1. clonazione e cella linea generazione
<ol><li>PCR amplificano la regione NBB, corrispondono ai residui dell'amminoacido 1-140 (NBB140), da cDNA umano MLKL per telaio standard basati su enzimi di limitazione clonazione con la proteina legante di oligomerizzazione dominio 2 x FK506 (2xFKBP o 2xFV) e Venus fluorescente proteine nella doxiciclina (Dox) - vettore retrovirale inducibile pRetroX-TRE3G per ottenere NBB140- 2xFV-Venus (tabella 1, figure 1A-B).</li>
	<li>Immortalare primario mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) ottenuti dai rispettivi topi disponibili in laboratorio verde di trasfezione transiente con antigene SV40-grande esprimendo il plasmide. Selezionare cellule immortalate in ~ 1 – 2 settimane e mantenere in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM e aminoacidi non essenziali a 37 ° C e 5% di CO2 in tessuto standard incubatori di cultura.</li>
	<li>Trasducono SV40-immortalato mlkl- / - MEFs con il transactivator di tetraciclina inversa controllata (rtTA)-contenente retrovirus espressa da un plasmide contenente il gene di resistenza Consciousness (nostro plasmide modificato) e trattare per 1 settimana con 5 μg/mL Consciousness per selezionare per le cellule che esprimono rtTA28.</li>
	<li>Trasducono i MEFs rtTA-esprimendo con il vettore retrovirale Dox-inducible contenente il chimerico MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selezionare utilizzando 4 con puromicina μg/mL per una settimana, 2 giorni dopo la trasduzione.</li>
</ol>2. vivere-cella microscopia Imaging di Necroptosis MLKL-mediata
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 50.000 cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto) in 24 piastre ed incubare durante la notte (Figura 2A). Utilizzare cellule vive che macchia per conta cellulare automatizzata (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Curare le cellule per 12 h con Dox (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Indurre il necroptosis con dimerizer di 25 nM FKBP (Dim) oltre 25 fluorescente verde membrana impermeabile di nM tingere (Vedi Tabella materiali) in DMEM standard (Vedi 1.2). Cellule che subiscono necroptosis si accumulano il colorante come l'integrità della membrana plasmatica è compromessa da NBB140-mediata di rottura. Effettuare saggi in triplice o quadruplice copia.</li>
	<li>Per monitorare necroptosis utilizzando sistemi di imaging single - o dual-color (Vedi Tabella materiali), posizionare i vasi nella rispettiva unità imaging ospitato in un'incubatrice di coltura di tessuti dei mammiferi.</li>
	<li>Aprire il software (Vedi Tabella materiali) e selezionare la scheda pianificazione prossime analizza sotto l'elenco delle attività. Nota: questo protocollo è per l'imaging utilizzando sistemi di colore unico, ma un software simile è disponibile per i sistemi dual-color.</li>
	<li>Nella scheda Proprietà, selezionare il cassetto", nave, tipi di scansione" e il "modello di scansione" nella scheda "Layout fisico" e "Fast fluorescenza".</li>
	<li>Aggiungere "Scan Time" cliccando sulla finestra "Temporale" e il numero totale di punti di tempo e frequenza di acquisizione (in genere 1 acquisizione ogni 0,5 h-1 h per 6 h alle 12h, o ogni 5 min per fast-cinetica necroptosis) e avviare l'acquisizione di immagini selezionando "App ly"(pulsante rosso).</li>
	<li>Quantificare la necroptosis utilizzando il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) selezionando "Riquadro attività", "Oggetto Counting nuova analisi con soglia di segmentazione fissa sopra il livello di sfondo", che può essere determinato facendo passare il cursore del mouse sulle regioni di sfondo in diverse immagini utilizzate nell'analisi.</li>
	<li>Esaminare oggetti fluorescenti selezionando anteprima utilizzando l'immagine corrente e perfezionare i livelli di soglia come necessario.</li>
	<li>Integrare i conteggi di fluorescenza verde aprendo la scheda "Launch New Analysis", scegliere il "intervallo di tempo", selezionare i pozzetti per essere analizzati, inserire il "nome di processo di analisi" e premere "OK".</li>
	<li>Accesso ha analizzato i dati dalla scheda "Analisi processi" facendo doppio clic sul nome del rispettivo lavoro ed esportazione dalla finestra grafico/esportazione per ulteriore analisi in esterno grafica software (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Quantificare i dati come fluorescenza verde positivo (+ ve) conteggi/mm2 o normalizzare i conteggi di confluenza ed esprimere i dati come fluorescenza verde + ve conteggi/confluenza.</li>
	<li>Facoltativamente, l'endpoint sperimentale, macchia cellule con 100 nM della membrana-permeante verde fluorescente tingere (Vedi Tabella materiali). Normalizzare i dati alle celle necroptotic % come il rapporto della fluorescenza fluorescenza verde/verde all'endpoint.</li>
