Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come dove le cellule staminali del follicolo dentale umano potrebbero essere geneticamente progettate per migliorare le loro proprietà terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule staminali possono essere modificate con l'introduzione di microRNA senza il rischio di un'integrazione stabile del genoma. Iniziare la procedura per la digestione enzimatica dei due follicoli, prerifabbturando a temperatura ambiente, le cellule staminali del follicolo dentale umano o il mezzo di coltura hDFSC e la soluzione PBSPSG.
Scongelare un'aliquota ciascuna delle soluzioni stock collagenasi di tipo I e Dispasi II. Preparare una soluzione di digestione aggiungendo 500 microlitri della soluzione stock di collagenasi di tipo I e 500 microlitri della soluzione stock di Dispasi II a 4 millilitri di Basal Medium contenenti 1%di agente antibiotico. Per evitare la contaminazione del sito durante l'isolamento delle cellule staminali dentali umane, i tamponi di lavaggio e i mezzi di coltura utilizzati devono contenere agenti antibiotici.
Posizionare un follicolo dentale estratto in una piastra di Petri sterile. Aggiungere 10 millilitri di soluzione PBSPSG per lavare il tessuto estratto. Aspirare e scartare la soluzione e aggiungere una fresca soluzione PBSPSG per ripetere il lavaggio.
Usando un bisturi sterile tritare il follicolo estratto in pezzi se circa 1 per 1 millimetro. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione PBSPSG dalla piastra di Petri in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri, lavare la piastra di Petri con 10 millilitri di soluzione PBSPSG e trasferire la soluzione nello stesso tubo. Centrifugare il tubo conico a 353 x g a temperatura ambiente per dieci minuti.
Aggiungere 5 millilitri di soluzione di digestione al tessuto pallettizzato, mescolare delicatamente la soluzione e il tessuto, incubare la miscela a 37 gradi celsius e 5%CO2 in un'incubatrice di scuotimento per due ore. Dopo due ore, centrifugare la sospensione di cellule e tessuti digerita a 353 g per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pallet ottenuto in 6 millilitri di mezzo di coltura HDFSC.
Seedare la sospensione cellulare in un pallone da coltura cellulare di 25 centimetri quadrati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo la raccolta cellulare e la caratterizzazione dell'HDFSC è come descritto nel protocollo di testo, i hDFSC di semi in una piastra di coltura cellulare da 24 po '. Incubare a 37 gradi celsius, 5%CO2 e 20%Ossigeno per 24 ore.
Il giorno seguente diluire 40 picomoli di microRNA in 66,7 microlitri di mezzo siero ridotto e vortice la soluzione. Diluire 0,67 microlitri a base di lipidi cationici, reagente di trasfezione in 66,7 microlitri di mezzo sierico ridotto, vortice la soluzione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti aggiungere il microRNA predilutato al reagente di trasfezione prediluto, mescolare la soluzione e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.
Quindi, aggiungere le complessità di trasfezione preparate, dropwise, direttamente al mezzo di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente dondolando la piastra di coltura cellulare di 24 pozzi avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore.
24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante di campioni nei rispettivi tubi di centrifuga conica da 15 millilitri. Lavare le celle con 1 millilitro di PBS e trasferire il PBS nel rispettivo tubo di centrifuga. Aggiungere 500 microlitri di gocciolamenti ed EDTA alle cellule e incubare la piastra del pozzo 24 a 37 gradi celsius, per 3 minuti.
Interrompere la tripsininazione aggiungendo 1 millilitro di mezzo di coltura cellulare per le cellule e trasferendo la soluzione nel rispettivo tubo di centrifuga. Centrifugare le cellule a 300 x g e 4 gradi Celsius per dieci minuti. Da qui in poi tenere le cellule e i reagenti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.
Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in 100 microlitri di tampone di colorazione e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri di colorante reattivo all'ammina a ciascun campione per distinguere tra cellule vive e morte. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare a 4 gradi celsius per dieci minuti.
Aggiungere 1 millilitro di PBS alle cellule e centrifugare a 300 g e 4 gradi celsius per dieci minuti Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS, aggiungere 33 microlitri di paraformaldeide e mescolare le soluzioni, conservare i campioni a 4 gradi celsius protetti dalla luce fino alle misurazioni citometriche del flusso. Trasferire i campioni in tubi adatti alle misurazioni citometriche del flusso ed eseguire la citometria del flusso utilizzando la strategia di gating descritta nel protocollo di testo. Le cellule staminali del follicolo dentale umano isolato mostravano tutte le caratteristiche descritte per la definizione di cellule stromali mesenchimali, le cellule erano aderenti alla plastica e mostravano una morfologia simile alla fibra di vetro, in condizioni di coltura standard.
L'analisi citometrica del flusso ha rivelato che gli hDFSC esprimerono un pannello di alcuni antigeni di superficie, tra cui CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Mentre CD45 e CD117 erano assenti. I potenziali di differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica delle cellule in specifiche condizioni di coltura in vitro sono stati confermati dall'immunostaining, una proteina legante gli acidi grassi per:Osteocalcina e Aggrecan.
La strategia di gating utilizzata per la quantificazione della citotossicità e dell'efficienza di assorbimento del microRNA etichettato Cy3 24 ore dopo la trasfezione, ha confermato l'assorbimento di microRNA nel 100% delle cellule vitali. Quantità comparabili di cellule morte in campioni trasfettati e non trasfettati indicano che il microRNA viene introdotto in modo efficiente senza effetti citotossici. Seguendo questa procedura, altri metodi come la transdifferenziazione possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la plasticità di Cytolab.
