Estensione della durata della vita dei neutrofili con CLON-G e un saggio di morte spontanea in vitro

Il nostro protocollo fornisce un mezzo cocktail per prolungare la durata della vita dei neutrofili a più di cinque giorni senza compromettere le funzioni dei neutrofili. Offre anche una dialisi in vitro affidabile per i neutrofili. Il trattamento con CLON-G espande le possibilità di conservazione, trasporto e manipolazione genica dei neutrofili, che possono accelerare la ricerca nella comunità dei neutrofili.

Per iniziare, preparare il supporto di base aggiungendo RPMI 1640 FBS e pen-strep a un tubo da 50 millilitri. Contemporaneamente, scongelare tutte le soluzioni stock dei componenti CLON-G su ghiaccio. Quindi diluire HSP 70 e 200 microgrammi per millilitro di G-CSF nel mezzo di base.

Trasferire 976 microlitri di terreno di base in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. A questo, aggiungere i componenti CLON-G per preparare un millilitro di mezzo 2x CLON-G come descritto nel manoscritto. Quindi, preparare la coltura di neutrofili sospendendo i neutrofili di topo isolati nel mezzo di base.

Aggiungere il mezzo CLON-G, seguito dal terreno di base a 24 piastre ben coltivate non tissutali. Quindi aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare preparata e pipettare delicatamente tre o quattro volte. Incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Colorare i neutrofili coltivati con cytospin e analizzarli usando un microscopio ottico. Per l'analisi della citometria a flusso, aggiungere un millilitro di mezzo cellulare alla coltura di cellule neutrofile coltivata durante la notte. Mescolare il terreno di coltura cellulare pipettandolo delicatamente da cinque a sette volte e trasferire 100 microlitri di questa miscela in un tubo di citometria a flusso nei punti temporali desiderati.

Contemporaneamente, vortice le perle di conteggio e pipettare 10 microlitri di soluzione di perline allo stesso tubo citometrico a flusso contenente mezzo cellulare. Aggiungere 10 microlitri di una miscela colorante pre-preparata a questo tubo di citometria a flusso e incubare per cinque minuti in frigorifero al buio. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione salina al tubo e mescolare bene per una distribuzione uniforme delle perle e delle celle di conteggio.

Infine, eseguire l'analisi di citometria a flusso della sospensione cellulare come descritto nel manoscritto testuale. Per il test di immagini fluorescenti, aggiungere due millilitri di sospensione cellulare per piastra confocale e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Nel frattempo, sciogliere un grammo di cloruro di calcio in 45 millilitri di soluzione salina e filtrarlo con un'unità filtrante da 0,2 micrometri.

Rimuovere delicatamente la piastra confocale nel punto temporale richiesto. Colorare le cellule con 10 microlitri di FITC-Annexin-V, PI e cloruro di calcio per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale, catturare le immagini utilizzando i canali desiderati.

Nel presente studio, la morfologia dei neutrofili non è stata influenzata nel mezzo CLON-G anche dopo cinque giorni. Inoltre, i fenotipi fax hanno dimostrato cellule intatte dopo il trattamento. L'analisi di citometria a flusso ha mostrato una popolazione positiva di neutrofili non trattati nell'annessina-V e la perdita di popolazione potrebbe essere dovuta all'acido etilendiamminotetraacetico nel mezzo cellulare.

Tuttavia, la vitalità dei neutrofili trattati con CLON-G a 24 ore era approssimativamente superiore al 90%I test di immagini fluorescenti hanno anche confermato la vitalità cellulare dei neutrofili trattati con CLON-G. I neutrofili coltivati nel terreno di base per 24 ore hanno mostrato cellule gonfie e la perdita di queste cellule potrebbe essere il risultato dello scuotimento o del pipettaggio della piastra confocale. Le concentrazioni e gli effetti dei composti CLON-G possono avere un impatto significativo sui test dei neutrofili.

Se possibile, evitare di modularli. Le indagini sui neutrofili sono laboriose, costose ed estremamente limitate nell'applicazione clinica a causa della loro breve durata di vita. Questo metodo supera parzialmente questi ostacoli.