</ol>3. vivere-cella microscopia confocale Imaging di reclutamento della membrana plasmatica e permeabilizzazione di MLKL
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto (0,5 mL/pozzetto) in un bicchiere basso camera 4 pozzetti microscopia pretrattato con 50 µ g/mL in PBS a 37 ° C per 30 min e incubare per ~ 12 h ( Figura 2B).</li>
	<li>Trattare le cellule con Dox (0,5 μg/mL) per ~ 12 h di indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Indurre necroptosis incubando con medium fresco (1 mL/pozzetto) contenente 25 nM Dim per indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica.</li>
	<li>Posizionare la camera su un microscopio confocale, costruito su un supporto invertito dotata di controllo ambientale e un 63 di scansione laser di filatura disco 1,4 obiettivo NA e cominciare imaging acquisizione utilizzando software di scelta (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Inizializzare il software, selezionare l'icona "Focus" e configurazione del filtro di YFP (eccitazione lunghezza d'onda 515 nm).</li>
	<li>Individuare il campo di vista e il piano focale e coinvolgere il sistema di manutenzione di messa a fuoco utilizzando la scheda "Precisa messa a fuoco".</li>
	<li>Per iniziare l'acquisizione, selezionare la scheda di "Acquisizione" seguita da assegnazione di configurazione del filtro, appropriato EMCCD fotocamera esposizione tempo e intensificazione guadagno e parametri di acquisizione Time-lapse compreso intervallo e la lunghezza di acquisizione.</li>
	<li>Monitorare cellulare ridistribuzione del fluorescente NBB140-2xFV-proteina Venus durante necroptosis con l'acquisizione di immagini ogni 10 s di una macchina fotografica EMCCD utilizzando un laser di 515 nm (1 film). Nota: Photobleaching è una preoccupazione con formazione immagine di proteina fluorescente. Venere è una delle proteine fluorescenti più resistente a photobleaching29. Se vengono utilizzate le proteine fluorescenti che sono più suscettibili di photobleaching, immagine ogni 30 s o più tempo per consentire il ripristino del segnale tra imaging tempo punti.</li>
	<li>Per monitorare la membrana plasmatica associazione di NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, immagine ogni 10 s il campione preparato in 3.3 di fluorescenza di riflessione interna totale microscopia (TIRF) utilizzando un microscopio equipaggiato con un cursore TIRF automatizzato e un 100 x 1.4 NA obiettivo e una telecamera EMCCD (2 film). Seguire i passaggi 3,5 – 3,7, ma regolare l'angolo TIRF all'interno della scheda di messa a fuoco TIRF secondo campione e basso spessore di vetro della camera di microscopia. Nota: i marcatori di membrana plasmatica come LCK-C-RFP possono essere utilizzati come controlli per la localizzazione di membrana plasmatica in analisi TIRF.</li>
	<li>Eseguire l'elaborazione delle immagini per migliorare la qualità di convoluzione con il negativo normalizzato secondo derivato di una funzione gaussiana (algoritmo di Marr).</li>
</ol>4. microscopia elettronica
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 5 milioni di cellule in un 150 mm rivestite con plasma cell piastra di coltura e incubare per 12 h (Figura 3).</li>
	<li>Trattare le cellule con doxiciclina (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NB1-140-2xFV-Venus per 12 h.</li>
	<li>Indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica con 25 nM di homodimerizer per 5 min. Questa volta è stabilito dalla cinetica di necroptosis osservato nell'imaging di cellule vive.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e fissare le cellule con 10 mL di soluzione 2,5% glutaraldeide, paraformaldeide di 2% in tampone 0,1 M a pH 7.4 sodio cacodilato (tampone cacodilato) preriscaldato a 37 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il campione da raschiare e girare i campioni per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Postfix il campione per 1,5 h in tetrossido di osmio ridotto 2% con ferrocianuro di potassio 1,5% in tampone cacodilato di sodio 0.1 M. Tetrossido di osmio è un agente colorante ampiamente utilizzato in TEM per fornire contrasto. Abbiamo usato TEM come analisi preliminare prima del SEM di cella in fase di necroptosis.</li>
	<li>Sciacquare il campione 5 volte in acqua ultrapura per 5 minuti ciascuno a 500 x g, seguito da risciacqui nel buffer (vedere 4.6), acqua ed etanolo su un elaboratore automatico. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Per SEM, macchia i campioni precedentemente fissati con 1% uranile acetato e piombo aspartato macchia metalli pesanti31.</li>
	<li>Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcool e propilene ossido soluzioni.</li>
	<li>Incorporare il campione in resina dura32 per ottenere un blocco di resina.</li>
	<li>Tagliare sezioni spesse di 0,5 μm per determinare la corretta area di analisi.</li>
