Questo progetto è stato finanziato dall'Università norvegese di Scienze della vita e Consiglio della ricerca della Norvegia, concessione numero 243811 e 244461 (programma di acquacoltura). Siamo grati a Lourdes Catto Tan dell'Università norvegese di Scienze della vita per mantenere la struttura di pesce.

Esperimenti sugli animali effettuati in questo studio sono stati approvati dall'Università norvegese di Scienze della vita, seguenti linee guida per la cura e il benessere degli animali di ricerca.
1. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Tarare gli strumenti di metro Osmometro e pH secondo le istruzioni del produttore per garantire misurazioni corrette.</li>
	<li>
Preparare 500 mL di Ca2 +- e Mg2 +-libera soluzione tampone fosfato di Dulbecco (dPBS), regolare il pH a 7.75 (punto 1.2.1) e l'osmolalità di 290 mOsm/kg (punto 1.2.2) prima di una filtrazione sterile (punto 1.2.3).
	<ol>
<li>Aggiustare il pH a 7.75 con un pHmetro calibrato accuratamente aggiungendo gocce di una soluzione di NaOH 1 M mescolando accuratamente la soluzione.</li>
		<li>Misurare l'osmolarità della soluzione utilizzando un Osmometro calibrato e calcolare la quantità di mannitolo necessaria per aumentare l'osmolalità di 290 mOsm/kg. Aggiungere la quantità necessaria di mannitolo e quindi misurare l'osmolarità della soluzione nuovamente per garantire la corretta regolazione. Nota: La quantità di mannitolo necessario dipende l'osmolalità misurata, che di solito varia tra i diversi lotti. Una molecola di mannitolo è uguale a 1 particella osmotica.</li>
		<li>Filtro sterile la soluzione di dPBS utilizzando un filtro da 0,2 µm. Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno 3 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 500 mL di terreno di coltura Leibovitz (L-15) senza L-glutamina e bicarbonato e supplemento esso con 10 mM di NaHCO3 (punto 1.3.1), 4,5 millimetri di glucosio (punto 1.3.2) e 2 mM glutamina commercialmente disponibili (punto 1.3.3). Regolare la soluzione a 290 mOsm/kg (punto 1.3.4), filtri sterili (passo 1.3.5) e aggiungere 2,5 mL di una soluzione di penicillina-streptomicina (punto 1.3.6). Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno 4 settimane.<ol>
<li>Aggiungere 420 mg di NaHCO3 per 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 10 mM.</li>
		<li>Aggiungere 405 mg di glucosio per 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 4,5 mM.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di brodo di x 100 di una soluzione di glutamina in 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 2 mM. Mescolare fino a quando tutti i soluti sono dissolti.</li>
		<li>Regolare la soluzione a 290 mOsm/kg con mannitolo utilizzando un Osmometro (come avviene nel passaggio 1.2.2).</li>
		<li>Eseguire una filtrazione sterile del mezzo L-15 utilizzando un filtro di 0,2 µm.</li>
		<li>Dopo la filtrazione sterile, aggiungere 2,5 mL di una soluzione di penicillina-streptomicina, corrispondenti a 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 50 mL di una soluzione di tripsina con 1 mg/mL del tipo di tripsina (0,1%) II-S sciolto nel dPBS modificate (preparata al punto 1.2). Rendere le aliquote di 2 mL in provette di plastica sterili e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo. Nota: Aliquote di 2 mL possono essere memorizzate a-20 ° C per almeno 3 mesi.</li>
	<li>Preparare 50 mL di una soluzione di tripsina inibitore utilizzando 1 mg/mL (0,1%) tripsina inibitore tipo ho-s e integrarla con 2 µ g/mL di dnasi disciolto nel dPBS modificate (preparata al punto 1.2). Rendere le aliquote di 2 mL in provette di plastica sterili e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo. Nota: Aliquote di 2 mL possono essere memorizzate a-20 ° C per almeno 3 mesi.</li>
</ol>2. preparazione delle attrezzature
<ol><li>Preparare pipette in vetro da fuoco lucidatura la punta per la dissociazione di cella. Fare consigli con 2 categorie di dimensioni diverse (un'apertura media di 0,6-0,8 µm e una piccola apertura di 0,4 – 0,6 µm) giocando con il tempo e la distanza dalla fiamma ruotando contemporaneamente la pipetta. Posizionare le pipette di vetro in un contenitore di vetro pulito ed autoclave (utilizzando la modalità solida a 105 ° C per 45 min).</li>
	<li>Preparare una scatola di polistirolo con ghiaccio.</li>
	<li>Preparare un tubo di plastica con 1,5 mL di dPBS modificate (preparata al punto 1.2) per trasferire i cadaveri per durante la dissezione e tenerlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare una provetta da 15 mL con 10 mL di dPBS modificate (preparata al punto 1.2) e tenerlo su ghiaccio fino a quando la dissociazione di cella.</li>
	<li>Preparare fresco o Disgelare aliquote della tripsina e soluzioni di inibitore della tripsina (preparate in punti 1.4 e 1.5) e tenerli sul ghiaccio fino all'utilizzo.</li>
	<li>Impostare il bagno di acqua a 26 ° C prima di iniziare la dissezione per permettere all'acqua di raggiungere la temperatura desiderata prima della dissociazione chimica dei cadaveri.</li>
