Il vantaggio principale di questa tecnica è che prima della stimolazione, le cellule vengono disperse uniformemente e quindi stimolate uniformemente in adesione cellulare tandem. A dimostrare la procedura sarà Azuma Kimura, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, trasferire sei millilitri di RPMI 1640 in un tubo raffreddato a quattro gradi Celsius sul ghiaccio.
Utilizzando punte di pipetta di millilitro raffreddate, aggiungere due milligrammi di matrice di membrana basale. Mescolare bene con una pipettazione delicata per renderlo una matrice di membrana basale con una concentrazione di 0,33 milligrammi per millilitro. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire due millilitri della matrice di membrana basale diluita in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 60-90 minuti. Successivamente, mantenere la piastra a temperatura ambiente per un massimo di tre ore, fino a quando non è pronta per l'uso. In primo luogo, aspirare il mezzo usato e utilizzare una pipetta per aggiungere due millilitri di EDTA da 0,5 millimolare ad ogni pozzo per lavare gli hPCS coltivati nella piastra a sei potte.
Quindi, aspirare l'EDTA dai pozzi e aggiungere due millilitri di EDTA fresco da 0,5 millimolare ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aspirare l'EDTA da ogni pozzo.
Aggiungere un millilitro di mezzo di manutenzione hPSC a temperatura ambiente, integrato con 10 micromolare Y27632 ad ogni pozzo. Pipetta delicatamente ma rapidamente per soffiare via le cellule attaccate sulla piastra e dissociare eventuali cellule raggruppate in singole cellule. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo di manutenzione hPSC integrato con 10 micromolare Y27632 per pozzo e mescolare mediante pipettazione.
Successivamente, mescolare 15 microlitri di sospensione cellulare con 15 microlitri di tripano blu nel tubo. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare diluita in diapositive di conteggio delle celle in duplicato. Utilizzando un contatore di celle automatizzato, contare il numero di cella e calcolare la densità cellulare nella sospensione cellulare.
Allocare la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri ad una densità da una a un milione e mezzo di celle per ogni pozzo da utilizzare. Centrifugare il tubo a 200 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta per aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le celle utilizzando un millilitro dello stadio 1A medio per pozzo.
Pipettare delicatamente la sospensione cellulare e quindi aggiungere un altro millilitro dello stadio 1A medio per pozzo. Utilizzando una pipetta da 1000 microliter, aspirare la matrice di membrana basale diluita dai pozzi della piastra di coltura cellulare precedentemente preparata. Pipettare immediatamente delicatamente la sospensione nel tubo e trasferire due millilitri in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi.
Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e posizionare la piastra su una panca pulita a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Successivamente, trasferire attentamente la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e un'atmosfera umidificata per 24 ore. In primo luogo, agitare delicatamente la piastra e utilizzare una pipetta per aspirare il mezzo utilizzato.
Quindi, aggiungere due millilitri di DPBS a ciascun pozzo. Agitare delicatamente nuovamente la piastra e aspirare il DPBS usato. Aggiungere quattro millilitri di stadio 1B medio, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius, ad ogni pozzo.
Trasferire con cura la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e un'atmosfera umidificata alla coltura per 48 ore. Successivamente, agitare delicatamente la piastra e aspirare il mezzo usato. Aggiungere due millilitri di DPBS a ciascun pozzo.
Ripetere questa aspirazione e aggiunta di DPBS un'ulteriore volta. Agitare delicatamente la piastra e aspirare il DPBS usato. Aggiungere quattro millilitri di stadio 1B medio, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius, ad ogni pozzo.
Trasferire con cura la piastra in un'incubatrice, a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e un'atmosfera umidificata alla coltura per 24 ore. In primo luogo, agitare delicatamente la piastra e aspirare il mezzo usato. Aggiungere due millilitri di DPBS a ciascun pozzo della piastra a sei pozzi.
Quindi, agitare delicatamente la piastra e aspirare il DPBS usato. Aggiungere quattro millilitri dello stadio due medio, pre-riscaldati a 37 gradi Celsius, ad ogni pozzo. Trasferire con cura la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e un'atmosfera umidificata alla coltura per quattro giorni.
Agitare delicatamente la piastra e aspirare il mezzo usato. Aggiungere due millilitri di DPBS a ciascun pozzo. Ripetere ancora una volta questo processo di aspirazione e aggiunta di DPPS.
Successivamente, agitare delicatamente la piastra e aspirare il DPBS usato. Aggiungere quattro millilitri dello stadio tre medi, pre-riscaldati a 37 gradi Celsius, ad ogni pozzo. Trasferire con cura la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e un'atmosfera umidificata alla coltura per tre giorni.
In questo studio, gli hIPSE di propagazione sono condensati e formano un monostrato omogeneo adatto alla differenziazione. Gli hIPSE indifferenziati vengono dissociati e ri reinsediati come singole cellule a bassa densità cellulare. Entro un'ora, le celle sono attaccate alla piastra e iniziano a mostrare la sporgenza.
Il primo giorno, le cellule vengono proliferate e ben distribuite per coprire l'80-90% della superficie. Nei giorni tre e quattro, le cellule formano un foglio monostrato omogeneo che può essere descritto come un aspetto di ciottoli. A questo punto, la maggior parte delle cellule smette di esprimere SOX2, che è un marcatore per le cellule indifferenziate, ed esprime invece un marcatore endoderma definitivo, SOX17, a oltre il 90%La maggior parte delle cellule SOX17-positive esprime FOXA2.
Quindi le cellule iniziano ad esprimere i marcatori goptupe primitivi, HNF1-beta e HNF4-alfa, e alla fine esprimono un marcatore progenitore pancreatico foregrato posteriore, PDX1, a più del 90%L'induzione cellulare PDX1-positiva è riproducibile in un'altra linea hIPSE, 1231A3, e una linea hESE, KhES-3. I risultati QRTPCR dell'espressione MRNA dei marcatori di stadio sono coerenti con l'immunostaining e l'espressione MRNA di PDX1 è evidente nella fase tre e aumenta sostanzialmente in seguito. Poiché le cellule ESIPS indifferenziate vengono coltivate come colonie, le singole cellule si trovano localmente in uno stato diverso.
Questo protocollo fornisce un modo per stimolare le cellule in modo uniforme per la differenziazione eletta.