	<li>Rivestire i campioni con un film ultra-sottile di metallo elettricamente conduttori (Iridium).</li>
	<li>Immagine e analizzare i campioni (Figura 3). Per la quantificazione, viene analizzata una basso ingrandimento immagine della superficie del blocco di resina con cellule esposte a 5 keV utilizzando un microscopio elettronico.</li>
	<li>Visualizzare le cellule attraverso singole immagini catturate da SEM o software di imaging può essere utilizzata per unire più campi di vista in una sola immagine contigua30. Circa 100 cellule possono essere utilizzate per valutare la frazione di cellule in fase di necroptosis in questo modo generando un montaggio ad alta risoluzione nel software di scelta (Vedi Tabella materiali). Nota: Segnando necrotico morfologia di SEM Confronta caratteristiche della cellula normale con la progressione dei fenotipi pre-necrotici o necrotici. Queste funzionalità includono alterazioni della membrana del plasma tra cui scomparsa microvilli, appiattimento, rotture nelle cellule che vanno da 10 nm a 1 µm in dimensione, o perdita di struttura organello attraverso almeno 30 – 40% della superficie citosolica delle cellule.</li>
</ol>5. lipid Binding di MLKL dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)
<ol><li>Preparare 15N-labeled NBB1-156 di espressione della proteina standard e purificazione come descritto in precedenza24.</li>
	<li>Sciogliere 500 µ g di sale di ammonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) e sale di ammonio di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) in 500 µ l di gelida CHCl3 ciascuno per concentrazioni finali di 1 mg/mL.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in un bagno di acqua di sonicazione per 1 min a temperatura ambiente o fino a 5 min in una miscela di acqua e ghiaccio.</li>
	<li>
Aliquotare 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in fiale di vetro pulito per singole serie di titolazione di NMR (Figura 4). Trasferimento dei lipidi in solventi organici utilizzando siringhe in vetro ermetico.
	<ol>
<li>Aliquotare 132 µ l di 1 mg/mL 18:1 PI (massa molare = 880.137 g/mol) in CHCl3 per un volume finale di risospensione di 1.200 µ l a concentrazione di 125 µM. Nota: Per tubi 5mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 1.000 µ l e NMR finale esempio volumi di > 500 µ l. Per tubi da 3 mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 300 µ l e NMR finale esempio volumi di > 150 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquotare 1 mg/mL porcine cervello L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato sale di ammonio in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cervello PI (4,5) P2) in fiale di vetro pulito.</li>
	<li>Posizionare fiale sotto un flusso gassoso di argon (Ar) o di azoto (N2) con flusso moderato per far evaporare il solvente organico senza schizzi contro le pareti del flaconcino di vetro. Cinque a trenta min è in genere sufficiente per volumi di solvente organico di 10-200 µ l.</li>
	<li>Organizzare o i flaconcini di vetro in fondo di un Büchner o beuta da vuoto con grande pinzette, sigillare con un tappo di gomma e collegare il tubo di plastica collegato a una linea di vuoto. Evacuare il pallone sotto vuoto mite durante la notte per rimuovere sostanze organiche residue.</li>
	<li>Sovrapporre le aliquote di pellicola lipidica con gas inerte, sigillare con un coperchio a chiusura ermetica e conservare a-20 ° C per l'uso entro un mese o a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Preparare il buffer del campione NMR senza detersivo (-Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O e con detergente (+ Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Aggiungere + Det buffer per flaconcino di vetro con film lipidico per ottenere la concentrazione desiderata e Sonicare a bagnomaria per fino a 30 min, alternati sonicazione per 10 min seguita da ispezione visiva. Nota: Sonicazione può riscaldare il campione. Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 15 min prima della ricostituzione del campione finale di proteine.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali di micelle lipidiche-detergente in + Det buffer mediante sonicazione di miscele 1:1 per la serie di concentrazione desiderata. A partire da concentrazione di lipidi 125 µM, tre ripetizioni produrrà 62,5 µM, 31,3 µM e dei lipidi in 0,34 mM DDM 15,6-µM.</li>
	<li>Controllo di preparare e fare riferimento a campioni di NMR di proteine e additivi in - Det e + buffer Det, rispettivamente. Aggiungi proteine e additivi per ogni diluizione del lipido in + buffer di Det. Nota: Per 15NBB N156, proteina è aggiunto ad una concentrazione finale di 40 µM e completata con 2mm deuterated dithiothreitol per mantenere residui di Cys ridotti.</li>