	<li>Pulire tutti gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% prima, durante e dopo l'uso, tra cui una pinzetta da utilizzare per la dissezione e aghi sottili e una piastra della cera per appuntare il pesce. Utilizzare guanti puliti (cambiare e pulire frequentemente) durante l'intera procedura per evitare una potenziale contaminazione delle cellule.</li>
</ol>3. pituitaria dissezione e dissociazione delle cellule
<ol><li>Eutanasia il pesce immergendolo nella fanghiglia di ghiaccio (0 ° C). Lasciare il pesce nella fanghiglia di ghiaccio per almeno 1 min assicurare un'irreversibile shock ipotermico. Nota: Dopo pochi secondi si verifica perdita di equilibrio e di immobilizzazione. Assicurarsi che il pesce sia completamente immersa nell'acqua ghiaccio e non giacciono sopra il ghiaccio, come quest'ultimo verrà causare il soffocamento e potenziale pelle brucia invece di uno shock ipotermico rapido e umano.</li>
	<li>Rapidamente il pesce in una rete di trasferimento ad una piastra di cera sotto il microscopio di dissezione e distruggere la colonna vertebrale di un punzone dell'ago attraverso il collo.</li>
	<li>Bloccare la testa del pesce alla piastra cera usando aghi sottili, inserendo un ago nella parte anteriore (sopra la bocca) e uno su ciascun lato della testa (dietro al cervello) per stabilizzare la testa prima della dissezione.</li>
	<li>Mostra il pesce sotto il microscopio di dissezione e raschiare delicatamente le scaglie nella parte superiore della testa usando una pinzetta con punta angolata.</li>
	<li>Inserire la punta angolata del forcipe fine sotto la pelle dal lato della testa e rimuovere il tetto del cranio spostando lentamente il forcipe in direzione della bocca, mentre si tiene saldamente il forcipe che racchiude il tetto del cranio.</li>
	<li>Tagliare il midollo spinale completamente usando il forcipe con una punta angolata. Nota: Il tempo è un fattore importante, in modo da lavorare in modo efficiente e con precisione per limitare il tempo trascorso dalla dissezione dei cadaveri fino a quando le cellule sono placcate nel piatto. Dopo una certa pratica, dissezione pituitaria dovrebbe prendere circa 2 – 3 min per pesce, di cui solo circa 10 s sono necessarie per scegliere l'ipofisi quando il cervello è già esposta.</li>
	<li>Capovolgere con attenzione il cervello verso la bocca per esporre l'ipofisi e sezionarlo con una pinza pulita con una punta diritta. Trasferire l'ipofisi a un tubo di plastica contenente 1,5 mL per volta dPBS (per dettagli, vedi punto 2.3) posti su ghiaccio. Controllare la punta della pinza sotto il microscopio per garantire che l'ipofisi è aggiunto correttamente al tubo e nulla è lasciato sul forcipe. Nota: Sezionare cadaveri come molti come necessario, a seconda del numero di piastre di coltura che stanno per essere preparati contemporaneamente. Come regola generale, calcolare almeno 10 cadaveri da pesce adulto per ogni piatto per avere una densità appropriata delle cellule (che dipende dall'applicazione a valle).</li>
	<li>Rotazione verso il basso i cadaveri in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente. Rimuovere il dPBS usando una pipetta di vetro con cautela e prendersi cura per evitare di rimuovere qualsiasi cadaveri.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della soluzione di tripsina (preparata al punto 1.4) per lavare i cadaveri, li spin giù in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s e rimuovere la maggior parte del liquido utilizzando una pipetta di vetro prima di aggiungere un ulteriore 1 mL di soluzione di tripsina.</li>
	<li>Incubare la provetta in un bagno di acqua a 26 ° C per 30 minuti, preferibilmente con agitazione delicata, o in alternativa, toccare il tubo di un paio di volte durante il periodo di incubazione.</li>
	<li>Rotazione verso il basso i cadaveri in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e assicurarsi che tutti i cadaveri si trovano nella parte inferiore del tubo. Rimuovere la maggior parte della soluzione di tripsina con una pipetta di vetro e aggiungere 1 mL di soluzione di inibitore della tripsina (preparata al punto 1.5) per inattivare la tripsina e lavare i cadaveri.</li>
	<li>Raccogliere i cadaveri nella parte inferiore del tubo di filatura li giù in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del liquido con una pipetta di vetro e aggiungere 1 mL di soluzione di inibitore della tripsina (preparata al punto 1.5). Posizionare il tubo su un bagno di acqua a 26 ° C per 20 min, preferibilmente con agitazione delicata, o in alternativa, toccare il tubo di un paio di volte durante il periodo di incubazione per inattivare la tripsina.</li>
	<li>Preparare una piastra di coltura cellulare rivestiti con poli-d-lisina di 35mm con un fondo di vetro centrale aggiungendo 2 mL di terreno di L-15 e che lasciare Incubare per almeno 10 min a 26 ° C e con 1% di CO2 in modo che può raggiungere la giusta temperatura ed il pH prima le cellule di placcatura. Nota: Una piastra di coltura della cellula di plastica può anche essere utilizzata. Il vantaggio principale dell'utilizzo di un piatto con un fondo di vetro centralizzata è che il settore in cui le cellule sono placcate è più piccolo, e pertanto meno cellule ipofisarie sono necessari per ogni piatto. Alcune applicazioni a valle potrebbero richiedere anche un fondo di vetro (cioè, alcune tecniche di imaging).</li>
