Ricerca in il laboratorio Spagnoli. è finanziato dalla Associazione Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessione e ERC-2009-Starting Grant HEPATOPANCREATIC.

Il protocollo qui descritto è stato adattato dalla tecnica originariamente descritto in Percival e Slack 9 e ottimizzata per microscopia confocale. 1. Rivestimento di fondo di vetro piatti cultura I seguenti passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. <ol><li> Espianti pancreatiche sono coltivate in 35 mm con piastre Petri da 20 mm di diametro in vetro di micropozzetti di fondo (ad esempio MatTek Corporation). Utilizzare un piatto fondo di vetro per la cultura espianto e per tutta la durata della cultura. Il giorno prima della dissezione e l&#39;isolamento delle gemme pancreatiche, cappotto i micropozzetti con fondo di vetro con fibronectina. </li><li> Diluire fibronectina sterile in coltura cellulare acqua di grado per un 50 mcg / ml concentrazione finale ed aggiungere un volume minimo di esso (~ 150 ml) in 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek che coprono l&#39;intera superficie di vetro (Figura 1E). Porre le capsulein un frigorifero 4 ° C per una notte di incubazione. </li><li> Il giorno della dissezione, aspirare il fibronectina, sciacquare il pozzetto con coltura cellulare acqua di grado e aggiungere un volume minimo di 150 ml di BME (Basal Medio Eagle) media integrato con Pen / Strep (1%), glutammina (1% ) e 50 ug / ml di gentamicina [Medium Dissection]. Lasciare i piatti rivestiti in cappa a flusso laminare fino al momento di piastra espianti. </li></ol> Se non tutti fibronectina rivestite piatti sono utilizzati, essi possono essere conservati fino a 1 settimana a 4 ° C. Non lasciate che l&#39;asciugatura delle stoviglie, riempirli con Medio Dissection e metterli in frigorifero. Oltre a fibronectina, espianti pancreatiche sono state coltivate con successo su vari substrati, quali laminina 9, matrigel 10,11 o membrane microporose 12. A causa dei suoi effetti sulla ramificazione, usiamo fibronectina 9 come substrato. 2. Dissezione di Dpancreatica Bud orsal da E11.5 - E12.5 embrioni di topo <ol><li> Femmine di topo gravide temporizzato al giorno embrionale (E) 11,5 o 12,5 sono sacrificati e gli embrioni sono raccolti con strumenti dissezione precedentemente puliti con il 70% di etanolo. Posizionare l&#39;utero sezionato in 10 cm di piastre contenenti ghiacciata PBS integrato con 50 mg / ml di gentamicina. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio con illuminazione dall&#39;alto, separata l&#39;utero di embrioni in segmenti individuali con piccole forbici o pinze Dumont, delicatamente rimuovere l&#39;muscolare dell&#39;utero e rimuovere gli embrioni singoli, che sono circondati da decidua. Utilizzare le tecniche standard di dissezione embrionali 13 a esporre gli embrioni e rimuovere il sacco vitellino e amnios. Successivamente, rimuovere la parte superiore del corpo dell&#39;embrione (del fegato) e la regione di coda. Ciò consentirà esposizione degli organi interni (Figura 1B). Trasferire la metà del corpo degli embrioni in 10 cm di piastre contenenti ghiacciata medio dissezione BME. </li><li> Orautilizzare transilluminazione solo dal basso di visualizzare e analizzare il bocciolo dorsale del pancreas allo stereomicroscopio. Delicatamente, aprire la metà del corpo dell&#39;embrione facendo una incisione laterale con una pinza. Individuare lo stomaco e la milza. Il bocciolo pancreatico dorsale è attaccato lateralmente alla zona posteriore dello stomaco (Figura 1C). Mediante pinza Dumont, sezionare via la gemma dorsale pancreatico dalle strutture adiacenti, come lo stomaco e la milza, ma lasciando alcune mesenchima intorno dell&#39;epitelio (Figura 1D). Usando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire la gemma isolata in un 35 mm Petri contenente freddo medio dissezione BME supplementato con siero di vitello fetale al 10% [terreno di coltura]. Ripetere questi passaggi fino a quando tutti pancreas sono isolati. Se pancreas di genotipi diversi sono isolati, tenerli separati con Nunc 4 pozzetti. </li></ol> 3. Placcatura e cultura di espianti pancreatici Finale platzione degli espianti viene effettuata in camera di coltura di tessuti e / o in