이 방법은 인간 치과 여포 줄기 세포가 그들의 치료 특성을 향상하기 위하여 유전으로 설계될 수 있던 것과 같은 재생 의학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 줄기 세포가 안정적인 게놈 통합의 위험없이 microRNA 도입에 의해 변형 될 수 있다는 것입니다. 실온, 인간 치과 여포 줄기 세포 또는 hDFSC 배양 배지 및 PBSPSG 용액으로 미리 온난화하여 두 여포의 효소 소화 절차를 시작합니다.
콜라게나아제 타입 I및 디스파세 II 주식 솔루션의 각 알리쿼트 1개를 해동하십시오. 콜라게나아제 타입 I 스톡 솔루션 500마이크로리터와 디스파제 II 스톡 솔루션 500개소리터를 1%항생제제를 함유한 기저형 4밀리리터에 첨가하여 소화용액을 준비한다. 인간 치과 여포 줄기 세포 격리 세척 버퍼 및 사용 된 배양 매체 동안 사이트 오염을 피하기 위해 항생제를 포함 해야합니다.
추출된 치아 여포를 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 추출 된 조직을 세척하는 PBSPSG 용액의 10 밀리리터를 추가합니다. 용액을 흡기하고 폐기하고 신선한 PBSPSG 용액을 추가하여 세척을 반복합니다.
멸균 메스를 사용하여 추출된 여포를 조각으로 약 1 x 1 밀리미터로 다진다. 페트리 접시에서 다진 조직 및 PBSPSG 용액을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 페트리 접시를 PBSPSG 용액 10밀리리터로 세척하고, 용액을 동일한 튜브로 옮킨다. 원심 분리는 10 분 동안 실온에서 353 x g에서 원심 튜브를 분리합니다.
팔레트 조직에 5 밀리리터의 소화 용액을 넣고 용액과 조직을 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 섭씨 37도, 흔들리는 인큐베이터에 5%CO2로 2시간 동안 배양합니다. 2 시간 후, 원심 분리는 실온에서 10 분 동안 353 g에서 소화 된 세포 및 조직 현탁액을 분리합니다. 상체를 폐기하고 HDFSC 배양 배지의 6 밀리리터에서 획득한 팔레트를 다시 중단합니다.
25 평방 센티미터 세포 배양 플라스크에서 세포 현탁액을 시드하고 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. HDFSC의 세포 수확 및 특성화 후 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이, 종자 hDFSC는 24웰 세포 배양 판에서 한다. 섭씨 37도, CO2 5%, 산소 20%로 24시간 동안 배양합니다.
다음 날에는 66.7 마이크로리터의 미생물RNA 40피코몰을 희석시키고 용액을 소용돌이시다. 0.67 마이크로리터의 양이온지질계, 경질 시약은 66.7 마이크로리터의 감소된 혈청 배지, 용액을 소용돌이치며 실온에서 5분간 배양한다. 5분 후 미리 희석된 microRNA를 미리 희석된 형질 전환 시약에 넣고, 용액을 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양한다.
다음으로, 준비된 경피 복잡성을 세포상배양배지에 직접 드롭와이즈로 추가한다. 앞뒤로 24 잘 세포 배양 판을 흔들어 부드럽게 섞는다. 24 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오.
24 시간 경질 후, 각각15 밀리리터 원심 분리 튜브에서 샘플의 상퍼를 수집합니다. PBS의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 PBS를 각각의 원심분리기 튜브로 이송합니다. 500 마이크로리터의 드립과 EDTA를 세포에 추가하고 24개의 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 3분간 배양합니다.
세포배양 배지의 1 밀리리터를 추가하고 용액을 각각의 원심분리기 튜브로 이송하여 트립시화를 중단한다. 세포를 300 x g및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 여기서부터 는 달리 명시되지 않는 한 세포와 시약을 얼음에 보관하십시오.
상체를 버리고, 염색 버퍼의 100 마이크로리터에서 세포를 재일시 중단하고, 세포 용액을 1.5 밀리리터 미세원심분리기로 옮기다. 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 각 샘플에 amine 반응성 염료의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 용액을 부드럽게 섞고 섭씨 4도에서 10분간 배양합니다.
세포에 PBS 1 밀리리터를 추가하고, 10분 동안 300g및 섭씨 4도에서 원심분리기를 슈퍼나티를 버리고 PBS의 100 마이크로리터에서 세포를 재연하고, 파라포름데히드의 33마이크로리터를 추가하고, 용액을 혼합하여, 시토메트릭 측정까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 시료를 유동 세포 측정에 적합한 튜브로 옮기고 텍스트 프로토콜에 설명된 게이팅 전략을 사용하여 유동 세포측정을 수행한다. 고립 된 인간 치과 여포 줄기 세포는 중간 엽 기질 세포의 정의에 대해 설명 된 모든 특성을 보여주었으며, 세포는 플라스틱 부착되어 표준 배양 조건하에서 형태와 같은 유리 섬유를 표시했다.
유동 세포 측정 분석은 hDFSCs가 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105를 포함한 특정 표면 항원 패널을 발현한 것으로 나타났습니다. CD45 및 CD117이 없는 동안. 특이적 생체외 배양 조건 하에서 세포의 비증, 골다겐성 및 연골 분화 잠재력은 면역스테인링, 지방산 결합 단백질: Osteocalcin 및 Aggrecan에 대한 것으로 확인되었다.
세포 독성 및 Cy3 라벨 microRNA 섭취 효율 24 시간 트랜스페션 후, 실행 가능한 세포의 100%에서 microRNA 섭취를 확인 의 정량화에 사용 된 게이팅 전략. 유사하게 감염된 시료와 비감염된 시료에 있는 죽은 세포의 비교양은 microRNA가 세포독성 효력 없이 능원하게 소개된다는 것을 표시합니다. 이 절차에 따라 Cytolab 가소성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 과분과 같은 다른 방법을 수행 할 수 있습니다.