	<li>Impostare la centrifuga raffreddamento per le provette da 15 mL a 4 ° C per consentirgli di raggiungere la temperatura desiderata prima di iniziare la dissociazione meccanica.</li>
	<li>Raccogliere i cadaveri nella parte inferiore del tubo facendo girare giù il tubo con la soluzione di inibitore della tripsina (dal punto 3.11) in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e assicurarsi che tutti i cadaveri si trovano nella parte inferiore del tubo prima attentamente eliminando la maggior parte della soluzione dell'inibitore della tripsina usando una pipetta di vetro. Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti del protocollo in un banco di flusso laminare (LAF) certificati per il lavoro di cella evitare una contaminazione delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di dPBS modificate ghiacciata (preparata al punto 2.4) per i pezzi di tessuto pituitario e succhiare delicatamente i pezzi di tessuto su e giù (6 – 7 x) in una pipetta di vetro lucidati a fuoco (preparata al punto 2.1). Nota: La temperatura è un aspetto essenziale, quindi tenete tutte le soluzioni a 4 ° C. Da questo punto in poi, è necessario eseguire tutti i passaggi su ghiaccio quando possibile.</li>
	<li>Rotazione verso il basso i pezzi di tessuto in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e trasferire con cautela la parte superiore del dPBS contenente le cellule dissociate (quasi 1 mL) ad un nuovo tubo da 15 mL posizionato su ghiaccio. Evitare di spostare la pipetta verso la parte inferiore del tubo dove vengono lasciati i pezzi di tessuto.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.16 – 3,17, dissociare le cellule in 1 mL di dPBS ghiacciata alla volta, fino a quando tutti i 10 mL di dPBS viene utilizzato. Iniziare a utilizzare una pipetta di vetro con un interruttore di una pipetta di vetro con un'apertura più piccola verso la fine e apertura di medie dimensioni (per l'ultimo 3 – 4 mL di dPBS aggiunto) della dissociazione. Se ci sono pezzi di tessuto ancora visibili verso la fine della procedura di dissociazione, aumentare il pipettaggio di circa 10 x verso gli ultimi 2 passaggi di dPBS per dissociazione e infine lasciare i pezzi di tessuto residuo. Risospendere delicatamente le cellule ed evitare di creare bolle, in quanto può causare danni cellulari quando le cellule attaccare alla superficie delle bolle. Nota: Questo è un passaggio fondamentale del presente protocollo e richiede un certo allenamento per ottenere un buon risultato.</li>
	<li>Bilanciare il tubo nella centrifuga (pre-raffreddata a 4 ° C) e spin-down le cellule a 200 x g per 10 min a 4 ° C. Assicurarsi di contrassegnare il lato del tubo dove sarà il pellet cellulare.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il tubo da centrifuga e delicatamente trasferisca il surnatante con una pipetta di vetro ad un tubo di plastica vuoto 15 mL direttamente dopo la centrifugazione. Assicurarsi di rimuovere la maggior parte del surnatante ma fate attenzione a non perdere la piccola pallina di cella (spesso invisibili).</li>
	<li>Attentamente e risospendere il pellet cellulare in 50 – 100 µ l di terreno di coltura di L-15. Nota: A questo punto, è possibile contare le celle e/o eseguire un test di vitalità (ad esempio una cella contando in presenza del blu di trypan utilizzando un emocitometro), ma state attenti che utilizza parte della sospensione cellulare per questo scopo si abbassa il rendimento. Evitare di utilizzare un volume di sospensione grande quanto aumenta il rischio di diffusione fuori del centro del piatto di cellule.</li>
	<li>Goccia a goccia con attenzione le cellule dissociate al centro del piatto di coltura cellulare contenente 2 mL di terreno L-15 (preparato al punto 3.13). Permettono alle cellule di depositarsi sul fondo del piatto per circa 5 min prima di spostarli nell'incubatore, per evitare che le cellule si sono diffuse di fuori la parte sommersa della parte inferiore del vetro.</li>
	<li>Incubare la piastra a 26 ° C e 1% di CO2 per consentire tutte le celle di affondare completamente e attaccare sul fondo del piatto.</li>
	<li>Dopo 30 min, guardate le cellule al microscopio per assicurarsi che essi sono legati alla piastra di coltura.</li>
	<li>Continuare a incubare le cellule a 26 ° C e 1% di CO2.</li>
	<li>Con attenzione cambiare più di (ma non tutto) il mezzo ogni 3 – 4 giorni. Nota: Evitare di modificare il mezzo più frequentemente, poiché potrebbe disturbare le cellule e farli staccare dal fondo di vetro. Utilizzare le celle per gli esperimenti entro una settimana dopo la semina li.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Sistemi di coltura in vitro delle cellule forniscono strumenti potenti per i ricercatori di rispondere a una pletora di diverse domande biologiche se utilizzato nel modo giusto1. È importante ricordare che le cellule dissociate che hanno perso le loro connessioni con le cellule vicine possono essere ottenuti differenti proprietà funzionali che avevano originariamente in vivo. Per evitare di essere a rischio di mal interpretare i risultati ottenuti da esperimenti in vitro</e...