prossimità del tessuto incubatore per minimizzare il movimento fisico delle culture. <ol><li> In condizioni sterili in una cappa a flusso laminare sostituire il Medio BME Dissection nei fibronectina rivestite con piatti Mattek ~ 150 pl di mezzo di coltura BME pre-riscaldata a 37 ° C. </li><li> Con cautela, trasferire i espianti pancreatiche in rivestite piatti Mattek (uno espianto per piastra) a lungo termine cultura utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. Per assicurare la diffusione in coltura, il mesenchima circonda gli espianti possono essere leggermente strappato, se necessario, con un ago sottile. </li><li> Delicatamente, mettere le culture in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% di CO 2) per alcune ore per permettere ai espianti allegare alla pozzetti fondo di vetro. Una volta che sono attaccati, riempire i piatti Mattek con 1,5 ml a 2 ml di terreno di coltura BME preriscaldata a 37 ° C. Il giorno di dissezione è indicato come giorno 0. </li><li> Uomoipulation delle culture explant pancreatiche viene effettuata in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Il mezzo di coltura viene cambiato BME ogni altro giorno, a meno che impongono requisiti sperimentali diversi tempi (es. incubazione di espianti con agenti chimici). Gli espianti possono essere coltivate in questa condizione per 5 giorni fino ad una settimana. </li></ol> 4. Whole-mount Protocollo di colorazione di immunofluorescenza per espianti pancreatiche Tutte le fasi del protocollo immunofluorescenza (da fissazione per imaging) sono effettuate nello stesso piatto MatTek, che produce immagini migliori rispetto una plastica a fondo piatto. Dopo la fissazione, culture espianto del pancreas non è necessaria la conservazione in condizioni di sterilità. <ol><li> Aspirare il terreno di coltura BME e lavare l&#39;espianto una volta con 2 ml di PBS 1X. </li><li> Per il fissaggio espianto sostituire con 2 ml di PBS ghiacciato paraformaldeide 4% (PFA) e posizionare il piatto in ghiaccio per 20 minuti. Agitare delicatamente la piastra di volta intempo, ma evitare le piattaforme a dondolo, come l&#39;espianto può staccare. </li><li> Rimuovere e lavare i PFA explant tre volte con 2 ml di 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente (RT). </li><li> Blocco con 2 ml di soluzione bloccante (1X PBS + 0,1% Triton X-Donkey + 3% Serum) per almeno 30 minuti a RT. </li><li> Diluire anticorpo primario in soluzione di blocco e aggiungere ~ 150 microlitri della diluizione direttamente nella 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek tutta la superficie espianto incubazione per una notte a 4 ° C. Per minimizzare i movimenti fisici, aggiungere anticorpo primario e gli espianti direttamente in camera fredda (4 ° C). Per evitare l&#39;evaporazione, prima di aggiungere l&#39;anticorpo, porre le piastre Mattek in una camera umida. </li><li> Il giorno successivo rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare tre volte con 2 ml di 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) per 30 minuti ciascuno a RT. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario nel bloccare soluzione [secondo le raccomandazioni del produttore, usiamo coloranti asino Alexa Fluor contro secondariaorganismi a diluizione 1:750] e aggiungere ~ 150 microlitri della diluizione direttamente nella 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek, che copre l&#39;intera superficie espianto, per 1-2 ore di incubazione a temperatura ambiente al buio. Per di contrasto nucleare, includono Hoechst con diluizione anticorpo secondario. Per evitare l&#39;evaporazione, prima di aggiungere l&#39;anticorpo, porre le piastre Mattek in una camera umida. </li><li> Lavare tre volte con 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) per 30 minuti ciascuno a RT. </li><li> Prima del montaggio, lavare una volta con PBS 1X per rimuovere Tween-20. Montare con l&#39;aggiunta di una goccia di mezzo di montaggio acquoso (con anti-fading) nel 20 mm micropozzetti delle piastre Mattek. Delicatamente, coprire l&#39;espianto con vetrino coprioggetti. Evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Espianti su piastre Mattek possono essere visualizzati sotto microscopio a contrasto di