	<li>Trasferire il volume appropriato di campioni a 5 mm o 3 mm tubi NMR (vedere nota punto 5.4).</li>
	<li>Caricare i campioni in strumento NMR o organizzare in una piattaforma di automazione come il caricatore di SampleCase manualmente.</li>
	<li>Acquisire spettri NMR compositi utilizzando programmi di impulsi standard per spettri di 1H protone come controllo di qualità, seguita da 2D 1H -15N spettri di correlazione sia come spettroscopia di rilassamento trasversale ottimizzato (TROSY) o eteronucleari multiple quantum coerenza (SOFAST-HMQC)33. Nota: L'utilizzo di tubi da 3 mm NMR richiede 64 scansioni per 1 H -15TROSY N (~ 3 h) o 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scansione di numeri sono dimezzati per i tubi NMR di 5 mm.</li>
	<li>Elaborati 2D spettri RMN possono essere aggiunto a una CARA repository34 per analisi o altri software di scelta per l'utente.</li>
	<li>
Analisi software annotando 2D risonanze NMR per tre cime ben dispersi e risolti per ciascuno stato di proteina. Registrare le ampiezze di picco per ognuno dei sei picchi per ogni condizione di buffer contenente NBB156 (Figura 5A).
	<ol>
<li>Utilizzare CARA per preparare un elenco di batch-integrazione (intestazione fare clic sul Menu principale "spettro | Impostazione elenco Batch"...) di tutti gli spettri raccolti e analizzare utilizzando un file di assegnazione singolo picco (intestazione fare clic sul Menu principale "picchi | Importare Peaklist"... e scegliere un file definito dall'utente .peaks con 6 punte totale, 3 per ogni stato di proteina, definita all'interno).</li>
		<li>Regolare le impostazioni ("Integrator | Sintonia modello Peak"...) di larghezza X 0,06 ppm e Y-larghezza 0,30 ppm (intestazione fare clic sul Menu principale "Integrator | Sintonia modello Peak"...) prima di registrare l'output finale in due selezioni di menu (1. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "Integrator | Integrare l'elenco Batch") (2. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "picchi | Esporta tabella di integrazione") (Figura 5B). Nota: Le risonanze di ammide di spina dorsale per residui M21, V53 e L105 sono state assegnate per lo stato di chiuso-brace156 NBB. Lo stato di parentesi graffa di apertura è stato assegnato risonanze di ammide di spina dorsale dei residui G130 e A141 e la risonanza di lato-catena protone epsilon di W133 utilizzando 3D di esperimenti NMR24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalizzare i campioni per confronto diretto da diversi magneti o condizioni campione in media le tre ampiezze di parentesi graffa di apertura dei campioni di riferimento e calcolando un fattore di normalizzazione relative i due riferimenti. Calcolare le ampiezze in scala per risonanze156 NBB utilizzando il fattore di normalizzazione e ampiezze negativo impostazione a zero (tabella 2). Esempi: 1) confrontando campioni da diversi magneti: magnete una e magnete B, DDM, NBB156+ DDM, NBB156. 2) detergente confronto: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM.</li>
	<li>Calcolare per ogni risonanza la frazione in scala della chiuso-aperto-gancio o dividendo con l'intervallo di ampiezza minima al massimo di tutti gli spettri raccolti contenenti riferimenti appropriati di libero NBB156 e completamente open-brace NBB156 a detergente.</li>
	<li>Tracciare le ampiezze di NMR normalizzate in funzione della concentrazione dei lipidi e confrontare la frazione di Apri-brace NBB156 in condizioni diverse (fig. 5C). Nota: In alternativa, analisi della frazione di conformazione di parentesi graffa chiusa contro la concentrazione dei lipidi possono essere eseguita per confrontare associazione del lipido a NBB156. Noi preferiamo l'analisi precedente perché è più veloce e migliore rapporti sulla frazione completamente-impegnati dai lipidi.</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3.">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li><li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis.">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF,+RIP3,+and+MLKL.">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li><li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAI+Another+Way:+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection.">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop.">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li><li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis.">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li><li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis.">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL.">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li><li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates.">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li><li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation.">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li><li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+secrets+of+fluorescent+proteins:+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation.">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks.">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated,+selectively+[1H,13C]-labeled+proteins.">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li><li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computer+aided+resonance+assignment+tutorial.">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+(RIP3)+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+(MLKL)+interaction+in+necroptotic+signaling.">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL.">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li></ol>

Forniamo i protocolli per le tecniche che abbiamo combinato implicati MLKL come il presunto boia di membrana plasmatica rottura24. Oltre a decifrare la rete di regolamentazione che regola necroptosis MLKL-mediata, queste tecniche possono essere utilizzate in modo indipendente per caratterizzare altri sistemi biologici adatti. In pratica, queste tecniche sono strumenti di rilevamento medio-basso rendimento.
Abbiamo usato ordinariamente imaging di cellule vive di NBB...

Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia1,2,3,4,5. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita3,6. Inoltre, alcune specie non contengono geni o RIPK3 o MLKL, sostenere il ruolo non essenziali di necroptosis in animali7,8. D'altra parte, impegnativo modelli animali knockout con varie patologie indotte in laboratorio ha rivelato un importante ruolo di necroptosis nell'infiammazione, immunità innata e l'infezione virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis può essere attivato in diversi modi di segnalazione attraverso sensori differenti immunità innata, tutti che provocano l'attivazione di RIPK31,13,14. RIPK3 attivo a sua volta fosforila e attiva MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Il più studiato e forse il modo più complesso, che portano all'attivazione di RIPK3 coinvolge morte recettore legatura, che si biforca sulla base della composizione a valle dei complessi segnalazione sia indurre apoptosi o necroptosis1. Necroptosis consegue quando segnalazione attraverso RIPK1 è favorita e si traduce in impegno di RIPK319,20. Questo risultato è facilmente favorito su inibizione farmacologica o delezione genetica della caspasi 8, un inibitore endogeno putativo di necroptosis che tiene a bada il necroptosis. RIPK1 lega a ed attiva RIPK3. Un altro modo per attivare necroptosis è attraverso recettori Toll-like TLR3/TLR4 segnalazione, che coinvolge e attiva il RIPK3 TIR-dominio-contenente adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF)21. Un altro modo per morire di necroptosis è di attivazione del sensore del DNA DAI, che direttamente si impegna e si attiva RIPK322.
MLKL è una proteina citosolica composta da un N-terminale dell'elica bundle (NB) e un dominio di pseudochinasi C-terminale (psKD) collegati da una parentesi graffa regolamentazione regione3. In cellule normali, MLKL si trova nel citosol dove si pensa di essere in un complesso inattivo con RIPK314. Attivazione di necroptosis innesca fosforilazione di RIPK3 di MLKL nel ciclo di attivazione della psKD e potenzialmente altri siti nel NB e parentesi graffa3,15,23. La fosforilazione induce un cambio conformazionale in MLKL che si traduce in dissociazione dal RIPK314. Capito male cambiamenti conformazionali rilasciare il tutore dal psKD24. L'ortesi, che contiene 2 eliche, media oligomerizzazione di MLKL in un trimero putativo attraverso il C-terminale dell'elica25. L'elica del N-terminale della ginocchiera inibisce il dominio NB, che è essenziale per la permeabilizzazione della membrana24,26. In isolamento, NB dominio è sufficiente per indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e necroptosis16,24,27. L'attività di pro-necroptotic NB è stato ricostituito in fibroblasti embrionali del mouse carenti in MLKL (mlkl- / - MEFs). NB è un dominio di legame del lipido che coinvolge preferenzialmente il difosfato di fosfatidilinositolo 4,5 del fosfolipide (PIP2). Abbiamo proposto un meccanismo graduale dell'attivazione di MLKL, in cui parentesi graffa oligomerizzazione facilita il reclutamento di MLKL alla membrana del plasma tramite interazioni deboli di NB con il gruppo di testa polare di2 PIP24. La membrana, il NB subisce regolamentato l'esposizione di un sito di associazione aggiuntive di alto-affinità per PIP2, che è mascherato dal tutore in MLKL inattivo. Nel complesso, le interazioni multiple di NB con PIP2 destabilizzano la membrana plasmatica che porta alla sua rottura, anche se il meccanismo molecolare di questi eventi non sono stati delucidati.