Coltura cellulare è uno dei principali strumenti utilizzati nella ricerca biologica molecolare, fornendo un sistema di modello eccellente per rispondere alle diverse domande biologiche che vanno dal normale fisiologia cellulare a drug screening e carcinogenesi1. Cellule primarie, isolate direttamente dal tessuto animale utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici, sono spesso considerate più biologicamente rilevanti rispetto a linee cellulari come la risposta biologica può essere più vicina alla situazione in vivo . Protocolli per la preparazione di colture cellulari primarie dovrebbero essere ottimizzati per ogni tipo di specie e delle cellule di interesse al fine di imitare le caratteristiche a cui una cella è adattata e ottenere risultati fisiologicamente significativi.
Numerosi protocolli descrivono condizioni di coltura per i sistemi cellulari di mammifero, mentre simili protocolli che descrivono condizioni di coltura primaria per celle di pesce sono piuttosto scarsi in confronto. Le cellule sono vulnerabili a rapidi cambiamenti di temperatura, pH e osmolalità e sono particolarmente fragili durante la procedura di dissociazione. Soluzioni saline commerciali e mezzi di coltura utilizzati per colture cellulari di mammifero non sono ottimali per pesci teleostei, soprattutto in termini di sistemi tampone pH e l'osmolalità. È, pertanto, importante misurare e regolare le soluzioni a livelli fisiologicamente rilevanti di questi parametri nelle specie di interesse.
Colture primarie pituitari sono stati effettuati da diverse specie di pesci teleostei, tra cui la carpa comune (Carpio di Cyprinus)2,3, erba carpa (idella di Ctenopharyngodon)4, ciprino dorato (Carassius auratus di )5, trota iridea (Oncorhynchus mykiss)6,7di anguilla europea (Anguilla anguilla), tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, e Merluzzo bianco (Gadus morhua)10. Oltre alla regolazione della temperatura di incubazione per le specie di interesse, molti di questi protocolli hanno incubato le cellule alle condizioni di mammifero-simili che possono essere non ottimali per le specie di interesse, con un pH da 7.2 a 7.5 in atmosfera umidificata contenenti 3-5% CO2. Inoltre, è poco chiaro se l'osmolalità delle soluzioni utilizzate per la preparazione di molte di queste colture cellulari primarie sono stati adeguati e stabile tra le diverse soluzioni.
L'attuale protocollo è basato sul precedente lavoro con colture primarie da merluzzo10 e comprende la regolazione della temperatura di incubazione, osmolalità, pH e sistemi tampone pH, tra cui la pressione parziale di anidride carbonica (pCO2), a la fisiologia di medaka (o. latipes). Medaka è un pesce d'acqua dolce di piccole dimensioni (3 – 4 cm), originario dell'Asia. In questi giorni, è utilizzato come una specie di modello in molti laboratori di ricerca del mondo, come è relativamente facile da allevare e altamente resistenti a molti comuni pesci malattie11. Ci sono diversi vantaggi di usando medaka come un modello, tra cui una tolleranza di temperatura da 4 – 40 ° C11, un tempo di generazione breve, gli embrioni trasparenti, un sesso-determinazione genica12e un genoma sequenziato13, come pure molti altri risorse genetiche disponibili.
Le condizioni di coltura primaria in questo protocollo sono ottimizzate per abbinare la temperatura di 26 ° C che medakas sono fornite all'interno della struttura di pesce. Ulteriormente, l'osmolalità è ridotto da 320 mOsm/kg da Atlantic cod vivono in acqua salata a 290 mOsm/kg per medaka vivono in acqua dolce ed è conforme il osmolality normale di medaka plasma14. In confronto, il tipico osmolality del plasma dei mammiferi è nella gamma di 275-295 mOsm15. Pesci di vita in una varietà di temperature e hanno branchie che sono a diretto contatto con acqua, rendendo la capacità buffer e pH del sangue e liquido extracellulare nei pesci diversi da quelli nei mammiferi. Terreni di coltura dei mammiferi di solito includono sistemi di polmonatura che provocano un pH di circa 7.4 quando i media sono equilibrati a un atmosfera standard di 5% CO2 in aria umidificata a 37 ° C. Il pH è dipendente dalla temperatura e il valore di pH neutro (in acqua) aumenta con una diminuzione di temperatura16. Intervalli di pH tipici pesci teleostei al plasma, da 7,7 a 7,917. L'ottimizzazione del presente protocollo hanno compreso una riduzione da pH 7.85 per il merluzzo conservato a 12 ° C a pH 7.75 per medaka mantenuto a 26 ° C aumentando la CO2 da 0,5% al 1%.