fase standard o microscopia confocale, a seconda degli obiettivi dell&#39;esperimento. Per l&#39;analisi di microscopia confocale usiamo Zeiss LSM 700 impostazione invertita. Impostare laser appropriate per fluorofori noied. Selezionare un obiettivo che sarà l&#39;immagine del territorio desiderata del espianto pancreatico. A 10X immersione in acqua obiettivo è atto a mantenere l&#39;espianto intero campo visivo. A Obiettivi 40X in acqua o olio-immersione sono adatti a concentrarsi su specifiche regioni del espianto del pancreas con una maggiore risoluzione. Gli espianti possono essere otticamente sezionato e quindi l&#39;acquisizione Z-stack ricostruito in 3D, utilizzando software appropriato. </li></ol> 5. Live-cell imaging Protocollo di espianti pancreatici <ol><li> Installazione camera ambientale: utilizzare un recinto ambientale e una camera di incubazione piccolo [con la temperatura e CO 2 di controllo] che si trova sul palco microscopio. Coltura corretto del pancreas embrionale richiede una temperatura costante di 37 ° C e atmosfera controllata di umidificata 5% CO 2. Camere adatti sono disponibili presso i fornitori diversi (Ad esempio, Zeiss, Nikon, Olympus). Montare la scatola di riscaldamento e di trasformarlo in unt almeno 1 ora prima di imaging inizia a consentire all&#39;apparecchiatura di riscaldare ed equilibrare contenuto di CO2 al 5%. </li><li> Per time-lapse imaging di culture espianto pancreatici, si usa una Zeiss LSM 700 microscopio invertito. Per i laser e selezione oggettiva si veda il punto 4.10. </li><li> Lasciate che l&#39;espianto del pancreas attaccare bene al fondo di vetro piatto prima di iniziare l&#39;imaging dal vivo. [Di solito eseguire l&#39;imaging dal vivo a partire dal giorno 1]. In una cappa a flusso laminare, aspirare e sostituire il mezzo espianto con mezzo fresco coltura BME iniziare con ottimali condizioni nutrizionali. </li><li> Delicatamente trasferire i espianti alla sala microscopio e posizionare il piatto MatTek nella camera di incubazione nel portacampioni del microscopio confocale. </li><li> Preparare l&#39;obiettivo (ad esempio, aggiungere olio o acqua-ambiente secondo la scelta di obiettivo ad immersione) e si concentrano sulla regione di interesse per l&#39;espianto. Chiudere la camera ambientale correttamente. Per evitare l&#39;evaporazione durante il time-lapseacquisizione con acqua-immersione obiettivi, al posto dell&#39;acqua, si raccomanda di usare fluidi viscosi immersione che sono disponibili in commercio (ad es Zeiss Immersol W). </li><li> Impostare intensità del laser, Z-stack i parametri di acquisizione e l&#39;intervallo di tempo (vedi anche la discussione per la risoluzione dei problemi). Avviare l&#39;esperimento. </li><li> Dopo l&#39;imaging, l&#39;esportazione stack Z e tutti i tempi e analizzarli con il software appropriato (ad esempio ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Gemme pancreatiche dorsali (insieme con il mesenchima circostante) sono stati sezionati da embrioni di topo tra E11.5 e E12.5 e placcato direttamente sui piatti con fondo di vetro di coltura (Figura 1). Vasi sanguigni sono presenti nel mesenchima circonda l&#39;epitelio e possono essere visualizzati mediante immunocolorazione per il marcatore endoteliale PECAM 12 (dati non mostrati). Dopo due giorni di cultura und pancreas, espiantierwent crescita significativa e ha iniziato a organizzarsi in ramificate strutture epiteliali, i cui nuclei sono stati positivi per il fattore di trascrizione pancreatico, Pdx1 (Figura 2A-C). La media z spessore di espianti pancreatiche il giorno 3 della cultura è di 60-80 micron. La superficie e volume degli espianti può essere misurata usando software appropriate (ad es Huygens). Morfologia e analisi di immunofluorescenza hanno dimostrato che espianti pancreatiche coltivate utilizzando questo protocollo ricapitolato in differenziazione pancreatica vivo presto e gli eventi morfogenetici 5,10,11,14 (Figura 2). Espianti pancreatici il giorno 4 di cultura ha subito tipica &quot;punta e tronco&quot; segregazione dell&#39;epitelio 8, visualizzando CPA1 + cellule progenitrici alle estremità dei rami epiteliali (Figura 2C) e + insulina differenziate e glucagone + cellule organizzate in cluster