L'obiettivo principale di questo esperimento è descrivere una procedura laparoscopica di trasferimento dell'embrione nel coniglio come modello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questa lavora per trasferire embrioni utilizzando una tecnica facile e minimamente invasiva. Inoltre, l'efficace protocollo di crioconservazione degli embrioni qui descritto funziona anche per lo stoccaggio a lungo termine degli embrioni di coniglio, fornendo capacità logistiche flessibili in termini di tempo e la capacità di trasportare il campione.
Come sappiamo, le tecnologie di procreazione assistita sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Pertanto, utilizzando entrambe le tecniche, il coniglio può essere utilizzato come modello animale ideale di riproduzione umana per rispondere a domande chiave in questo campo, come gli effetti della manipolazione embrionale in vitro sulla prole. La dimostrazione visiva di queste questioni è fondamentale in quanto le fasi di trasferimento dell'embrione sono difficili da imparare, perché devono essere fatte con grande precisione per garantire il successo della tecnica.
Per la vetrificazione embrionale, immergere gli embrioni in soluzione equilibrante per due minuti, seguita da un minuto di incubazione in soluzione di vetrificazione. Alla fine dell'incubazione, caricare gli embrioni in una mini-cannuccia di plastica da 125 microlitri e accoppiare l'estremità chiusa della mini-cannuccia con un microdispenser di millilitro appropriato. Aspirare il mezzo di base fino a un terzo della lunghezza della paglia, seguito da una piccola bolla d'aria.
Successivamente, utilizzare uno stereomicroscopio per aspirare gli embrioni in 40 microlitri di soluzione di vetrificazione, seguito da un'altra piccola bolla d'aria e da un mezzo di base sufficiente per spostare la prima frazione liquida fino al cotone della mini-paglia. Quindi chiudere l'estremità aperta della mini-cannuccia con un tappo di paglia, immergere la mini-paglia direttamente nell'azoto liquido per ottenere la vetrificazione e conservare la mini-paglia in un dewar di azoto liquido. Per scongelare gli embrioni per un trasferimento, posizionare la mini-cannuccia orizzontalmente a 10 centimetri dal vapore di azoto liquido per 20-30 secondi.
Quando il processo di cristallizzazione inizia all'interno della mini-paglia, immergere la mini-paglia nel bagno d'acqua di 25 gradi celsius per 10-15 secondi. Rimuovere immediatamente i tappi di mini-paglia e cotone e utilizzare un microdispenser accoppiato per espellere il contenuto di mini-paglia in una piastra contenente un mezzo di base di 25 gradi Celsius integrato con soluzione di saccarosio molare 0,33, in cui gli embrioni devono rimanere per cinque minuti. Quindi trasferire gli embrioni su una piastra di mezzo di base fresco per altri cinque minuti di incubazione.
Tutti i giorni prima dell'età degli embrioni da trasferire, osserva la turgidità e il colore delle avvoltoie dei conigli femmine di 4,5 mesi sessualmente maturi disponibili e induci l'ovulazione negli animali ricettivi con una singola iniezione intramuscolare di un microgrammo di acetato di buserelina indipendentemente dal peso corporeo. Il giorno del trasferimento, sciacquare gli embrioni freschi o scongelati in un mezzo di base di 37 gradi Celsius sotto uno stereomicroscopio e collegare un catetere epidurale di 17 gauge opportunamente configurato a una siringa da un millilitro. Aspirare un centimetro di mezzo di base nel catetere, seguito da una piccola bolla d'aria.
Quindi aspira da cinque a sette embrioni e 10 microlitri di mezzo di base, seguiti da un'altra piccola bolla d'aria e un ultimo centimetro di mezzo base. Una volta caricati gli embrioni, posizionare il coniglio ricevente anestetizzato in una gabbia su una fase di riscaldamento e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, radere la pelliccia dall'addome ventrale, pulire l'area chirurgica con sapone gluconato di clorexidina e rimuovere tutti i capelli rimanenti.
Coprire l'area con un drappo sterile con un foro per l'area chirurgica e inserire un trocar endoscopico di cinque centimetri nella cavità addominale, due centimetri caudale al processo zigoide e utilizzare un insufflatore meccanico che regola la pressione per gonfiare la cavità peritoneale. Inserire la fotocamera dell'endoscopio attraverso il trocar endoscopico e inserire l'ago epidurale calibro 17 nella regione inguinale, da due a tre centimetri dall'infundibulum. Inserire il catetere caricato attraverso l'ago epidurale nell'addome e inserire da uno a due centimetri del catetere epidurale attraverso l'infundibulum nell'ampolla.
Deprimere delicatamente lo stantuffo del catetere per rilasciare gli embrioni nell'ovidotto. Entrambe le bolle d'aria devono uscire dal catetere. Rimuovere il catetere subito dopo che gli embrioni sono stati rilasciati e aspirare e rilasciare il mezzo rimanente per confermare l'assenza degli embrioni.
Dopo aver confermato un trasferimento riuscito degli embrioni, rimuovere l'ago epidurale e la fotocamera dell'endoscopio e rilasciare l'anidride carbonica addominale attraverso il trocar endoscopico. Pulire l'incisione del trocar con soluzione di clorexidina e chiudere la ferita con un alluminio micronitato e una medicazione in plastica. Quindi trattare l'animale con gli antibiotici e gli analgesici appropriati e monitorare l'animale fino al completo recupero.
Il trasferimento di embrioni laparoscopici minimamente invasivi colloca il coniglio tra i migliori modelli animali per gli studi riproduttivi, con un'alta percentuale di embrioni freschi trasferiti con conseguente cucciolo. In particolare, valori più elevati si ottengono quando il trasferimento di embrioni freschi viene eseguito con embrioni nella fase delle morulee precoce o compatta. Risultati simili si osservano dopo il trasferimento precoce e compattato di morula di coniglio vetrificato, in particolare con morulae compatte, confermando l'efficacia e l'affidabilità di questa tecnica per il trasferimento di embrioni freschi in vetrificati nei conigli.
Seguendo questa procedura, altri metodi come le tecnologie riproduttive assistive condizionali possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come come l'aggiunta di densità può incorrere in un effetto analgesico più avanti nella vita. Dopo il recente sviluppo, questa tecnica apre la strada agli scienziati nel campo della riproduzione per esplorare questo effetto negli esseri umani in base alla stretta distanza filogenetica tra coniglio e uomo. Pertanto, questa tecnica può fornire risultati facilmente trasferibili alla medicina clinica umana, così come in altre specie di mammiferi.
Non dimenticare che il nostro metodo offre alcuni vantaggi igienici ed economici conformi al concetto di tre R di benessere animale, sostituzione, riduzione e perfezionamento, con l'intenzione di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento.