Inoltre, la capacità di tampone del bicarbonato è molto diversa in pesci e mammiferi. CO2 è facilmente scambiato attraverso le branchie nei pesci e il pCO2 in acqua è solo una piccola frazione del pCO2 nel polmone18. Modifica la temperatura o il pCO2 cambierà il pH e il tampone del mezzo. Di conseguenza, il pH, né il pCO2 consigliato per l'incubazione di cellule di mammifero è ottimale per le cellule di pesce, e di conseguenza, i terreni di coltura deve essere ottimizzato con sistemi tampone contenente valori fisiologicamente rilevanti per i pesci e la particolare specie di interesse. Questo protocollo descrive come preparare colture cellulari primarie da cadaveri medaka e includere le rettifiche dell'incubazione temperatura, osmolarità, pH e pH tampone apparato, oltre ad altri parametri importanti da considerare quando si prepara la cellula primaria culture da specie di mammiferi.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td></tr><tr><td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>L5520</td><td>Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &amp;micro;m PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; equals 420 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&amp;nbsp; D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 &amp;micro;g/mL Streptomycin).</td></tr><tr><td>Trypsin type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 &amp;micro;g/ml Dnase I (see details below).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Straight tip</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Angled 45&amp;deg; tip</td></tr><tr><td>Stereo microscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>Use for dissection of pituitaries.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Techne (Staffordshire, UK)</td><td></td><td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td></tr><tr><td>Pasteur glass pipettes</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Any small table centrigue will do.</td></tr><tr><td>Fine needles/insect pins</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td></tr></tbody></table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Colture cellulari primarie sono un potente strumento comunemente usato dagli scienziati per studiare le proprietà cellulari e i meccanismi delle cellule isolate in un ambiente controllato. Nonostante grandi differenze nella fisiologia tra mammiferi e pesci, protocolli della coltura delle cellule primarie dal pesce sono spesso basata su condizioni di coltura dei mammiferi, spesso con solo lievi modifiche. Le differenze ambientali influenzano non solo la temperatura corporea, ma anche parametri del siero del sangue quali osmolalità, pH e capacità tampone pH. Come mezzi di coltura cellulare e simili soluzioni di lavoro sono destinati a imitare le caratteristiche del liquido extracellulare e/o del siero del sangue in cui una cella è adattata, è fondamentale che questi parametri sono regolati in modo specifico per l'animale in questione.
L'attuale protocollo descrive le condizioni di coltura primaria ottimizzata per medaka (Oryzias latipes). Il protocollo fornisce una procedura dettagliata su come isolare e mantenere sano dissociato cellule ipofisarie per più di una settimana e comprende le seguenti fasi: 1. la regolazione della osmolalità ai valori trovati nel plasma sanguigno di medaka, 2. la regolazione della temperatura di incubazione a temperatura normale medaka (qui nella struttura acquario) e 3. la regolazione del pH e bicarbonato buffer ai valori comparabili ad altre specie di pesci che vivono a temperature simili. I risultati presentati utilizzando il protocollo descritto promuovono risultati fisiologicamente significativi per medaka e possono essere utilizzati come una guida di riferimento di scienziati che fanno colture cellulari primarie da altre specie di mammiferi.

