Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da Medicina Regenerativa, como onde células-tronco de folículos dentários humanos poderiam ser geneticamente modificadas para melhorar suas propriedades terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que as células-tronco podem ser modificadas pela introdução de microRNA sem o risco de integração estável do genoma. Inicie o procedimento para digestão enzimática dos dois folículos, pré-aquecimento à temperatura ambiente, célula-tronco folículo dentário humano ou solução de cultura hDFSC e solução PBSPSG.
Descongele uma alíquota cada uma das soluções de estoque Tipo I e Dispase II. Prepare uma solução de digestão adicionando 500 microliters da solução de estoque tipo I de Collagenase e 500 microliters da solução de estoque Dispase II a 4 mililitros de Basal Medium contendo 1% de agente antibiótico. Para evitar a contaminação do local durante o isolamento de células-tronco de torção de folículos dentários humanos e os meios de cultura utilizados devem conter agentes antibióticos.
Coloque um folículo de dente extraído em uma placa de Petri estéril. Adicione 10 mililitros de solução PBSPSG para lavar o tecido extraído. Aspire e descarte a solução e adicione uma solução PBSPSG fresca para repetir a lavagem.
Usando um bisturi estéril, pique o folículo extraído em pedaços se cerca de 1 por 1 milímetro. Transfira o tecido picado e a solução PBSPSG da placa de Petri em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros, lave a placa de Petri com 10 mililitros de solução PBSPSG e transfira a solução para o mesmo tubo. Centrifugar o tubo cônico a 353 x g em temperatura ambiente por dez minutos.
Adicione 5 mililitros de solução de digestão ao tecido palleted, misture suavemente a solução e o tecido, incubar a mistura a 37 graus celsius e 5% de CO2 em uma incubadora de agitação por duas horas. Após duas horas, centrifufique a suspensão de células e tecidos digeridos a 353 g por dez minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e suspenda a palete obtida em 6 mililitros de meio de cultura HDFSC.
Semear a suspensão celular em um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados, e incubar as células a 37 graus celsius. Após a colheita celular e a caracterização do HDFSC é como descrito no protocolo de texto, as sementes hDFSCs em uma placa de cultura celular de 24 poços. Incubar a 37 graus celsius, 5%DE CO2 e 20% oxigênio por 24 horas.
No dia seguinte dilui 40 picomoles de microRNA em 66,7 microliters de meio soro reduzido, e vórtice da solução. Diluir 0,67 microliters à base lipídica, reagente de transfecção em 66,7 microliters de meio soro reduzido, vórtice da solução e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos adicione o microRNA pré-ludo ao reagente de transfecção pré-diluído, misture a solução e incubar à temperatura ambiente por quinze minutos.
Em seguida, adicione as complexidades de transfecção preparadas, dropwise, diretamente ao meio de cultura nas células. Misture suavemente balançando a placa de cultura celular 24 bem para frente e para trás. Incubar as células a 37 graus celsius por 24 horas.
24 horas após a transfecção, colecione o sobrenatário de amostras em seus respectivos tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros. Lave as células com 1 mililitro de PBS e transfira o PBS para o respectivo tubo de centrífuga. Adicione 500 microliters de gotejamentos e EDTA às células, e incubar a placa de 24 poços a 37 graus celsius, por 3 minutos.
Pare a trippsinização adicionando 1 mililitro de meio de cultura celular para as células e transferindo a solução para o respectivo tubo de centrífuga. Centrifugar as células a 300 x g e 4 graus celsius por dez minutos. A partir de agora mantenha as células e reagentes no gelo, a menos que seja dito o contrário.
Descarte o supernascer, resuspenja as células em 100 microliters de tampão de coloração, e transfira a solução celular para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro. Adicione 0,5 mililitros de corante reativo de amina a cada amostra, a fim de distinguir entre células vivas e mortas. Misture suavemente a solução e incubar a 4 graus celsius por dez minutos.
Adicione 1 mililitro de PBS às células, e centrífuga a 300g e 4 graus celsius por dez minutos Descarte o supernatante e resuspenque as células em 100 microliters de PBS, adicione 33 microliters de paraformaldeído, e misture as soluções, armazene as amostras a 4 graus celsius protegidos da luz até as medições citométricas de fluxo. Transfira as amostras para tubos adequados para medições citométricas de fluxo e realize a citometria de fluxo usando a estratégia de gating descrita no protocolo de texto. As células-tronco do folículo dentário humano isolado mostraram todas as características descritas para a definição de células estromais mesenquimais, as células eram aderentes ao plástico e exibiam uma fibra de vidro como a morfologia, em condições de cultura padrão.
A análise citométrica de fluxo revelou que os hDFSCs expressaram um painel de certos antígenos de superfície, incluindo CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Enquanto CD45 e CD117 estavam ausentes. Os potenciais adipogênicos, osteogênicos e condrogênicos de diferenciação de células sob condições específicas de cultura In Vitro foram confirmados por imunostaining, uma proteína de ligação de ácido graxo para:Osteocalcina e Aggrecan.
A estratégia de gating utilizada para a quantificação da citotoxicidade e da eficiência de absorção de microRNA rotulada cy3 24 horas após a transfecção, confirmou a absorção de microRNA em 100% das células viáveis. Quantidades comparáveis de células mortas em amostras transfecidas e não transtraísicas indicam que o microRNA é introduzido eficientemente sem efeitos citotóxicos. Após esse procedimento, outros métodos como a transdiferenciação podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como a plasticidade cytolab.