all&#39;interno del tronco (Figura 2D ). Inoltre, la pancreatiepitelio c nelle colture ex vivo ha mostrato buona organizzazione del citoscheletro e polarità cellulare, con la localizzazione apicale di F-actina (Figura 2E, in verde) e b1-integrina a livello delle membrane basali (Figura 2E, in rosso). Per studiare pancreatica ramificazione in tempo reale, espianti pancreatici embrionali sono state isolate dal ceppo di due colori fluorescenti topo giornalista membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mg; ceppo di topi è disponibile presso il Laboratorio Jackson) (Figura 3). Ancora fotogrammi da un time-lapse film di mT / mG espianti pancreatiche in coltura sono riportati nella Figura 3. La localizzazione della proteina fluorescente mT a strutture a membrana delinea morfologia cellulare e permette risoluzione di sottili processi cellulari, consentendo di monitorare rimodellamento e la migrazione cellulare nel tempo. Dopo 12 ore time-lapse esperimento il segnale di fluorescenza mT rimane vitale e deterioramentoctable, anche se la sua intensità è ridotta, molto probabilmente a causa fotodanneggiamento (Figura 3). Soluzioni tecniche per evitare o ridurre fotodanneggiamento e fototossicità sono discussi nella sezione di discussione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica della dissezione dorsale gemma pancreas da E12.5 embrione di topo. (A) immagine Brightfield E12.5 di embrione di topo. Il corpo superiore dell&#39;embrione (del fegato) e la regione di coda vengono rimossi per isolare la metà del corpo (B). Le incisioni sono indicati da linee rosse tratteggiate. (C) risultati dissezione Ulteriori dell&#39;esposizione dello stomaco e del duodeno regione (indicato dalla casella tratteggiata). Il germoglio pancreatico dorsale (vedere rosso cerchio tratteggiato) è alla base dello stomaco e vicino al primordio milza. Il sezionato gemma pancreatica dorsale (D) viene trasferito con una pipetta Pasteur nel micropozzetto di un piatto fondo di vetro contenente il mezzo di coltura BME (E, F). Abbreviazioni: STO (stomaco), sp (milza), dp (gemma del pancreas dorsale), duo (duodeno). Bar Scala, 1000 micron (A, C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figura 2. Whole-mount analisi confocale immunofluorescenza delle culture espianto pancreatiche. (A) le immagini campo chiaro di espianti pancreatici al giorno 1 e il giorno 2 di coltura ex vivo. Rosso linea tratteggiata indica l&#39;inizio della ramificazione dell&#39;epitelio. (B) la ricostruzione 3D di tutto il montaggio immunostaining Pdx1 per il giorno 3 cultura del pancreas. Espianti pancreas ha mostrato tubuli di cellule Pdx1 + in fase di ramificazione approfondito di 48 ore di culture. (C) Whole-mount immunocolorazione del giorno 3 espianto pancreatica con anticorpi contro il marcatore di membrana basolaterale E-caderina (ECAD), capostipite marcatore punta, carbossipeptidasi 1 (CPA1) e fosfo-istone H3 (pHH3). La maggior parte del mitotico attivo pHH3 cellule + colocalize alle estremità periferiche con CPA1 cellule +. L tratteggiataines indicano punta dei rami. (D) Whole-mount immunocolorazione per i marcatori lignaggio endocrine, l&#39;insulina (Ins) e glucagone (Gluca) al giorno 3. Le frecce gialle indicano gruppi di Ins + e + Gluca cellule. Inserto (D &#39;), più alto ingrandimento di uno dei cluster cellula endocrina. (E) Whole-mount immunocolorazione del giorno 3 espianto del pancreas per Pdx1, β1 integrina (β1int) e F-actina (Fact). Cellule mesenchimali (asterischi) intercalati tra le cellule epiteliali Pdx1-positivi. Le immagini mostrate in C, D ed E sono singole sezioni confocale ottiche di serie Z. Barre scala, 100 pM (A, B); 50 micron (CE). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante live-cell imaging di espianto vivo pancreas ex colta. (AD) i fotogrammi da un filmato time-lapse di un espianto pancreatica da un mT / mG embrione di topo transgenico. Tempo di imaging è indicato in ore: minuti. L&#39;espianto è stato ripreso a partire dal giorno 1. Z-Stack immaginisono stati acquisiti con un obiettivo 40X immersione in olio ogni 12 min per un totale di 15 ore. Le linee tratteggiate indicano punta dei rami e di confine tra epitelio e mesenchima. Barra della scala, 50 micron.

