Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como donde las células madre de un folículo dental humano podrían ser genéticamente diseñadas para mejorar sus propiedades terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre pueden ser modificadas por la introducción del microRNA sin el peligro de una integración del genoma estable. Comience el procedimiento para la digestión enzimática de los dos folículos, precalentándolo a temperatura ambiente, células madre del folículo dental humano o medio de cultivo hDFSC y solución PBSPSG.
Descongelar una alícuota cada una de las soluciones de stock de Colágenonase tipo I y Dispase II. Preparar una solución de digestión añadiendo 500 microlitros de la solución de stock de colagenasa tipo I y 500 microlitros de la solución de stock Dispase II a 4 mililitros de basal Medium que contienen un 1% de agente antibiótico. Para evitar la contaminación del sitio durante el folículo dental humano, los tampones de lavado de células madre y los medios de cultivo utilizados deben contener agentes antibiótico.
Coloque un folículo dental extraído en un plato estéril de Petri. Añadir 10 mililitros de solución de PBSPSG para lavar el tejido extraído. Aspirar y desechar la solución y añadir la solución PBSPSG fresca para repetir el lavado.
Usando un escalón estéril picar el folículo extraído en pedazos si aproximadamente 1 por 1 milímetros. Transfiera el tejido picado y la solución PBSPSG de la placa Petri a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, lave el plato Petri con 10 mililitros de solución PBSPSG y transfiera la solución al mismo tubo. Centrifugar el tubo cónico a 353 x g a temperatura ambiente durante diez minutos.
Añadir 5 mililitros de solución digestiva al tejido paletizado, mezclar suavemente la solución y el tejido, incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 5%CO2 en una incubadora de agitación durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar la suspensión digerida de la célula y el tejido a 353 g durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet obtenido en 6 mililitros de medio de cultivo HDFSC.
Siembra la suspensión celular en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados, e incuba las células a 37 grados centígrados. Después de la recolección celular y la caracterización de HDFSC es como se describe en el protocolo de texto, hDFSC semilla en una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 y 20%Oxígeno durante 24 horas.
Al día siguiente diluye 40 picomoles de microARN en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, y vórtice la solución. Diluir 0,67 microlitros de reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, vórtice la solución e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos añadir el microARN prediluido al reactivo de transfección prediluminado, mezclar la solución e incubar a temperatura ambiente durante quince minutos.
A continuación, agregue las complejidades de la transfección preparadas, por gota, directamente al medio de cultivo en las células. Mezcle suavemente balanceando la placa de cultivo celular de 24 pozos de ida y vuelta. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas.
24 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante de muestras en los respectivos tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros. Lavar las células con 1 mililitro de PBS y transferir el PBS al tubo centrífugo respectivo. Añadir 500 microlitros de goteos y EDTA a las células, e incubar la placa de 24 pozos a 37 grados centígrados, durante 3 minutos.
Detenga la tripsinación añadiendo 1 mililitro de medio de cultivo celular para las células y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga respectivo. Centrifugar las células a 300 x g y 4 grados centígrados durante diez minutos. A partir de ahora, mantenga las células y los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.
Deseche el sobrenadante, resuspendir las células en 100 microlitros de tampón de tinción y transferir la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 0,5 mililitros de tinte reactivo de amina a cada muestra para distinguir entre células vivas y muertas. Mezclar suavemente la solución e incubar a 4 grados centígrados durante diez minutos.
Añadir 1 mililitro de PBS a las células, y centrífuga a 300 g y 4 grados celsius durante diez minutos Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de PBS, agregue 33 microlitros de paraformaldehído, y mezcle las soluciones, almacene las muestras a 4 grados centígrados protegidos de la luz hasta la medición citométrica de flujo. Transfiera las muestras a tubos adecuados para mediciones citométricas de flujo y realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición descrita en el protocolo de texto. Las células madre aisladas del folículo dental humano mostraron todas las características descritas para la definición de células estromales mesenquimales, las células eran de plástico adherente y mostraban una fibra de vidrio como morfología, en condiciones de cultivo estándar.
El análisis citométrico de flujo reveló que los hDFSC expresaban un panel de ciertos antígenos superficiales, incluidos CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105. Mientras que CD45 y CD117 estaban ausentes. Los potenciales de diferenciación adipogénico, osteogénico y condrógeno de las células bajo condiciones específicas de cultivo in Vitro se confirmaron mediante inmunosu mancha, una proteína de unión a ácidos grasos para:Osteocalcin y Aggrecan.
La estrategia de medición utilizada para la cuantificación de la citotoxicidad y la eficiencia de absorción de microARNes etiquetada Cy3 24 horas después de la transfección, confirmó la absorción de microARN en el 100% de las células viables. Cantidades comparables de células muertas en muestras transinfectosas y no transinfectados indican que el microARN se introduce eficientemente sin efectos citotóxicos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transdiferenciación para responder a preguntas adicionales como plasticidad de Cytolab.
