Bu yöntem Rejeneratif Tıp alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bir insan diş folikül kök hücreleri genetik olarak tedavi özelliklerini geliştirmek için tasarlanmış olabilir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kök hücrelerin kararlı genom entegrasyonu tehlikesi olmadan mikroRNA girişi ile modifiye edilebilmektedir. Oda sıcaklığına, insan diş folikülü kök hücresine veya hDFSC kültür ortamına ve PBSPSG çözeltisine önceden ısıtılarak iki folikülün enzimatik sindirim prosedürüne başlayın.
Çözülme bir aliquot her Kollajenaz tip I ve Dispase II stok çözümleri. Kollajenaz tip I stok çözeltisi 500 mikrolitre ve% 1 antibiyotik ajan içeren Bazal Medium 4 mililitre Dispase II stok çözeltisi 500 mikrolitre ekleyerek bir sindirim çözümü hazırlayın. İnsan diş folikülü kök hücre izolasyonu sırasında site kontaminasyonunu önlemek için yıkama tamponları ve kullanılan kültür ortamı antibiyotik ajanlar içermelidir.
Steril petri kabına çıkarılmış bir diş folikülü yerleştirin. Çıkarılan dokuyu yıkamak için 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ekleyin. Aspirat ve çözelti atın ve yıkama tekrarlamak için taze PBSPSG çözeltisi ekleyin.
Steril bir neşter kıyma kullanarak parçalarhalinde çıkarılan folikül eğer 1 ile 1 milimetre. Kıyma lı dokuyu ve PBSPSG çözeltisini Petri kabından 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın, Petri kabını 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ile yıkayın ve çözeltiyi aynı tüpe aktarın. Konik tüpü oda sıcaklığında 353 x g'de on dakika santrifüj edin.
Paletli dokuya 5 mililitre sindirim çözeltisi ekleyin, çözeltiyi ve dokuyu hafifçe karıştırın, karışımı 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de iki saat boyunca sallayarak kuvözde kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, oda sıcaklığında on dakika boyunca 353 g sindirilmiş hücre ve doku süspansiyon santrifüj. Supernatant atın ve HDFSC kültür orta 6 mililitre elde edilen palet yeniden askıya.
Hücre süspansiyonuna 25 santimetre karelik bir hücre kültür şişesinde tohum atve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücre hasadı ve HDFSC karakterizasyonu metin protokolünde açıklandığı gibi sonra, 24 iyi hücre kültür plakası tohum hDFSCs. 24 saat boyunca 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %20 Oksijen ile kuluçkaya yat.
Ertesi gün azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre mikroRNA mikroRNA 40 pikomol seyreltmek ve çözelti girdap. Katyonik lipid bazlı 0,67 mikrolitre seyreltin, azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre transfeksiyon reaktif, çözelti girdap, ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Beş dakika sonra önceden seyreltilmiş mikroRNA önceden seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin, çözelti karıştırın ve on beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Daha sonra, hazırlanan transfeksiyon karmaşıklıkları, dropwise, doğrudan hücreler üzerinde kültür ortamı ekleyin. 24 iyi hücre kültürü plakasını ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Transfeksiyondan 24 saat sonra, 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde numunelerin süpernatantını toplayın. Hücreleri 1 mililitre PBS ile yıkayın ve PBS'yi ilgili santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelere 500 mikrolitre damla ve EDTA ekleyin ve 24 kuyu plakasını 3 7 santigrat derecede 3 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreler için hücre kültürü ortamı 1 mililitre ekleyerek ve ilgili santrifüj tüpü içine çözüm aktararak tripsinizasyon durdurun. Hücreleri 300 x g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Aksi belirtilmedikçe hücreleri ve reaktifleri buzüzerinde tutun.
Supernatant atın, boyama tampon 100 mikrolitre hücreleri resuspend, ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp hücre çözeltisi aktarın. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için her örneğe 0,5 mililitre amin reaktif boya ekleyin. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.
Hücrelere 1 mililitre PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 300g ve 4 santigrat derecede santrifüj atın Süpernatant'ı atın ve pbs'nin 100 mikrolitresi ndeki hücreleri yeniden askıya alın, 33 mikrolitre paraformaldehit ekleyin ve çözümleri karıştırın, numuneleri akış sitometrik ölçümlerine kadar ışıktan korunan 4 derece santigrat derecede saklayın. Örnekleri akış sitometrik ölçümleri için uygun tüplere aktarın ve metin protokolünde açıklanan gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi gerçekleştirin. İzole insan diş folikül kök hücreleri mezenkimal stromal hücrelerin tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi, hücreler plastik yapışık ve morfolojisi gibi bir fiberglas görüntülenen, standart kültür koşulları altında.
Akış sitometrik analizi, hDFSC'lerin CD29, CD44, CD73, CD90 ve CD105 gibi belirli yüzey antijenlerinden oluşan bir paneli ifade ettiğini ortaya çıkardı. CD45 ve CD117 yokiken. Belirli In Vitro kültür koşulları altında hücrelerin adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma potansiyelleri immünboyama ile doğrulandı, için bir yağ asidi bağlayıcı protein:Osteokalsin, ve Aggrecan.
Sitotoksisite ve Cy3'ün sayısallaştırılması için kullanılan gating stratejisi, transfeksiyon sonrası 24 saat mikroRNA alım verimliliğini etiketledi, canlı hücrelerin %100'ünde mikroRNA alımını doğruladı. Transfektasyonlu ve transfektasyonsuz örneklerdeki ölü hücrelerin karşılaştırılabilir miktarları mikroRNA'nın sitotoksik etkiler olmadan verimli bir şekilde sunulduğuna işaret eder. Bu prosedürü takiben Cytolab plastisite gibi ek soruları cevaplamak için transdifferentiation gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.