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	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una volta che il destino del pancreas viene specificato, le cellule progenitrici del pancreas sottoposti proliferazione diffusa, differenziazione e morfogenesi per formare alla fine un organo maturo e funzionale 2,4. Attualmente, come ramificazione avviene nel pancreas e come è collegata alla proliferazione e differenziazione progenitore è ampiamente sconosciuta. Culture espianto pancreatici rappresentano un sistema ideale per chiarire questi processi ex vivo 5,9,11. Grazie alla combinaz...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Anticorpi: Carbossipeptidasi E-caderina F-actina Glucagone Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-istone H3 </td><td> ABD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Ibridoma banca Cella di segnalazione </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12.373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basale medio Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> Cella cultura dell&#39;acqua di grado </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> Piastre di coltura (il fondo di vetro), 35-mm </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello d&#39;oro </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Archivio sol. 1 mg / ml in acqua di grado coltura cellulare </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> 4-pure Multidishes </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopi: Invertito microscopio confocale (LSM 700) Stereomicroscopio (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Obiettivi: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (lavoro. dist 1,8 mm,. Profondità di immagini ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (lavoro. dist 0,28 millimetri,. ~ Profondità di imaging 50 pm) Transilluminazione dal basso e in fibra ottica illuminazione dall&#39;alto </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Archivio soluzione al 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipettare (vetro), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Mantenuto in sterile cONDIZIONI </td></tr><tr><td> Piastre di Petri, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di Petri, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Mantenuto in condizioni di sterilità </td></tr><tr><td> Primavera Forbici lama di 8 millimetri curvo </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3.051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Orologerie foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Il pancreas controlla le funzioni vitali del nostro corpo, compresa la produzione di enzimi digestivi e la regolazione dei livelli di zucchero nel sangue 1. Anche se negli ultimi dieci anni molti studi hanno contribuito a una solida base per la comprensione organogenesi del pancreas, persistono importanti lacune nella nostra conoscenza della formazione pancreas primi 2. Una comprensione completa di questi primi eventi si permettono di percepire lo sviluppo di questo organo, ma anche in materia di malattie incurabili che colpiscono il pancreas, come il diabete o il cancro del pancreas. Infine, questa informazione genererà un progetto per sviluppare terapie di sostituzione cellulare nel contesto del diabete. Durante l&#39;embriogenesi, il pancreas proviene da diverse escrescenze embrionali del endoderma foregut dorsale e ventrale al giorno embrionale (E) 9.5 in embrione di topo 3,4. Entrambi escrescenze evaginate nel mesenchima circostante come solido epiteligemme l, che subiscono la proliferazione, la differenziazione e la ramificazione di generare un organo pienamente maturo 2,5,6. Evidenze recenti hanno suggerito che la crescita e la differenziazione delle linee cellulari pancreatiche, comprese le producono insulina β-cellule, dipende dalla corretta tessuto-architettura, rimodellamento epiteliale e il posizionamento all&#39;interno delle cellule dell&#39;epitelio del pancreas ramificazione 7,8. Tuttavia, come ramificazione morfogenesi si verifica ed è coordinata con la proliferazione e la differenziazione nel pancreas è in gran parte sconosciuto. Questo è in parte dovuto al fatto che le attuali conoscenze circa questi processi di sviluppo è basata quasi esclusivamente su analisi di campioni fissati, mentre gli eventi morfogenetici sono altamente dinamici. Qui, si riporta un metodo per la dissezione e mouse coltura embrionale pancreatico gemme ex vivo su piatti fondo di vetro, che consentono la visualizzazione diretta del pancreas sviluppo (Figura 1). Questo cultoure sistema è idealmente concepito per microscopia confocale a scansione laser e, in particolare, live-cell imaging. Espianti pancreatiche può essere preparato non solo dal tipo selvatico embrioni di topo, ma anche da ceppi di topi geneticamente modificati (transgenici o knockout per esempio), che consente studi in tempo reale di fenotipi mutanti. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo è utile per studiare gli effetti dei composti chimici di sviluppo pancreatico, consentendo di ottenere dati quantitativi circa proliferazione e crescita, allungamento, ramificazione, tubulogenesis e differenziazione. In conclusione, lo sviluppo di un metodo ex pancreas cultura in vivo espianto combinato con imaging ad alta risoluzione fornisce una solida piattaforma per l&#39;osservazione di eventi morfogenetici e la differenziazione che si verificano all&#39;interno del embrione di topo in via di sviluppo.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Qui, si descrive un metodo per l&#39;isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo<em&gt; Ex vivo</emSistema&gt; per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vivo.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K Views.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo Ex vivo per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vi...

Video: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ricerca

Biologia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...