Questo protocollo descrive la preparazione di una cultura di cellula primaria da cadaveri medaka e fornisce le cellule sane che possono essere mantenute in una cultura per almeno una settimana. Il protocollo si basa su valori fisiologici rilevanti per medaka14 e inoltre è ottimizzato per il tessuto pituitario in pesci adulti, utilizzando un pH di 7.75 e un'osmolalità di 290 mOsm/kg durante l'intera procedura dalla raccolta del tessuto al placcato cellule in coltu...

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Qui descriviamo un protocollo per preparare ed effettuare colture primarie di cellule ipofisarie da medaka (Oryzias latipes). Le condizioni ottimizzate in questo protocollo prendere importanti parametri quali temperatura, osmolarità e pH in considerazione imitando le condizioni fisiologiche del pesce, consentendo in tal modo risultati fisiologicamente più significativi.

Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  Norwegian University of Life Sciences. Qui descriviamo un protocollo per preparare ed effettuare colture primarie di cellule ipofisarie da medaka (Oryzias latipes). Le condizioni ottimizzate in questo protocollo prendere importanti parametri quali temperatura, osmolarità e pH in considerazione imitando le condizioni fisiologiche del pesce, consentendo in tal modo risultati fisiologicamente più significativi.

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Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Biologia

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicina

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Neuroscienze

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Preparazione della sospensione unicellulare dall'intestino della tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Terzi, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62165">ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

1. Preparation of solutions

	E2 media (1x)
	
		Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) and 500x E2C (100 mL) solutions by combining all components ...