una membrana di dialisi lavata con acido. Il 13 ° giorno, rimuovere gli inserti dal frigorifero, scolare e sostituire l'acqua con acido cloridrico 0,5 molare. Lasciarlo in una cappa a flusso laminare per almeno un'ora prima dell'uso.
Quindi scolare l'acido cloridrico molare 0,5 e risciacquare con acqua sterile da 18 megaohm. Conservare in acqua sterile da 18 megaohm in una cappa a flusso laminare fino al momento dell'uso. Creare un sistema a due camere inserendo un anello nei pozzetti contenenti le celle della piastra a sei pozzetti e quindi restituire la piastra con gli inserti all'incubatore.
Per preparare la soluzione pancreatina-bile, aggiungere 87,5 grammi di resina a scambio cationico debole all'estratto solubilizzato di pancreatina e bile e utilizzare uno shaker per 30 minuti a temperatura ambiente per mescolare i componenti. Versare il liquame in una colonna grande e scolare la colonna. Quindi centrifugare l'eluente della colonna.
Pesare il campione in una provetta sterile da centrifuga da 50 millilitri. Regolare il pH utilizzando acido cloridrico e aggiungere 10 millilitri di soluzione fisiologica contenente 140 millimolari di cloruro di sodio e cinque millimolari di cloruro di potassio. Quindi impostare il processo di digestione gastrica aggiungendo 0,5 millilitri della soluzione di pepsina suina preparata al campione.
Quindi incubare su uno shaker a dondolo a un'impostazione delicata per un'ora a 37 gradi Celsius e avviare il processo di digestione intestinale di ciascun campione regolando il pH da 5,5 a 6,0 con bicarbonato di sodio molare 1,0. Aggiungere 2,5 millilitri della soluzione biliare pancreatina a ciascuna provetta e regolare il pH da 6,9 a 7,0 con bicarbonato di sodio molare 1,0. Utilizzando la soluzione contenente 140 millimolari di cloruro di sodio e cinque millimolari di cloruro di potassio, aggiungere liquidi in modo che ogni tubo contenga esattamente 15 grammi di materiale totale.
Ora trasferisci 1,5 millilitri di ciascun digesto intestinale nella camera superiore del pozzetto contenente le cellule Caco-2 della piastra di coltura a sei pozzetti. Sostituire il coperchio della piastra e incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% su uno shaker a dondolo a sei oscillazioni al minuto per due ore. Rimuovere l'anello di inserimento con il digest.
Quindi aggiungere un millilitro di mezzo essenziale minimo a pH 7 a ciascun pozzetto e conservare la piastra nell'incubatore per 22 ore. Ora rimuovi il terreno di coltura cellulare e aggiungi due millilitri di acqua da 18 megaohm allo strato mono cellulare. Trasferirlo su un sonicatore e raccogliere l'intero lisato cellulare in micro provette da centrifuga per l'analisi delle proteine cellulari e della ferritina cellulare.
Le varietà manteca hanno mostrato una maggiore disponibilità di ferro rispetto ai controlli di riferimento delle classi di colore modellate bianco e rosso per due anni consecutivi di raccolta. La biodisponibilità del ferro dalle varietà di fagioli bianchi e gialli ha mostrato un aumento dopo la trasformazione in farina. Tuttavia, la biodisponibilità del ferro ha mostrato una diminuzione delle varietà mirtillo, rene rosso e nero.
Una corretta coltura monostrato di cellule Caco-2 è essenziale per il successo di questo biotest. L'attenzione precisa ai dettagli della crescita e del mantenimento è fondamentale per la risposta coerente del saggio biologico. Questo modello annulla gli svantaggi e il costo elevato di altri approcci e consente ai ricercatori di identificare i meccanismi e valutare in modo più completo i fattori che inibiscono e promuovono la biodisponibilità del ferro.