Qui illustriamo metodi specifici utilizzati per caratterizzare la funzione di MLKL come boia di necroptosis24. In particolare, ci concentriamo sul dominio più minimo del MLKL, NB e brace (NBB), che è regolata tramite inibizione di parentesi graffa e può essere attivato attraverso la dimerizzazione forzata per indurre la necroptosis e la rottura della membrana del plasma. Descriviamo il nostro sistema di espressione inducibile combinato con forzata dimerizzazione di FKBP-mediata indotta dai farmaci per l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica delle cellule che subiscono necroptosis. Inoltre, vi illustriamo la nostra analisi in vitro NMR delle interazioni della NBB con phosphatidylinositols (PIPs).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1175px;" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:429px;">Cloning and cell line generation</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRetroX-TRE3G</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tet-On transactivator plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Llambi et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dillon et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell death quantification and live-cell microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631311 CAS# 24390-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B/B Homodimerizer AP20187</td>
			<td>Takara</td>
			<td>635059 CAS# 195514-80-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto16</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15N Ammonium Chloride</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterated DTT</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2622-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 CAS# 69227-93-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X CAS# 383907-42-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850143 CAS# 849412-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850149 CAS# 799268-53-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specialized Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte FLR or ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios NanoLab 660 DualBeam&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Electron microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td>http://www.essenbioscience.com</td>
			<td style="width:193px;">Imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI MAPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>https://www.fei.com/software/maps/</td>
			<td style="width:193px;">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TopSpin v3.2</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>http://www.bruker.com</td>
			<td style="width:193px;">NMR data collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CARA v1.9.1.7</td>
			<td></td>
			<td>http://cara.nmr.ch/&#160;</td>
			<td style="width:193px;">NMR data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:429px;">Slidebook</td>
			<td style="width:229px;">3i (Intelligent Imaging Innovations)</td>
			<td style="width:323px;">https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td>
			<td style="width:193px;">Confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis

Necroptosis è una via di morte programmata delle cellule innescata dall'attivazione del recettore interacting protein chinasi 3 (RIPK3), che fosforila e attiva la pseudochinasi dominio chinasi-come stirpe misto, MLKL, rottura o permeabilize la membrana plasmatica . Necroptosis è un percorso infiammatorio associato con patologie multiple, tra cui il cancro, le malattie infettive e cardiovascolari, ictus, neurodegenerazione e autoimmunità. Qui, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per caratterizzare il MLKL come il boia di rottura della membrana del plasma in necroptosis. Visualizziamo il processo di necroptosis in cellule usando la formazione immagine della vivere-cella con microscopia di fluorescenza confocale e convenzionale e in cellule fissate mediante microscopia elettronica, che insieme hanno rivelato la ridistribuzione dei MLKL dal cytosol al plasma membrana prima di induzione di grandi fori nella membrana plasmatica. Vi presentiamo in vitro analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) utilizzando i lipidi per identificare putativi modulatori di necroptosis MLKL-mediata. Basato su questo metodo, abbiamo identificato quantitativa del lipido-associazione preferenze e fosfatidil-inositolo fosfato (PIPs) come leganti critici di MLKL che sono necessari per il targeting di membrana plasmatica e permeabilizzazione in necroptosis.

Visualizzare l'esecuzione di necroptosis regolamentati in cellule vive è stato possibile attraverso l'espressione inducibile di un costrutto MLKL troncato minimal, NBB140-2xFV-Venus. Questo costrutto mantiene la capacità di indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e viene attivato tramite oligomerizzazione Dim-indotta della cassetta FKBP (2xFV). Osserviamo e quantificare necroptosis da microscopia di cellule vive di imaging, monitoraggio cineticamente (ogni 5 m...

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Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  St. Jude Children's Research Hospital. Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Video: Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caratterizzazione funzionale di Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...